El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos
Summary
Demostramos un protocolo para generar embriones quiméricos de pez cebra para vivir el comportamiento de imagen celular durante la embriogénesis.
Abstract
Las células cambian mucho en su ubicación y la propiedad durante la embriogénesis. Estos cambios están regulados por las interacciones entre las células y su medio ambiente. Embriones quiméricos, que se componen de células de los antecedentes genéticos diferentes, son una gran herramienta para estudiar las interacciones célula-célula mediada por los genes de interés. La transparencia de embriones de pez cebra en las primeras etapas de desarrollo permite la visualización directa de la morfogénesis de los tejidos y órganos a nivel celular. Este sentido, demuestran un protocolo para generar quimérico retinas y cerebros de embriones de pez cebra y para realizar las imágenes en vivo de las células del donante. El protocolo contempla la preparación de las agujas del trasplante, el trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa blastómeras donantes para GFP-negativos los ejércitos, y el examen de comportamiento de los donantes de células en la microscopía confocal en vivo. Con ligeras modificaciones, este protocolo también se puede utilizar para estudiar el desarrollo embrionario de otros tejidos y órganos en el pez cebra. Las ventajas de utilizar la GFP a las células de los donantes etiqueta también se discuten.
Protocol
Discussion
En este vídeo, se demuestra un método para el trasplante de blastómeros para analizar el desarrollo de la retina y el cerebro en el pez cebra. Este protocolo también se puede utilizar para analizar el desarrollo de otros tejidos y órganos, simplemente la liberación de los blastómeros de los donantes a los lugares correspondientes en los embriones de acogida. El etiquetado con las moléculas de las buenas prácticas agrarias se obtiene un fondo más limpio que el etiquetado con tinte fluorescente dextrano conjugad…
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Core Grant (5P30EY008098) y los siguientes fondos de XW: Subvenciones del NIH R01EY016099 e Investigación para Prevenir la Ceguera Premio al Desarrollo Profesional. Damos las gracias a Kira Lathrop de asistencia en la imagen confocal.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
