Summary
우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
세포 embryogenesis 동안 자신의 위치와 속성에 광범위하게 변경합니다. 이러한 변경은 세포와 그 환경 사이의 상호 작용에 의해 규제됩니다. 다른 유전 배경의 세포 구성되어 있으며 키메라 배아는 관심의 유전자에 의해 중재 세포 세포 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 초기 발달 단계에 zebrafish의 배아 투명성은 세포 수준에서 조직과 장기의 morphogenesis 직접 시각화 수 있습니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아의 망막과 두뇌 키메라를 생성하고 기증자의 세포의 라이브 영상을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜은 이식의 바늘의 이식의 준비를 다루고 GFP - 표현 GFP - 부정적인 호스트 기증자 blastomeres를 라이브 공촛점 현미경 하에서 공여 세포 행동의 시험. 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 또한 zebrafish에서 다른 조직과 장기의 배아 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 레이블 기증자 세포에 GFP를 사용하는 장점도 설명합니다.
Protocol
1 일. 준비
1. 물고기 십자가를 설정
저녁에 zebrafish의 pairwise 교차를 설정합니다. 원하는 시간 전에 무작위로 교배를 방지하기 위해 짝짓기 카세트에서 암컷과 수컷 물고기를 구분하는 디바이더를 사용합니다. GFP - 표현 유전자 변형 물고기 것은 기증자 blastomeres의 소스로 사용됩니다. pt104 유전자 변형 라인 (Zou 외., 2008), 여기에 사용 EF1 모터의 제어하에 ubiquitously GFP를 표현합니다. GFP의 표현이 라이브 영상으로 기증자 세포의 시각화 수 있습니다. 적합한 형광 단백질을 표현하는 다른 유전자 변형 물고기 라인은 특정 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.
2. 배아 보관을위한 쐐기 모양의 아가로 오스 웰스 준비
페트리 접시에 E3 계란 물 (웨스 터, 2007)에서 준비 녹아 1퍼센트 아가로 오스를, 하거라. 아가로 오스 솔루션 쐐기 모양의 라고나할까요을 가지고 있으며, 아가로 오스 솔루션이 완전히 응고하게 플라스틱 금형을 플로트. 자세히 곰팡이를 제거하고 E3 물과 아가로 오스 침대 젖어.
3. 이식의 바늘을 준비
유리 모세관 pipettes (세계 정밀 악기)를 당겨 바늘을 만들 11.5 설정을 전원에서 수직 니들 풀러 (데이비드 KOPF 악기)를 사용합니다. 좋은 바늘 팁 긴 샤프트와 테이퍼합니다. 내경 40 - 45μm의 beveled 개구부 (그림 1A)를 얻을 수있다 때까지 마이크로 그라인더 (Marishige)와 45도 각도로 바늘 도움말을 분쇄. 바늘 팁을 정리, 바늘의 뭉툭한 끝에 호스를 연결 주사기에 호스를 연결한 다음 빨아 모든 보이는 이물질이 제거될 때까지 10 % 불화 수 소산 산성 솔루션을 출시. 다음, 100 % 에탄올 다음 증류수로 도움말을 씻으십시오. 모든 에탄올 증발까지 바늘을 공기 건조. 잔여 에탄올의 고온 연마 단계에서 바늘을 망치는 것입니다 도움말을 완전히 건조되도록하는 것이 중요합니다. 바늘 팁의 거친 모서리를 부드럽게하고 폴란드어하려면, 마이크로 위조자 (Marishige)의 필라멘트에 의해 생성된 열을와 바늘 팁을 구워. 바늘 도움말을 연마 중에 필라멘트를 만지지 않도록하십시오. 필라멘트와 바늘 팁 사이의 필라멘트와 거리지만 전달하는 전기의 양은 원하는 난방 조건을 달성하기 위해 조정할 수 있습니다. 온도가 너무 높으해서는 안됩니다 :이 녹으 바늘 조언을 변형합니다. 거친 가장자리가 smoothened 후 조심스럽게 바늘 끝으로 가열 필라멘트를 터치하고 부드럽게 지적 엔드 (그림의 1B)를 생성하는 바늘에서 멀리 필라멘트를 당기십시오. 날카로운 부드럽고 깨끗한 바늘은 그대로 기증 blastomeres를 취득하고 호스트 배아를 손상되지 않습니다 중요합니다.
4. 배아 - 위치 프로브를 준비
smoothened 끝에있는 고급 유리 프로브를 얻기 위해 가스 불꽃을 통해 유리 피펫을 당기세요. 이 프로브는 이전에 이식하기 위해 적절한 방향에서 배아를 위치로 사용됩니다.
일 2. Blastomere 이식
1. 수집 및 dechorionate 배아
다음날, 친구에게 물고기를 허용하도록 교차 카세트에 디바이더를 제거합니다. E3 물이 가득 배양 접시에있는 배아를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세 포셉 한 쌍의와 배아에서 chorions 멀리 되는걸하여 dechorionate 배아. 신중하게 아가로 오스 웰스에 dechorionated 배아를 전송하는 구부러진 샤프트와 유리 피펫을 사용합니다. 공기와 배아의 접촉을 피하십시오, 이것은 버스트에 배아의 원인이됩니다. 배아는 28.5에서 개발하자 ° 아가로 오스 웰스의 C 3 시간 게시물 수정, 또는 HPF까지.
2. 이식 장치를 설정
배아가 발달하는 동안, 미네랄 오일 - 채워진 마이크로 펌핑 시스템에 이식 바늘을 연결하여 이식 장치를 설정합니다. 시스템이 누설되지 않으며 기포가 시스템에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 위로 0.5을 제외하고, 미네랄 오일과 함께 전체 이식 바늘을 채우기 - 공간 1 μl를 팁 오프닝에서.
3. blastomeres의 이식
blastomeres을 이식하려면, 이상 3 - 4 - HPF의 태아의 blastomere 측면을 동쪽을 향하게하는 유리 위치 프로브를 사용합니다. 그런 다음, 부드럽게 기증자의 배아에 이식 바늘을 삽입하고 천천히 바늘로 50-20 blastomeres을 빨아. 호스트 배아에 blastomere - 채워진 바늘을 넣고 천천히 blastomeres를 놓습니다. 그들의 자손들이 나중에 발달 단계에서 집중 어디 blastomeres가 출시되는이 사이트는 영향을 미칠 것이다. 망막과 두뇌 개발, 동물 극에서 출시 세포를 분석합니다. 이식하는 동안, 바늘 끝 공기에 문의 있지 않은지 확인하십시오. 기계적 피해를 최소화하기 위해, 호스트 배아는 다음날까지 28.5 ° C의 아가로 오스 우물에 남아한다. 그런 다음, T각각 잘 한 배 (胚)와, 1 % 아가로 오스의 0.5 ML 사전 코팅 24 잘 접시에 모자이크 배아를 ransfer. E3 계란 물 1 ML 각 잘에 추가됩니다. 박테리아 감염을 방지하기 위해, 100X 페니실린 및 E3 계란 물에 스트렙토 마이신 10 μl를 추가합니다.
3 일. 퍼가기과 모자이크 배아의 라이브 영상
1. 퍼가기 배아
E3 계란 물 속에 1.5 % 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMP)를 준비하고 30 ° C의 물을 욕조에 솔루션을 유지. 두께 0.17mm의 유리 바닥을 가진 FluoroDish 조직 문화 요리 (세계 정밀 계측기)에 모자이크의 배아를 전송합니다. 단지 E3의 최소 금액이 적용되는 배아를 떠나 초과 E3 물을 제거합니다. 배아에 30-50 μl 녹인 1.5 % LMP를 추가합니다. 빨리 아가로 오스 솔루션 굳은하기 전에 가능한 한 유리 하단에 가까운 눈 또는 머리를 위치. 솔루션은 아래 냉각 후, 더 이상 장소에서 배아를 보호하는 추가 아가로 오스 솔루션을 추가합니다. 그런 다음, 2-3 ML E3 달걀 물로 확정 아가로 오스 블록을 담가.
2. 공촛점 이미징
공촛점 현미경을 위해, 큰 초점 심도있는 물이 침수 바뀌 목적은 (올림푸스, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, 일본)이 사용됩니다. 물방울이 목적에 추가하고 다음 목적에 FluoroDish 조직 문화 요리를 장소이기도합니다. 이미지 개발, 배아 5 분 간격의 사진을 복용하여 시간 경과 이미징을 수행합니다. 실험의 성격에 따라, 촬영 사이의 시간 간격을 조정해야합니다.
대표 결과
그림 2는 대표적인 24 HPF의 모자이크 zebrafish를 보여줍니다. GFP 표현이 녹색에서 기증자의 세포를 강조 표시합니다. 망막 neuroepithelial 세포가 망막 벽의 전체 두께에 걸쳐.
영화는 24 HPF에서 호스트 두뇌에 기증자 세포의 움직임을 보여줍니다. 공지 세포의 morphologies은 시간이 지남에 따라 변경합니다.
그림 1. 이식 니들 팁 형태. A.는 바늘 끝의 beveled 오프닝은 불화 수 소산 산성 세척 후 파편 무료되었습니다. B. 뾰족한 끝을 바늘 끝에 생성되었습니다.
그림 2. GFP의 시각화 - 표현 24 HPF에서 키메라 zebrafish의 배아에서 기증자 세포를. 왼쪽 패널은 두뇌와 망막의 GFP 신호를 보여줍니다. 중앙 패널은 배아의 밝은 현장 사진입니다. 오른쪽 패널은 병합된 이미지를 보여줍니다.
영화 1. GFP 긍정적인 기증자 세포 이미징 개발 중에 뇌 세포 neuroepithelial의 morphologies의 광범위한 변화를 보여주는 살고 있습니다. 영화의 각 프레임은 24 일과 25 HPF 사이에 5 분마다 수집하고있는 것은. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 망막과 두뇌 개발을 분석 blastomere 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 호스트 배아의 해당 위치로 기증자 blastomeres을 출시하여 다른 조직과 기관의 발전을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 분자와 라벨링은 형광 염료 복합 Dextran (호 케인 1990)와 라벨보다 깔끔한 배경을 산출. 죽은 기증자 세포에서 Dextran의 염료의 잔해가 있으므로 영상 (카탈라노 외., 2007)와 inferring, GFP보다 훨씬 더 오래 지속되기 때문입니다. 또한, GFP - 긍정적인 기증자의 세포는 Dextran의 염료를 포함하는보다 건강 있습니다.
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Acknowledgments
NIH 그랜트 R01EY016099 및 실명 경력 개발 상을 방지하기 위해 연구 : 본 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 코어 그랜트 (5P30EY008098) 다음과 같은 자금 XW에 의해 지원되었다. 우리는 공촛점 이미징에 도움 키라 라스럽 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
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References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
