Summary
Dimostriamo un protocollo per generare embrioni di zebrafish chimerico per vivere comportamento imaging cellulare durante l'embriogenesi.
Abstract
Cellule cambiare ampiamente nelle loro posizioni e proprietà durante l'embriogenesi. Questi cambiamenti sono regolati dalle interazioni tra le cellule e il loro ambiente. Embrioni chimerici, che sono composti da cellule di diverso background genetico, sono grandi strumenti per studiare le interazioni cellula-cellula mediata da geni di interesse. La trasparenza embrionale del pesce zebra in primi stadi di sviluppo permette la visualizzazione diretta della morfogenesi dei tessuti e organi a livello cellulare. Qui, dimostriamo un protocollo per generare retine chimerico e cervelli in embrioni di zebrafish e di eseguire l'imaging dal vivo delle cellule del donatore. Il protocollo riguarda la preparazione di aghi trapianto, il trapianto di GFP che esprimono blastomeri donatore per GFP-negativi padroni di casa, e l'esame del comportamento delle cellule del donatore vivo sotto microscopia confocale. Con lievi modifiche, questo protocollo può essere usato anche per studiare lo sviluppo embrionale di altri tessuti e organi in zebrafish. I vantaggi di usare buone pratiche agricole per le cellule del donatore etichetta vengono anche discussi.
Protocol
Giorno 1. Preparazione
1. Impostare croci pesce
Impostare attraversa coppie di pesce zebra in serata. Per evitare accoppiamenti casuali prima che il tempo desiderato, utilizzare divisori per separare i pesci femminili e maschili nei cassetti di accoppiamento. GFP-esprimere i pesci transgenici sono usati come fonte di blastomeri donatore. Il pt104 linea transgenica (Zou et al., 2008), qui utilizzato, esprime GFP ubiquitariamente sotto il controllo del promotore EF1. Espressione GFP permette la visualizzazione di cellule del donatore per immagini dal vivo. Altre linee di pesci transgenici che esprimono proteine fluorescenti adatti possono essere utilizzati per esigenze specifiche.
2. Preparare a forma di cuneo agarosio pozzi per lo svolgimento degli embrioni
Versare fuso 1% agarosio, preparata in acqua uovo E3 (Westerfield, 2007), in una piastra di Petri. Float uno stampo di plastica che è a forma di cuneo sporgenze sulla soluzione di agarosio e lasciare che la soluzione di agarosio solidificare completamente. Togliere lo stampo con attenzione e immergere il letto di agarosio con acqua E3.
3. Preparare aghi trapianto
Utilizzare un estrattore verticale dell'ago (David KOPF Instruments) alla potenza impostazione 11,5 a fare gli aghi tirando pipette di vetro capillare (Precision Instrument World). Suggerimenti ago buono dovrebbe conici con alberi lunghi. Macinare le punte ago con un angolo di 45 gradi con un Grinder Micro (Marishige) fino aperture smussati di 40-45μm di diametro interno sono ottenuti (Fig. 1A). Per pulire la punta dell'ago, collegare un tubo alla fine smussata dell'ago, collegare il tubo di una siringa, e poi aspirare e rilasciare una soluzione al 10% di acido fluoridrico fino a quando tutti i detriti visibile viene rimosso. Successivamente, lavare le punte con acqua distillata, seguito da 100% di etanolo. Asciugare gli aghi fino a che tutti evapora etanolo. E 'importante assicurare che le punte siano completamente asciutti: l'etanolo residuo rovinerà gli aghi durante l'alta temperatura fase di lucidatura. Per ammorbidire e lucidare gli spigoli delle punte ad ago, cuocere le punte ago con il calore generato dal filamento di un falsario Micro (Marishige). Non lasciare che le punte ago toccare il filamento durante la lucidatura. La quantità di elettricità che passa anche se il filamento e la distanza tra il filamento e la punta dell'ago può essere regolata per raggiungere condizioni di riscaldamento desiderata. La temperatura non dovrebbe essere troppo alto: questa si scioglierà e deformare la punta dell'ago. Dopo gli spigoli sono levigati, con attenzione toccare il filamento riscaldato con la punta dell'ago e poi tirare delicatamente il filamento lontano da l'ago per generare una estremità appuntita (fig. 1B). Un ago tagliente, liscia e pulita è fondamentale per l'ottenimento di blastomeri donatore integro e per non danneggiare gli embrioni ospitante.
4. Preparare un embrione-posizionamento della sonda
Tirare una pipetta di vetro sulla fiamma del gas per ottenere una sonda sottile vetro con un fine sfumate. Questa sonda sarà utilizzata per posizionare gli embrioni secondo il giusto orientamento prima del trapianto.
2 ° giorno. Blastomero trapianto
1. Raccogliere ed embrioni dechorionate
Il giorno dopo, togliere i divisori nei cassetti croce per consentire ai pesci di accoppiarsi. Mettere gli embrioni in una piastra di Petri riempita con acqua E3. Poi, gli embrioni dechorionate manualmente strappare la chorions dagli embrioni con un paio di pinze fine. Utilizzare una pipetta di vetro con albero piegato per trasferire gli embrioni attentamente dechorionated in agarosio pozzi. Evitare il contatto degli embrioni con l'aria, che causano gli embrioni per scoppiare. Lasciate che gli embrioni si sviluppano a 28,5 ° C nei pozzi agarosio fino a 3 ore dopo la fecondazione, o HPF.
2. Istituire un apparato di trapianto
Mentre gli embrioni progettare, organizzare un apparato trapianto collegando l'ago trapianto al bagno d'olio minerale micro-sistema di pompaggio. Assicurarsi che il sistema non perde e non bolle d'aria intrappolate nel sistema. Riempire di nuovo l'ago intero trapianto con olio minerale, ad eccezione del ,5-1 l di spazio in apertura punta.
3. Trapianto di blastomeri
Per trapianto di blastomeri, utilizzare una sonda di posizionamento di vetro per orientare il lato blastomero del 3-4-HPF embrioni verso l'alto. Poi, inserire delicatamente l'ago in un trapianto di embrione donatore e succhiare lentamente in 5-20 blastomeri l'ago. Inserire il blastomero pieno ago in un embrione di accoglienza e rilasciare i blastomeri lentamente. Il sito in cui vengono rilasciati i blastomeri influenzerà in cui la loro progenie localizzare nelle fasi successive dello sviluppo. Per analizzare lo sviluppo della retina e del cervello, le cellule rilasciano al polo animale. Durante il trapianto, assicurarsi che la punta dell'ago non ha contatto con l'aria. Per ridurre al minimo i danni meccanici, gli embrioni ospitante deve essere lasciato nei pozzetti agarosio a 28,5 ° C fino al giorno successivo. Poi, transfer gli embrioni mosaico di piastre di pre-ricoperto con 0,5 ml di 1% agarosio 24-bene, con un embrione in ciascun pozzetto. 1 ml di acqua uovo E3 si aggiunge a ciascun pozzetto. Per prevenire le infezioni batteriche, aggiungere 10 ml di penicillina e streptomicina 100X all'acqua uovo E3.
3 ° giorno. Incorporare e immagini dal vivo degli embrioni mosaico
1. Incorporare gli embrioni
Preparare 1,5% di agarosio a basso punto di fusione (PML) in acqua uovo E3 e mantenere la soluzione in un bagno d'acqua 30 ° C. Trasferimento di un embrione mosaico di un piatto FluoroDish coltura di tessuti con un fondo di vetro di 0,17 millimetri di spessore (Strumenti di precisione World). Eliminare l'acqua in eccesso E3 di lasciare l'embrione appena coperto da una minima quantità di E3. Aggiungere 30-50 microlitri LMP fuso 1,5% per l'embrione. Rapidamente posizione l'occhio o il cervello più vicino possibile al fondo di vetro il più possibile prima che la soluzione di agarosio solidifica. Dopo che la soluzione si raffredda, aggiungere ulteriori soluzione di agarosio per proteggere ulteriormente gli embrioni in posizione. Poi, immergere il blocco solidificato agarosio con 2-3 ml di acqua uovo E3.
2. Confocale Imaging
Per la microscopia confocale, un acqua-immersion obiettivo invertito (Olympus, Planapo, 40 X/0.90 WLSM, Giappone) con la profondità attenzione spesso è utilizzato. Una goccia d'acqua si aggiunge sul obiettivo e poi inserire un FluoroDish piatto di coltura tissutale sull'obiettivo. Allo sviluppo dell'immagine, eseguire time-lapse imaging di scattare foto degli embrioni ogni 5 minuti. A seconda della natura degli esperimenti, gli intervalli di tempo tra uno scatto e deve essere regolato.
Rappresentante risultati
La figura 2 illustra un rappresentante di 24 HPF zebrafish mosaico. Espressione GFP evidenzia le cellule del donatore in verde. Le cellule della retina neuroepiteliale coprono l'intero spessore della parete della retina.
Il filmato mostra i movimenti delle cellule del donatore nel cervello ospite a 24 HPF. Cellule preavviso morfologie cambiare nel tempo.
Figura 1. Forme di punte ad ago del trapianto. A. L'apertura smussato della punta di un ago era libero di detriti dopo ripetuti lavaggi acido fluoridrico. B. Una estremità appuntita è stata generata sulla punta dell'ago.
Figura 2. Visualizzazione di GFP che esprimono cellule del donatore in embrioni di zebrafish chimerico a 24 HPF. Il pannello di sinistra mostra i segnali GFP nel cervello e della retina. Il pannello centrale è una foto in campo chiaro dell'embrione. Il pannello di destra mostra l'immagine fusa.
Movie 1. Live imaging di cellule del donatore GFP positive dimostrato la grandi cambiamenti nella morfologia delle cellule cerebrali neuroepiteliale durante lo sviluppo. La singoli fotogrammi del film sono stati raccolti ogni 5 minuti tra le 24 e 25 HPF. Clicca qui per vedere il filmato .
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Discussion
In questo video, si dimostra un metodo per blastomero trapianto di analizzare lo sviluppo della retina e del cervello in zebrafish. Questo protocollo può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organi e tessuti, semplicemente rilasciando il blastomeri donatore di posizioni corrispondenti negli embrioni di accoglienza. L'etichettatura con le molecole GFP produce uno sfondo più pulito rispetto etichettatura con colorante fluorescente coniugato Destrano (Ho e Kane 1990). Questo perché i residui di coloranti Destrano dalle cellule del donatore morto dura molto più a lungo GFP, dunque inferire con immagini (Catalano et al., 2007). Inoltre, la GFP-positive cellule del donatore sono più sani di quelli che contengono coloranti Destrano.
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Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da una National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) ei fondi di seguito per XW: NIH Concessione R01EY016099 e della Ricerca per la prevenzione Career Development Award cecità. Ringraziamo Lathrop Kira per l'assistenza nel campo dell'imaging confocale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
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References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
