Summary
Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
배아 상피 세포가 여러 세포 조직은 이러한 세포 표면적과 셀 높이의 변화로 자신의 형상의 변화를 받아야 어디 morphogenesis을 연구하는 이상적인 모델 역할을하고, 세포가 유사 분열을 받아야하고 마이 그 레이션하는 곳. 또한 상피 세포는 인접한 조직에 morphogenetic 움직임을 통제할 수
Protocol
당신이 시작하기 전에
- 표준 방법 (; Epicentre의 Biotechnologies, 매디슨 위스콘신 AmpliCap의 전송 키트)의 찬란 태그 단백질과 정화 mRNA를 인코딩 선형 DNA의 템플릿에서 덮인 mRNA를 합성. mRNA는 0.2 ML의 원심 분리기 튜브의 단일 시간 사용 aliquoted 및 -80 ° C.에 보관해야
- 표준 체외의 수정에 계란을 얻는 방법, 그리고 계란 코트의 제거는 이전에 다음이 설명되었습니다. Xenopus laevis 여성 개구리의 알을 얻기 위해 절차는 이전 세 증명되었습니다. 남자 개구리에서 이전에 분리된 testes를 사용하는 여성 개구리에서 그들을 구하기 후 즉시 체외에서 계란을 비옥. 데 - 젤리 달걀은 20 분 게시물 수정과 mRNA, 단백질, DNA, 또는 dextran을 주입 즉시 microinjected 시약의 충분한 보급을 허용합니다. 주사 이상 1 시간 게시물의 수정은 종종 사출 사이트에서 주워 실패합니다.
- Oocyte의 microinjection은 압력 밸브 제어 연료 분사 장치를 (PLI - 100, 하버드 장치)를 사용하여 이전 4 입증되었습니다. 4 셀 단계 - 1 개구리 배아의 동물 반구에 mRNAs 주입을 위해 비슷한 방법을 따르십시오. 1X MBS (MBS - Ficoll)의 3 % Ficoll (시그마, 세인트 루이스 MO)으로 수정된 배아를 전송하고 막 (멤 - GFP) 또는 F 타겟으로 덮인 mRNA 인코딩 GFP의 원하는 볼륨 (2-4 NL)와 microinject - 굴지 (모 - GFP). 도 분포가 동물 극 4 동등 간격 사이트에서 mRNA를 주입 얻을 수 있습니다. 배아는 몇 시간 동안 MBS - Ficoll에 남아 있지만 gastrulation이 시작하기 전에 3분의 1 X MBS로 전송해야합니다.
필수 자료 (*로 표시된 항목이 그림에 표시됩니다 1.)
- 광섬유 조명과 절개의 stereomicroscope. 냉각 해부 무대를 권장하지만, 선택 사항입니다.
- 헤어 도구 (헤어 나이프와 헤어 루프) *
- 포셉 (더몬트 # 5 스테인레스 스틸, 파인 과학 도구, 포스터 시티, CA) *
- 수정 바쓰의 살린 배아 문화 미디어 (MBS, 88 MM NaCl, 2.4 MM NaHCO 3, 1 ㎜ KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.41 MM (캐노 3) 2, 0.82 MM MgSO 4, 10 MM HEPES (H3375, 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스 MO)).
- Danilchik의 에이미 explant 문화 미디어 (DFA, 53 MM NaCl 2, 5 MM 나 2 CO 3, 4.5 MM 칼륨 글루 콘 산, 32 MM 나트륨 글루 콘 산, 1mM CaCl 2, 1mM MgSO 4). DFA (; A7906, 시그마 - 알드리치 BSA)과 알부민 0.1 % 소 혈청을 포함합니다. DFA는 여과 멸균되어야하지만 50 ML 원뿔 튜브에 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 항생제와 antimycotics (미디어 0.8 %, A5955, 시그마 - 알드리치)은 세균이나 곰팡이 성장을 억제하기 위해 갓 해동 DFA에 추가되어 있어야합니다.
- 60 100mm 배양 접시 *.
- 50mm (12-544 - F # 1.5, 피셔 과학, 햄프턴, NH)에 의해 대형 덮개 유리, 45 *.
- 소형 커버 유리, 40mm (12 - 544C, # 1.5, 피셔 사이 언티픽)에 의해 24.
- 실리콘 그리스 (고진공, 다우 케미컬)는 주사기 "코킹 군"에 로드된 *.
- 맞춤 아크릴 실 또는 나일론 와셔 (소형 부품 주식 회사, 미라, FL) *. 사용자 정의 여왕님 2.8 cm로 1.2 cm하는 내부 챔버를 제공하기 위해 5mm의 아크릴 블록 50로 25에서 기계 공장에서 가공된 수 있습니다. 이 챔버는 1.68 ML의 작업 볼륨을했다. 옵션 나일론 와셔는 다양한 크기의 선택할 수 있습니다, 우리는 18mm 직경 원형 유리 coverslips와 크기 호환 선호합니다.
- 다이아몬드 연필 *.
1 부 : 동물 캡 explants의 절단
- 3분의 1 X의 MBS에서 원하는 단계 5 문화 배아. 개발의 속도는 실험이 하루 중 편리한 시간에 할 수 있습니다 ° C 있도록 15 21 사이의 문화 기온 제어할 수 있습니다. 객실 온도가 사용할 수 있지만 태아가 더 빨리 개발할 것입니다.
- DFA로 배아를 전송합니다.
- 포셉를 사용하여 vitelline의 세포막을 제거합니다.
- 해부 stereomicroscope, 소비세에서 동물 캡 explant 머리 - 나이프와 머리 - 루프 6을 사용. 배아의 동물 북극의 작은 절개를 만들 위치와 머리 - 칼을에서 배아를 지원 또는 개최 머리카락 루프를 사용합니다. 배아에서 동물 캡 ectoderm을 제거하기 위해 360 °의 절개를 만들기 위해 머리 - 칼로 반복 '영화 - 상처 "를 사용합니다. 연습 하나는 부드러운 상처 가장자리에서 explant 또는 lysed 세포 (그림 2A)에 피해를 최소화 그 결과를 만들 수 있습니다.
- 4 동물 캡 explants에 소비세 3 4 단계를 반복하고 2 부로 진행합니다. explants를 깎다가들이 신속하게 공을까지하는 경향이 있기 때문에 하나는 빨리해야합니다. 냉각 해부 단계의 과정을 느리게하거나 또는 당신은 더 적은 explants 수 있습니다.
2 부 : 장기 문화에 대한 준비 챔버스, 부하 explants, 날인 챔버
- 사용실리콘 접착제에 기름이나 대형 커버 유리 아크릴 챔버를 밀봉.
- 2-4 상온에서 시간 또는 4 밤새위한 챔버 잠복기가 아닌 접착제 기판과 유리 코팅으로 챔버 내의 유리를 explants의 접착력을 줄이기 위해 ° C 3분의 1 X MBS의 1 % BSA와 (과 BSA - MBS).
- 다이아몬드 연필을 사용하여 작은 coverslip 조각 (8mm로 약 2) 준비합니다. BSA - MBS 사전 코트 조각.
- 챔버에서 BSA - MBS를 씻어 DFA로 미디어를 교체하십시오.
- 엑사이스 동물 모자 explant (S) (1 부;. 그림 2A) 및 챔버로 전송할 수 있습니다. 머리 루프를 (챔버의 바닥에 직면하고 상피 층)를 사용하여 각 explant 위치를 부드럽게 작은 고진공 그리이스 (그림 2B)의 dabs 실시 유리 coverslip 조각과 장소에서 explant을 수정. 과도한 압력이 쉽게 explant을 부술 수 있기 때문에 coverslip을 누르면서 매우주의하십시오. 여러 explants 제자리에 explants을 보유하는 데 사용되는 작은 coverslip 조각의 크기에 따라 각각의 챔버로 로드할 수 있습니다. 연습 최대 20 explants은 아크릴 챔버 여기서 설명으로 로드할 수 있습니다. 상단의 개통과 함께 전까지도 DFA로 방을 채우십시오. 40mm 커버 유리에 의해 24 챔버의 상단을 밀봉하기 위해 실리콘 그리스를 사용합니다. 챔버에서 밀봉 챔버와 얼룩 오버플로에 공기 거품을 줄이기 위해 DFA를 추가하거나 제거합니다.
- 이 봉인 챔버는 챔버의 대형 낮은 유리 표면을 통해 동물 캡 explants의 장기 문화와 라이브 영상을 허용합니다. 그것은 나중에 이미지에 대한 낮은 유리의 흙을 무료로 챔버의 표면, 기름, 또는 미디어를 유지하는 데있어 매우 중요합니다. 우리는 그들이 영상에 대한 준비로 챔버 스를 저장하기 위해 종이 타월 바닥 배양 접시를 준비하는 것이 좋습니다.
파트 3 : 고해상도 라이브 영상 공촛점 현미경
이 섹션의 프로토콜은 우리 연구소 (; Leica 이크로 시스템즈, 배녹번 IL Leica TCS SP5)에 사용할 공촛점 현미경을 사용하여 개발되었습니다. 다른 공촛점 현미경은 약간의 수정을 요구할 수 있습니다 우리는 사용자가 각각의 운영 지침을 따르십시오 것이 좋습니다.
- 이미징 시스템 전원, 현미경 단계를 초기화하고, fluorophores에 적합한 레이저를 설정, 플루오레신 또는 EGFP를위한 아르곤 레이저와 rhodamine 또는 RFP에 대한 543 HeNe 레이저 즉.
- 챔버 하우징에게 현미경 단계에 explants를 놓습니다. 이전에 챔버가 장소에 적절한 목표를 이동 위치. 우리는 초기 이미지에 대한 높은 수치 조리개 20x 공기 목표 (0.7 나)를 사용하는 것이 좋습니다, 우리는 고해상도 이미징을위한 40x 또는 63x 오일 목표 나 using1.4을 추천 및 대형 셀 필드를 추적. (참고 : 실수로 기름에 목표를 찍어하지 않도록 공기 목표를 사용하면 일단 침지 기름 목적 사용주의에 적용됩니다.) 장소에 챔버를 잡아 작은 무게를 사용합니다.
- 당신은 피상적인 세포의 꼭대기의 끝을 볼 때까지 밝은 - 필드 또는 조명 형광을 사용하여 초점을 조정합니다. 챔버 기지로 목표를 '충돌'하지 않도록주의하십시오. 를 포함하거나 기름 침지 목표를 사용하면 공기 방울을 생산하지 마십시오. 샘플은 "거친"위치 모드를 사용하여 위치되면, "잘"위치 모드로 변경합니다.
- 라이브 영상에 대한 공촛점을 조정에 대한 권장 사항 :
- 레이저의 파워는 가능한 한 낮게 유지되어야합니다 : 1) 세포 모양의 변화 7 트리거링 모든 사고를 방지하기 위해 phototoxic 효과, 3)을 방지하기 위해), 2 표백 방지하기 위해. 레이저 전력 요구 사항은 표현 수준과 배아로 표현 분자 기자의 유형에 따라 다릅니다.
- 그것이 좋은 이미지 해상도를 제공하는 라이브 영상을 위해 1024 픽셀로 1024 스캔 형식을 사용합니다. 당신은 매우 높은 프레임 속도 (최소 우리 시스템 1.3s)을해야하는 경우 다음 512 픽셀 512의 스캔 형식을 사용합니다. 이것은 이미지 해상도를 줄일 수 있지만, 여전히 정보의 합리적인 금액을 추출하기에 충분하실 수 있습니다.
- 배출, 이색성, 그리고 여기 적절한 필터의 스펙트럼 범위를 조정합니다.
- 1 ~ 1.5 에어리 단위 공촛점 핀홀을 조정합니다.
- Photomultiplier 이득은 소음을 줄이고 아직 셀 구조와 단백질 지방화를 식별하는 데 충분한 신호를 제공하는 최소 수준에 보관해야합니다.
- 이미지의 품질을 향상시키기 위해 배경을 조정 오프셋 블랙 레벨을 조정합니다.
- (6) 단계 (1) 반복 최고 품질의 이미지를 가능한 생산에 적용됩니다. 품질 이미지는 넓은 동적 범위 이상의 화소 농도와이나 구조화된 단백질을 해결한다. 정량 분석은 목표가있다면 제로 강도 또는 포화 픽셀의 최소 숫자가 있어야합니다.
- 단계 (1), (3), (5) (6) 가능한 최상 품질의 이미지를 생산하는 각 추가 형광 채널에 반복해야합니다.
- 이미징 두 형광 프로브는 최소한의 스펙트럼 출혈 - 하나를 통해 단백질의 두 번째 단백질의 방출 스펙트럼에있다는 것을 보장하기 위해 중요하다 때. 출혈 스루는 첫 번째 단백질 흥미로운 레이저 전원을 줄이고 두 번째 단백질에 의해 사용되는 파장에서 생산되는 신호를 관찰하여 테스트하실 수 있습니다. 분광 출혈 -을 통해이 필터의 더 많은 제한 선택하거나 여기에 사용되는 레이저의 전원을 줄이고 최초의 단백질의 검출에 사용되는 게인을 증가하여 줄어들 수 있습니다.
- 이러한 지침을 사용하여 공촛점 조정된와 함께 그것은 XY 모드 (그림 3A)에서 하나의 초점 깊이에서 하나의 이미지를 캡처하는 수 있어야한다.
- 한 이러한 세포 수축 7 중 모양의 변화에 따라 동적으로 발생하는 프로세스의 시간 경과 영화를 수집에 관심이있다면, 하나는 다음과 같은 대안 공촛점 모드에서 선택할 수 있습니다 :
- XYT :이 모드는 하나가 Z - 비행기를 변경하지 않고, 시간이 지남에 따라 이미지의 시리즈를 수집 할 수 있습니다. 우리는 상피 세포의 내생적인 변동을 관찰하기 위해이 모드를 사용합니다. 일반적으로, 우리는 5 초마다는 상피 세포의 외부 자극에 의해 유도된 내생 유사 또는 모양 변경을 관찰 20 분 다시 한 프레임을 획득. 프레임 속도의 선택은 하나가 관찰의 방법과 동적인 프로세스가 관심이 무엇에 완전히 종속되어 있습니다.
- XYZ :이 모드를 사용하여, 우리는 상피 세포를 통해 하나의 Z - 시리즈 스택을 수집할 수 있습니다. Z - 시리즈를 수집하는 우리의 기본 설정은 5 μm의 범위 이상 0.1 μm의 단계입니다. 우리는 cytoskeletal 변화가 세포 피질 어디에서나에만 adherens 분기점의 수준과 같은 특정 위치에서 발생하거나한지 여부를 확인할 수이 모드를 사용합니다.
- XZT (그림 3A ') :이 모드는 주로 상피에서 세포의 꼭대기의 - 기초 조직의 급속한 변화를 관찰하는 데 사용됩니다. 이 모드는 XYT 모드 공촛점 이미지 수집가 Z - 축을 따라 표류하지 않는 혀끝의 셀 도메인에 그 변화의 신뢰성 기자입니다 확인 년에 유틸리티 인기를 끌고 있습니다.
- XYZT : 이것은 XYZ와 XYT 모드를 결합한 제품입니다. 이 모드는 상피의 전체 혀끝의 - 기초 역학에 대한 풍부한 정보를 제공하고 있지만 전체 이미지 스택을 취득하고 심각하게 photobleaching 및 phototoxic 효과에 의한 세포 생존을 줄일 수 있습니다 느립니다 수 있습니다.
- 라인 평균 2) 라인 축적, 3) 프레임 평균 4) 프레임 축적 1) : 이미지 품질은 하나 또는 다음과 같은 네 가지 방법의 조합을 사용하여 제한된 범위로 향상시킬 수 있습니다. 이미지 취득이 평균 모드는 이미지 품질을 향상시킬 수 있지만 세포 생존을 줄이고 이미지를 수집하기 위해 더 많은 시간을 요구할 것입니다.
- 모든 설정 신중하게 조정을 통해 수집하고 외장 하드 드라이브, USB 메모리 스틱, 또는 네트워크에 연결된 서버에 이미지, Z - 시리즈 및 시간 시리즈 데이터를 저장합니다.
- 일단 실험을 마친 아르, 안전을 위해 목표를 낮게 목적에서 석유와 렌즈 종이 현미경 단계 청소, 파워 다운 공촛점 시스템입니다.
부 4 : F - 굴지의 microfilaments의 라이브 영상
제 3과 같이되어로서, 단백질을 번역 막은 멤 - GFP 찬란 세포 세포막 레이블을 사용할 수 있습니다. 하위 세포 구성 요소의 라이브 영상은 다른 단백질을 사용하여 이루어진다. F - 굴지 바인딩 도메인을 포함하고 같은 moesin - GFP와 같은 단백질은 세포 라이브에서 F - 굴지의 레이블을 사용할 수 있습니다. 시간이 경과 시퀀스의 라이브 셀 이미징 및 수집 비슷한 전략 제 3에 나와있는 절차를 따르십시오. 라이브 영상 F - 굴지의 구조는 멤브레인보다 세밀하게 더 긴밀화된 있기 때문에 영상 멤 - GFP보다 현미경 기술을 포함한다. 예를 들어, 침지 기름에 작은 거품이 흐리게하거나 캡처한 이미지에 변수 밝기 등 수차 유물을 생성할 수 있습니다. 또한 초점이나 Z - 비행기에 작은 표류는 moesin - GFP는 수준의 초점을 이동하는 F - 굴지 대뇌 피질의 표시가 발생할 수 있습니다. 따라서, 한 무대, explant 및 챔버를 안정화하기 위해 다시 이중 노력을해야하는 동안 이미지 피질 F - 굴지 및 기타 하위 세포 단백질. moesin - GFP는 F - 굴지 라벨 보여주는 XY와 XZT 이미지는 예입니다 (그림 3B와 B ')로 표시됩니다.
제 5 부 : 이미지 분석
라이브 세포 공촛점 세션에서 얻은 이미지와 시간 - 저속 시퀀스는 단백질 지방화의 모양 변경이나 패턴에 관한 가설을 테스트하기 위해 분석하실 수 있습니다. 맨눈은 종종 정성 분석을위한 최고의 도구지만 확대하거나 양적 데이터를 추출하기 위해 영상 분석 기법에 의해 자동으로 수 있습니다. Leica 공촛점 시스템에서 이미지 데이터가 같은. TIF 형식의 이미지 파일이나 인수 동안 현미경 조건에 대한 자세한 정보를 유지 독점. 난생 형식으로 오픈 형식으로 저장할 수 있습니다. . TI 모두F와. 난생 파일은 직접 다운 받으시면 이미지 분석 프로그램 이미지 J (Rasband, WAS, ImageJ, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, 메릴랜드, 미국, http://rsb.info.nih.gov/ij로 가져올 수 있습니다 / 1997-2009)은 (케빈 Eliceiri, LOCI, 위스콘신 대학, 매디슨, WI) 플러그인 생체 형식을 사용합니다. 다음 섹션에서는 사용자가 공촛점 이미지 데이터의 정량 분석을 시작하는 방법을 설명하는 두 가지 예제를 제공합니다.
- 어떤. TIF 또는. 난생 파일 (Fig.4와 ') 파일을 사용하여> 열기 열기
- 예제 1 : B에 상피 세포 (그림 4B의 셀 영역을 측정 ''').
- > SET 측정 분석 영역을 선택합니다.
- 이미지 J 도구 모음에서 다각형 선택 도구를 선택하고 세포도 포함되어 있습니다.
- 에서 열기 투자 수익 (ROI) 관리자> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석하고 [컨트롤 - T]를 눌러 그것에 개요를 추가, 투자 수익 (ROI) 관리자에게 새로운 "관심의 영역"또는 투자 수익 (ROI)을 추가하는 방법에 대한 바로 가기가있는 것입니다. 그것은이 선택 사항을 추가하고 나중에 돌아가서 다른 매개 변수 측정을 할 수 있기 때문에 투자 수익 (ROI) 집합을 저장하는 것이 중요합니다. 저장된 로아 ( "저장"을 클릭하십시오)의 설정은 추가 분석을 위해 나중에 다시로드하실 수 있습니다.
- 하나는 이미지의 세포의 숫자와 단계 (C) 반복하고 투자 수익 (ROI) 관리자에 로아를 추가할 수 있습니다. 일단 하나가 기록 충분한 로아 있으며, 투자 수익 (ROI) 관리자에서 "법안"을 클릭하십시오. 결과 창에서 하나는 지금 로아에 대한 영역을 볼 수 있습니다. 이미지 크기는 측정 매개 변수에 해당 값을있다.
- 예제 2 : C로 세포막 (그림 4C의 강도를 측정 ''').
- 이미지 J 도구 모음에서 "스트레이트 라인"도구를 선택하고 관심의 세포막에 수직이며 막 교차 이미지에 라인을 그립니다. 이 직선 선택 투자 수익 (ROI)의 다른 종류이며, 위와 같이 투자 수익 (ROI) 관리자를 추가할 수 있습니다.
- 분석> 플롯 프로필 임의의 단위로 상대적 농도를 플롯. 클릭 저장하고 목록에서 이미지로 및 값 목록으로 저장> 파일> 플롯 윈도우에서 다른 이름으로 각각 저장합니다.
- 다양한 정량 측정은 연구자의 관심 분야와 어떤 가설이 테스트되는에 따라 이미지 J를 사용하여 만들 수 있습니다. 마이크로 소프트 엑셀 (마이크로 소프트사, 시애틀, WA) 또는 시그마 플롯은 (Systat 소프트웨어 주식 회사, 산호세, CA) 그래픽 데이터를 계획하는 데 사용할 수 있습니다. 이미지 분석에 추가 예제는 이전에 다음 ID로 7 제시되었습니다.
그림 1. 필수 재료. A) 도구 문화 챔버의 미세 조립에 필요한. 페트리 접시 (A), 대형 커버 슬립 (B), 헤어 도구 (C), 다이아몬드 연필 (D), 포셉 (E), 실리콘 그리스 "코킹 총"(F), 나일론 와셔 (G), 및 사용자 정의 아크릴 문화 챔버 (H). B) 머리 나이프의 접속 닫고 C) 헤어 루프.
그림 2. 동물 캡 explants의 절단. 동물 캡 explant를 (D, 지느러미 제거하는 데 사용 microsurgical 조작의) 도식, V, 복부, 아, 동물 반구, VH, 식물 반구). B) explant의 도식 (E)는 BSA 코팅 유리 (G)에 apposed 혀끝의 표면 실리콘 그리스 (S)에 의해 장소에서 개최 coverslip 조각 아래에 위치. 상피 층이 현미경 목표 (M)에 가까운 있도록 explant가 위치합니다. C) 동물 모자 explant (빨간색 화살표)는 DFA의 교양과 대형 유리 coverslip에 아크릴 챔버 (파란색 화살표) (검은색 화살표)에 보관되어 유리 coverslip의 조각 및 실리콘 기름의 장소에서 개최됩니다.
그림 3. 상피 세포 공촛점 현미경을 사용하여 관찰했다. A) XY보기 및 막 현지화 GFP (멤 - GFP)의 XZ (A ')보기 상피 시트를 표시. B) moesin - GFP의 XY보고 XZ 전망 (B '는) F - 굴지 혀끝의 세포 피질로 표시.
그림 4. 이미지 분석 이미지 J. 막 현지화 GFP 표시 셀 시트의) 원본 이미지를 사용합니다. (A)에 삽입된 페이지 상자의 고해상도보기 (은 A ') 2 "지역 수준의 관심"또는 로아를 보여줍니다. 노란색 테두리는 다각형 도구 (패널 B를 참조)과 녹색 선을 사용하여 선택 한 셀의 경계를 나타내는 것은 직선 도구를 (패널 C 참조)를 사용하여 선택한 셀 - 셀 경계에 걸쳐 강도 프로필의 경로를 나타냅니다. 측정 옵션을 선택하고 "지역"(B ').를 선택하는 B') 방법 투자 수익 (ROI)을 선택하면 그것은 투자 수익 (ROI) 관리자 (B ''').에 저장할 수 있습니다 C ')은 프로필의 측정 옵션을 선택하는 방법은했다. C '') 직선 또는 세그먼트 라인 도구가 선택되면 경로를 따라 강도 프로필이 "플롯 프로필"명령으로 꾸몄다 수 있습니다. intens 목록ity 값 또한 스프레드 시트를 읽을 수있는 형태로 저장할 수 있습니다.
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Discussion
우리는 혀끝의 세포 피질 및 Xenopus의 배아에서 상피 세포의 세포 세포막을 진동의 이미지를 동적으로 변화하는 cytoskeleton에 우리가 실험실에서 정기적으로 사용되는 실험 프로토콜을 제시했습니다. 이 프로토콜의 최적화 필수적이며, 설정 중 일부는 현미경 시스템을 하나의 유형에 따라 변경됩니다 있으며 단백질 하나의 타입은 이미지에 관심이있다, 하나는 상피 세포 모양의 라이브 영상을위한 출발점으로이 프로토콜을 사용해야합니다 . 함께, 프로토콜 단계 (explant 절연, 이미징 및 시각화 휴대폰과 하위 세포 구성 요소의, 그리고 부량 방법론) 상피 morphogenesis 연구를 포괄적인 절차를 제공합니다.
기억에 중요한 측면
- 배아에 마이크로 사출을위한 고품질의 mRNA를 준비하는 것이 중요합니다. mRNA 튜브가 저하되지 않도록 얼음에 저장됩니다. 일단 테스트, 튜브가 -80에 저장된 ° C를 작은 aliquots 여러 동결 - 해동 사이클을 피할 수 있습니다.
- 그것은 동물 캡 ectoderm에서 세포의 큰 분야를 통해 mRNA의 균등을 확보하기 위해 여러 사이트로 mRNA를 주입하는 것이 필수적입니다.
- 의 또한 antimycotic / 항생제 박테리아 및 곰팡이 성장을 억제하기 위해 장기적인 문화에 대한 필수적입니다.
- 더보다 필요한 압력이 explants을 부술 수 있기 때문에 coverslip 조각 아래 explants을 누르면서주의해야합니다.
- 이미징 동안 최적의 설정은 내생 세포 행동과 단백질 역학을 반영하는 최상의 이미지 품질로 최대한의 데이터를 수집하기 위해 필수적입니다. 최적의 설정을 선택하면 연습과 경험이 함께 제공됩니다.
- 이미지를 분석하기 위해 우리는 강력 ImageJ을 권장합니다. ImageJ는 다운로드 및 사용자 지정 - 서면 또는 다운로드 매크로 및 플러그인의 추가로 수정할 수있는 우수한 오픈 소스 도구입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건 연구소 (R01 - HD044750), 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 경력 부여, 그리고 미국 심장 협회 (보조금을 시작)의 지원에 의해 지원되었다. 분자 생물학과 합성 mRNA 그녀의 도움 HY 김, M. 폰 Dassow 및 J. 만주국 (매일 연구실 책임에 대한 도움), 그리고 린 장 : 저자 데이비슨 연구소 회원 주셔서 감사합니다. 우리는 지난 몇 년 동안 다양한 방법을 개발하고 테스트하여,이 프로토콜의 일부에 기여한 모든 개구리 실험실 (특히 레이 켈러의 더그 DeSimone의)에서 실험적인 노력을 인정합니다. 우리는 각각 멤 - GFP 및 moesin - GFP의 plasmids 그들의 종류의 선물 리차드 할랜드와 존 월링포드 감사드립니다.
References
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