Imagerie des cellules vivantes et de l'analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

DOI

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Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering, University of Pittsburgh, ²Developmental Biology, University of Pittsburgh

Summary

Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale.

Abstract

Embryonnaire des cellules épithéliales servir de modèle idéal pour étudier la morphogenèse où multi-cellulaires des tissus subissent des changements dans leur géométrie, comme des changements dans la surface cellulaire et la hauteur de cellule, et où les cellules subissent la mitose et la migration. Par ailleurs, les cellules épithéliales peuvent aussi réguler les mouvements morphogénétiques dans les tissus adjacents

Protocol

Avant de commencer

1. Synthétiser ARNm coiffé du modèle de l'ADN linéarisé codant pour la protéine fluorescente marqués et ARNm purifier par des méthodes standard (kit de transcription AmpliCap; Biotechnologies Epicentre, Madison WI). ARNm doivent être aliquotés pour une utilisation seule fois dans 0,2 ml de tubes à centrifuger et conservés à -80 ° C.
2. Les méthodes standard d'obtenir des œufs, la fécondation in vitro, et le retrait de la couche d'œuf ont été décrites précédemment ^2. Une procédure pour obtenir des œufs d'une grenouille Xenopus laevis femelles a été démontré plus tôt ^3. Féconder les oeufs in vitro, immédiatement après leur obtention à partir des grenouilles femelles utilisant testicules précédemment isolé d'une grenouille mâle. De la gelée d'oeufs 20 minutes après la fécondation et injecter l'ARNm, protéines, ADN, ou le dextran immédiatement pour permettre une diffusion suffisante des réactifs microinjectés. Les injections de plus de 1 heure après la fécondation échouent souvent à diffuser à partir du site d'injection.
3. Microinjection des ovocytes a été démontré précédemment ^{4 en} utilisant une pression vanne commandée injecteur (PLI-100, Harvard Apparatus). Suivre une méthode similaire pour injecter ARNm dans l'hémisphère animal d'embryons de grenouilles à la une - à 4 cellules scène. Transfert d'embryons fertilisés Ficoll 3% (Sigma, St. Louis MO) dans 1x MBS (MBS-Ficoll) et microinject avec le volume désiré (2 à 4 nl) des ARNm codant pour la GFP plafonné ciblés à la membrane (mem-GFP) ou F -actine (ME-GFP). Pour obtenir une distribution uniforme d'injecter ARNm à 4 sites équidistants dans le pôle animal. Les embryons peuvent rester dans MBS-Ficoll pendant plusieurs heures, mais doivent être transférés au 1 / 3 x MBS avant le début de la gastrulation.

Matières obligatoires (articles marqués d'une * sont présentés dans la figure 1.)

1. Stéréomicroscope dissection avec éclairage par fibre optique. Une étape de dissection refroidi est recommandée mais facultative.
2. Outils de cheveux (les cheveux couteau et une boucle de cheveux) *.
3. Pince (Dumont # 5 en acier inoxydable; Outils Fine Science, Foster City, CA) *.
4. Mise à jour de Barth Saline les milieux de culture embryonnaire (MBS, 88 mM de NaCl, 2,4 mM NaHCO _3, 1 mM de KCl, 0,33 _mM de CaCl2, 0,41 mM (CANO _{3) 2,} 0,82 mM MgSO _4, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
5. Danilchik pour Amy explant milieux de culture (DFAE; 53 mM de NaCl _2, 5 mM de Na ₂ CO _3, 4,5 mM de gluconate de potassium, 32 mM gluconate de sodium, 1 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4). Inclure 0,1% d'albumine sérique bovine avec des DFA (BSA; A7906, Sigma-Aldrich). DFA doit être filtré stérile, mais peut être aliquotées dans 50 ml tubes coniques et conservés à -20 ° C. Les antibiotiques et les antifongiques (0,8% dans les médias; A5955, Sigma-Aldrich) devrait être ajouté à fraîchement dégelé DFAE pour inhiber la croissance bactérienne ou fongique.
6. 60 ou 100 mm boîte de Pétri *.
7. Couvercle en verre Large, 45 par 50 mm (12-544-F, # 1.5; Fisher Scientific, Hampton, NH) *.
8. Petit couvercle en verre, 24 par 40 mm (12-544c, # 1.5; Fisher Scientific).
9. Graisse de silicone (vide poussé, Dow Chemical) chargée dans une seringue "calfeutrage-gun" *.
10. Personnalisé chambres acrylique ou rondelles en nylon (petites pièces Inc; Miramar, Floride) *. Chambres personnalisées peuvent être broyé dans un atelier d'usinage à partir d'un 25 par 50 par 5 mm bloc acrylique pour fournir une chambre intérieure qui est de 1,2 cm par 2,8 cm. Cette chambre a un volume utile de 1,68 ml. Rondelles en nylon en option peut être sélectionnée dans une variété de tailles, nous préférons des tailles compatibles avec 18 lamelles de verre de diamètre mm circulaire.
11. Crayon de diamant *.

Partie 1: L'excision des explants calotte animale

1. Culture des embryons jusqu'au stade désiré ⁵ en MBS x 1 / 3. Le rythme de développement peut être contrôlé avec des températures de culture entre 15 et 21 ° C afin que les expériences peuvent être réalisées à un moment opportun de la journée. Température ambiante peut être utilisée, mais les embryons se développeront plus rapidement.
2. Transfert embryons à DFA.
3. Retirer les membranes vitelline l'aide de pinces.
4. Sous la loupe binoculaire, d'accise disséquer un explant bouchon animaux en utilisant des couteaux et des sèche-cheveux boucles ^6. Utilisez les cheveux en boucle de soutenir ou de maintenir l'embryon à une position et les cheveux au couteau pour faire une petite incision dans le pôle animal de l'embryon. Utilisation répétée "Flick-coupures" avec les cheveux au couteau pour faire une incision à 360 ° pour enlever le bouchon ectoderme animal de l'embryon. Avec la pratique, on peut faire des coupes lisses qui résultent en un minimum de dommages à l'explant ou de cellules lysées à la marge (figure 2A).
5. Répétez l'étape 4 à accises 3-4 explants bouchon animal et passez à la partie 2. Il faut être rapide tout en réduisant les explants, car ils ont une tendance à la balle rapidement. Une étape de dissection refroidi peut ralentir le processus ou bien vous pouvez faire moins explants.

Partie 2: Préparer les chambres, les explants de charge, et sceller la chambre de culture à long terme

1. Utilisezla graisse de silicone pour coller ou sceller la chambre de l'acrylique pour le couvercle en verre large.
2. Afin de réduire l'adhérence de la couche d'explants de verre de la vitre dans la chambre avec un substrat non-adhésifs, en incubant la chambre pour 2 à 4 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C avec 1% de BSA dans 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
3. Préparer des fragments lamelle de petite taille (environ 2 par 8 mm) en utilisant un crayon de diamant. Pre-Coat fragments avec BSA-MBS.
4. Rincez-BSA MBS de la chambre et de remplacer les médias avec DFA.
5. Accise calotte animale explant (s) (Partie 1;. Fig 2A) et le transfert à la chambre. Placez chaque explant en utilisant un sèche-boucle (avec une couche épithéliale face au fond de la chambre) et doucement corriger l'explant mis en place avec un fragment de lamelle de verre tenu par limandes peu de graisse à vide poussé (figure 2B). Soyez très prudent tout en appuyant sur la lamelle, depuis une pression excessive peut facilement casser l'explant. Explants multiples peuvent être chargés dans chaque chambre basée sur la taille des fragments de petite lamelle utilisée pour maintenir les explants en place. Avec la pratique jusqu'à 20 explants peuvent être chargées dans la chambre de l'acrylique décrits ici. Remplissez les chambres avec DFA jusqu'à ce que même avec l'ouverture en haut. Utilisez de la graisse de silicone pour sceller la partie supérieure de la chambre avec les 24 par 40 mm couvercle en verre. Ajouter ou supprimer des DFA pour réduire les bulles d'air dans la chambre étanche et le débordement blot de la chambre.
6. Cette chambre étanche permettra à long terme de culture et de vivre l'imagerie d'explants calotte animale à travers la grande surface en verre inférieure de la chambre. Il est crucial de maintenir la surface inférieure de la chambre de verre exempt de saleté, de graisse ou supports pour l'imagerie plus tard. Nous recommandons la préparation d'essuie-tout à fond des boîtes de Pétri pour stocker les chambres car ils sont préparés pour l'imagerie.

Partie 3: haute résolution vivons-imagerie de microscopie confocale

Le protocole de cette section a été développé pour l'utilisation d'un microscope confocal à la disposition de notre laboratoire (Leica TCS SP5; Leica Microsystems, Bannockburn IL). Différents microscopes confocaux peuvent nécessiter une modification légère, et nous recommandons aux utilisateurs de suivre leurs instructions d'exploitation respectifs.

1. Power-up du système d'imagerie, d'initialiser la platine du microscope, et tourner sur les lasers appropriés pour les fluorophores, soit le laser argon pour la fluorescéine ou EGFP et 543 pour le laser HeNe rhodamine ou DP.
2. Placez le boîtier à chambre des explants sur la platine du microscope. Avant de positionnement de la chambre de déplacer un objectif approprié en place. Nous recommandons d'utiliser un objectif chiffré d'air haute ouverture 20x (0,7 nd) pour l'imagerie initiale; nous recommandons using1.4 na objectifs du pétrole ou 40x 63x pour l'imagerie haute résolution et le suivi des grandes cellules champs. (Note: Une fois l'huile d'immersion est appliqué à l'utilisation de prudence lorsque vous utilisez l'objectif d'un objectif de l'air afin de ne pas plonger l'objectif par inadvertance dans l'huile.) Utiliser de petits poids pour maintenir la chambre en place.
3. Utilisez champ lumineux ou d'éclairage et de fluorescence d'ajuster la mise au point jusqu'à ce que vous voyez les extrémités apicales des cellules superficielles. Attention à ne pas "crash" l'objectif dans la base de la chambre. Évitez d'inclure ou de produire des bulles d'air lors de l'utilisation des objectifs à immersion d'huile. Une fois les échantillons sont positionnés en utilisant le mode «grossier» de positionnement, les changements au mode de positionnement «amende».
4. Recommandations pour l'optimisation de l'imagerie confocale en direct:
   1. Puissance du laser doit être maintenu aussi bas que possible: 1) pour empêcher le blanchiment, 2) pour prévenir les effets phototoxiques, et 3) pour éviter tout déclenchement accidentel du changement forme de la cellule ^7. Laser puissance exigence varie selon le niveau d'expression et le type de journalistes moléculaires exprimés dans les embryons.
   2. Utiliser un format de balayage de 1024 par 1024 pixels pour l'imagerie vivre comme il fournit bonne résolution d'image. Si vous avez besoin cadence très élevée (1,3 s minimum est pour notre système), puis utilisez le format de balayage de 512 par 512 pixels. Cela permettra de réduire la résolution d'image, mais peut encore être suffisante pour extraire quantité raisonnable d'informations.
   3. Ajuster la gamme spectrale de l'émission, dichroïques, filtres et d'excitation, le cas échéant.
   4. Ajustez le sténopé confocale à entre 1 et 1,5 unités d'Airy.
   5. Gain de photomultiplicateurs doit être maintenu à un niveau minimum pour réduire le bruit tout en fournissant un signal suffisamment pour identifier les structures cellulaires et la localisation des protéines.
   6. Ajustez le niveau de noir compensé pour régler le fond pour améliorer la qualité des images.
   7. Étapes (1) à (6) sont appliqués itérativement pour produire la meilleure qualité d'image possible. Qualité des images devrait permettre de résoudre la structure ou des protéines localisées avec des intensités des pixels sur une large plage dynamique. Si les analyses quantitatives sont le but devrait y avoir un nombre minimal de zéro intensité ou pixels saturés.
   8. Étapes (1), (3), (5), et (6) doivent être répétées pour chaque canal supplémentaire de fluorescence pour produire la meilleure qualité d'image pour les possibles.
   9. Lorsque deux d'imagerie ou de sondes fluorescentes, il est important de s'assurer qu'il n'y est minime transpercement spectrale d'une protéine à des spectres d'émission d'une protéine du second. Transpercement peuvent être testés en réduisant la puissance du laser excitant la première protéine et en observant le signal produit dans les longueurs d'ondes utilisées par la seconde protéine. Transpercement spectrale peut être réduit avec un choix plus restrictif des filtres ou en réduisant la puissance du laser utilisé pour l'excitation et l'augmentation du gain utilisé pour la détection de la première protéine.
5. Avec l'écoute confocale utilisant ces directives, il devrait être possible de capturer des images simples, à une profondeur focal unique en mode XY (figure 3A).
6. Si l'on s'intéresse à la collecte de time-lapse films d'un processus dynamique survenant telles que changer de forme pendant ⁷ contraction des cellules, on a le choix entre les modes alternatifs suivants confocale:
   1. XYT: Ce mode permet de collecter une série d'images au fil du temps, sans changer le plan Z. Nous utilisons ce mode d'observer les fluctuations endogènes dans les cellules épithéliales. Normalement, nous faisons l'acquisition d'une image toutes les 5 secondes pendant 20 minutes à observer des variations endogènes ou change de forme induite par une stimulation externe des cellules épithéliales. Choix de frame-rate est complètement dépendant de ce que l'on s'intéresse à l'observation et le dynamisme du processus.
   2. XYZ: Utiliser ce mode, on peut recueillir une seule série Z pile à travers les cellules épithéliales. Nos réglages par défaut de recueillir la série Z sont de 0,1 um étapes sur une plage de 5 um. Nous utilisons ce mode pour déterminer si des changements se produisent uniquement du cytosquelette à certaines positions, comme au niveau de l'jonctions adhérentes, ou partout dans le cortex cellulaire.
   3. XZT (figure 3A): Ce mode est principalement utilisé pour observer les changements rapides dans l'organisation apicale-basale de la cellule de l'épithélium. Ce mode est populaire pour son utilité en confirmant que le mode XYT est un journaliste fiable de l'évolution dans le domaine de la cellule apicale et que l'acquisition de l'image confocale n'est pas à la dérive le long de l'axe Z..
   4. Xyzt: Celui-ci combine les modes XYZ et XYT. Ce mode peut fournir des détails sur la riche pleine apicale-basale dynamique de l'épithélium mais elle est lente à acquérir des piles d'images complète et peut sérieusement réduire la viabilité cellulaire en raison de photoblanchiment et des effets phototoxiques.
7. La qualité d'image peut être améliorée dans une certaine mesure en utilisant un ou une combinaison des quatre approches suivantes: 1) une moyenne de ligne, 2) l'accumulation de ligne, 3) en moyenne cadre, et l'accumulation cadre 4). Ces modes de calcul de la moyenne d'acquisition d'images peut améliorer la qualité d'image, mais permettra de réduire la viabilité cellulaire et nécessitent plus de temps pour recueillir des images.
8. Avec tous les paramètres soigneusement ajustés, collecter et sauvegarder des images, la série Z, et les séries chronologiques de données pour un disque dur externe, un serveur USB mémoire bâton, ou connecté au réseau.
9. Une fois que vous êtes avez terminé votre expérience, inférieure à l'objectif de sécurité, de nettoyer l'huile de l'objectif et la platine du microscope optique avec un papier, et mise hors tension du système confocal.

Partie 4: Live-imagerie de la F-actine des microfilaments

Comme il a été montré dans la partie 3, la membrane de localiser des protéines mem-GFP peut être utilisée pour l'étiquette fluorescente membranes cellulaires. Live-imagerie du sous-cellulaire des composants est réalisée en utilisant d'autres protéines. Une protéine tels que moésine-GFP qui contient un domaine F-actine-liaison peut être utilisé pour étiqueter F-actine dans les cellules vivantes. Stratégies similaires pour imagerie des cellules vivantes et la collecte des time-lapse séquences de suivre les procédures décrites dans la partie 3. Live-imagerie F-actine implique des compétences de plus de la microscopie imagerie mem-GFP car les structures sont plus fines et plus étroitement localisée que la membrane. Par exemple, toute forme de petites bulles dans l'huile d'immersion peuvent produire des artefacts aberrations telles que le flou ou la luminosité variable dans l'image capturée. Par ailleurs, toute dérive dans la petite focale ou Z-plan peut provoquer moésine-GFP étiqueté F-actine corticale de se déplacer hors de discussion. Ainsi, on devrait être re-double d'efforts pour stabiliser la scène, l'explant, et la chambre tout en imagerie corticale F-actine et d'autres sub-cellulaire des protéines. Images XY et XZT montrant moésine-GFP étiqueté F-actine sont présentés comme des exemples (Fig. 3B et B ').

Partie 5: Image Analysis

Images et time-lapse séquences obtenues à partir de la session des cellules vivantes confocale peut être analysée afin de tester des hypothèses concernant les changements de forme ou de schémas de localisation de la protéine. L'œil nu est souvent le meilleur outil pour l'analyse qualitative, mais peut être augmentée ou automatisés par des techniques d'analyse d'images pour extraire des données quantitatives. Les données d'image à partir de systèmes confocaux Leica peuvent être sauvegardés dans un format ouvert tel que les fichiers TIF. Formatée ou l'image d'un format propriétaire. FRV qui conserve des informations détaillées sur l'état de microscope pendant l'acquisition. Les deux. TIF et les fichiers. FRV peuvent être importées directement par une image J analyse d'images librement disponibles du programme (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) en utilisant les formats de Bio-plug-in (Kevin Eliceiri, loci, University of Wisconsin, Madison, WI). Dans la section suivante, nous proposons deux exemples pour illustrer comment les utilisateurs pourraient commencer l'analyse quantitative des données d'image confocale.

1. Ouvrez n'importe quel fichier. TIF ou. FRV (Fig.4 A et A ') en utilisant Fichier> Ouvrir
2. Exemple 1: Mesurer la surface cellulaire d'une cellule épithéliale (Fig. 4B à B''').
   1. Sélectionnez dans la ZONE analyser les mesures SET>.
   2. Sélectionner un polygone-sélection de l'outil de la barre d'outils Image J, et décrire la cellule.
   3. Ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement de ANALYZE> Outils> Gestionnaire ROI et ajouter le contour de l'en appuyant sur [Ctrl-T], qui est le raccourci pour l'ajout de toute nouvelle "zone d'intérêt" ou ROI pour le gestionnaire de ROI. Il est important d'ajouter cette sélection et enregistrez-ROI jeu puisque vous pouvez revenir à une date ultérieure et rendre toute mesure autre paramètre. Définit des ROIs sauvé (cliquer sur "SAVE") peuvent être rechargées plus tard, pour analyse ultérieure.
   4. On peut répéter l'étape (c) avec n'importe quel nombre de cellules dans une image et ajouter le ROI d'un retour sur investissement Manager. Une fois qu'on a suffisamment de ROIs enregistré, cliquez sur "mesure" en ROI Manager. Dans la fenêtre de résultats, on peut désormais voir les zones contre les Rois. Dimensions de l'image ont des valeurs correspondantes dans les paramètres de mesure.
3. Exemple 2: Mesurer l'intensité d'une membrane cellulaire (Fig. 4C à C''').
   1. Sélectionnez "Straight line" outil de la barre d'outils Image J, et tracer une ligne sur l'image qui est perpendiculaire à la membrane cellulaire d'intérêt et traverse la membrane. Cette sélection ligne droite est un autre type de ROI et peut être ajouter à ROI Manager comme ci-dessus.
   2. Terrain intensités relatives en unités arbitraires par analyser le profil PARCELLE>. Sauvegarder cette image et que tant que la liste des valeurs en cliquant sur Enregistrer et LIST> Fichier> Enregistrer sous, respectivement sur la fenêtre PLOT.
4. Diverses mesures quantitatives peuvent être faites en utilisant Image J en fonction des intérêts des chercheurs et quelles hypothèses sont actuellement testées. Terrain Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) ou Sigma (Systat Software Inc, San Jose, CA) peut être utilisé pour tracer graphiquement les données. D'autres exemples en analyse d'images ont été présentées précédemment ^7.

Figure 1. Matières obligatoires. A) des outils nécessaires à la microchirurgie et l'assemblage de la chambre de culture. Boîte de Petri (a), lamelle de grande taille (b), des outils de cheveux (c), du diamant crayon (d), une pince (e), de la graisse de silicone "pistolet à calfeutrer" (f), la rondelle en nylon (g), et la culture en acrylique sur mesure chambre (h). B) Gros plan sur le couteau de cheveux, et une boucle de cheveux C).

Figure 2. Excision des explants bouchon d'origine animale. Un Schéma) de la manipulation de microchirurgie utilisé pour enlever un explant calotte animale (d, dorsale, v, ventrale; ah, animaux hémisphère; vh, végétal hémisphère). B) Schéma de l'explant (e) placé sous un fragment lamelle maintenu en place par la graisse de silicone (s) avec la surface apicale revêtue de la BSA verre enduit (g). L'explant est positionné de manière la couche épithéliale est plus proche de l'objectif du microscope (m). C) Animal bouchon explant (flèche rouge) est cultivée dans DFA et logé dans la chambre acrylique (flèche bleue) sur une lamelle de verre de grande taille (flèche noire) et maintenu en place par fragment lamelle de verre et de graisse de silicone.

Figure 3. Les cellules épithéliales observées en utilisant un microscope confocal. A) Une vue XY et XZ une (A ') Voir la localisation de la membrane GFP (mem-GFP) marqué feuille épithéliale. B) Une vue XY et XZ vue (B ') d'un moésine-GFP étiqueté F-actine du cortex cellulaire apicale.

Figure 4. L'analyse d'image en utilisant l'image J. A) l'image originale d'une membrane cellulaire GFP feuille de localiser étiquetés. Une vue à haute résolution (A ') de la boîte encart dans (A) montre deux "régions d'intérêt" ou ROI. Le contour jaune indique la limite d'une seule cellule sélectionnée en utilisant l'outil polygone (voir tableau B) et la ligne verte indique le chemin d'un profil d'intensité à travers une frontière entre cellules sélectionnées en utilisant l'outil en ligne droite (voir partie C). B ') Méthode pour sélectionner les options de mesure et choisissez "Zone" (B''). Une fois que le ROI est sélectionné, il peut être stocké dans le gestionnaire de ROI (B'''). C ') La méthode pour sélectionner les options de mesure pour le profil a pris. C'') Une fois la ligne droite ou un outil en ligne segmentée est choisi le profil d'intensité le long du chemin peut être tracé avec le «profil Plot" commande. Une liste des INTENSLes valeurs qualité peuvent également être enregistrés dans une forme de feuille de calcul lisible.

Discussion

Nous avons présenté les protocoles expérimentaux utilisés régulièrement dans notre laboratoire à l'image du cytosquelette qui change dynamiquement dans le cortex cellulaire apicale et oscillant membranes cellulaires des cellules épithéliales dans les embryons de Xénope. On ne devrait utiliser ces protocoles comme point de départ pour live-imagerie de formes de cellules épithéliales, l'optimisation de ce protocole est essentiel et certains paramètres changent selon le type d'un système de microscope a et le type de protéines on s'intéresse à l'imagerie . Ensemble, les étapes du protocole (isolement explant, l'imagerie et la visualisation des composants cellulaires et sub-cellulaire, et la méthodologie de quantification) fournir une méthode générale pour étudier la morphogenèse épithéliale.

Les aspects critiques à retenir

1. Il est important de préparer l'ARNm de haute qualité pour micro-injection dans des embryons. tubes ARNm sont stockés sur la glace pour éviter la dégradation. Une fois testés, les tubes sont stockés dans -80 ° C dans de petites aliquotes d'éviter de multiples cycles gel-dégel.
2. Il est essentiel d'injecter l'ARNm en plusieurs sites afin d'assurer une distribution uniforme de l'ARNm sur un large champ de cellules dans l'ectoderme bouchon d'origine animale.
3. Ajout d'antibiotique / antimycotique est essentiel pour la culture à long terme pour décourager la croissance bactérienne et fongique.
4. Des précautions doivent être prises tout en appuyant sur explants sous la lamelle fragments depuis plus-que-requis de pression peuvent casser les explants.
5. Alors que l'imagerie, les paramètres optimaux sont essentiels pour recueillir des données maximale avec la meilleure qualité d'image possible, qui reflète les comportements de cellules endogènes et la dynamique des protéines. Choisir les paramètres optimaux vient avec la pratique et l'expérience.
6. Pour analyser les images, nous recommandons fortement ImageJ. ImageJ est un excellente outil open-source qui peut être téléchargé et modifié avec l'ajout de macros personnalisées écrites ou téléchargé et plug-ins.