تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering, University of Pittsburgh, ²Developmental Biology, University of Pittsburgh

Summary

القيطم ظهائر الجنينية هي نموذج مثالي لنظام دراسة سلوكيات الخلية مثل التنمية وتغير شكل القطبية خلال التشكل الظهارة. ويتزايد الأنسجة التقليدية لعينات محددة يجري استكمالها التصوير الخلية الحية مبائر. هنا نظهر طرق لعزل الأنسجة الضفادع وتصور الخلايا الظهارية العيش والهيكل الخلوي وذلك باستخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.

Abstract

الخلايا الظهارية الجنينية بمثابة نموذج مثالي لدراسة التشكل حيث متعددة الخلايا الأنسجة تغيرات في الهندسة الخاصة بهم ، مثل التغيرات في المنطقة وارتفاع سطح الخلية الخلية ، وفيها خلايا الخضوع الانقسام والهجرة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا تنظيم الخلايا الظهارية الحركات التخلق في الأنسجة المجاورة

Protocol

قبل أن تبدأ

1. توج توليف مرنا من القالب الحمض النووي الترميز الخطي البروتين الموسومة fluorescently ومرنا تنقية بالطرق العادية (AmpliCap طقم النسخ ؛ Epicentre الحيوية ، ماديسون WI). وينبغي aliquoted مرنا للاستخدام مرة واحدة في 0.2 مل من أنابيب الطرد المركزي وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. وقد وصفت أساليب معيارية للحصول على البيض والتخصيب في المختبر ، والتخلص من معطف البيض سابقا ^2. وقد أظهر الإجراء للحصول على البيض من ضفدع المورق القيطم الإناث في وقت سابق ^3. إخصاب البويضات في المختبر مباشرة بعد الحصول عليها من الضفادع الإناث باستخدام الخصيتين المعزولة سابقا من الضفادع الذكور. دي هلام البيض 20 التسميد آخر دقيقة ، وحقن مرنا والبروتين والحمض النووي ، أو ديكستران فورا للسماح للنشر ما يكفي من الكواشف microinjected. حقن أكثر من 1 التسميد آخر ساعة كثيرا ما تفشل في نزع فتيل من موقع الحقن.
3. وقد تجلى microinjection البويضة سابقا ⁴ باستخدام ضغط صمام التحكم حاقن (PLI - 100 ، جهاز هارفارد). اتبع طريقة مماثلة لحقن mRNAs في نصف الكرة للأجنة الحيوانات الضفدع في 1 -- 4 خلايا المرحلة. نقل الأجنة المخصبة إلى Ficoll 3 ٪ (سيغما ، وسانت لويس MO) في 1X MBS (MBS - Ficoll) وmicroinject مع حجم المطلوب (2-4 NL) من توج مرنا GFP الترميز المستهدف لغشاء (MEM - GFP) أو F - الأكتين (وزارة التربية ، GFP). للحصول على توزيع حقن مرنا حتى في 4 مواقع متباعدة بالتساوي في القطب الحيواني. يمكن أن تبقى في الأجنة Ficoll MBS - لعدة ساعات ولكن يجب أن يتم نقلها إلى 1 / 3 × MBS قبل بدء تكون المعيدة.

المواد المطلوبة (وترد البنود التي تميزت * في الشكل 1) :

1. stereomicroscope تشريح مع الألياف البصرية الإضاءة. ينصح مرحلة تشريح تبريد لكن اختياري.
2. أدوات الشعر (الشعر والسكين حلقة الشعر) *.
3. ملقط (دومون الفولاذ المقاوم للصدأ # 5 ؛ أدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) *.
4. تعديل بارت لثقافة الجنين المالحة وسائل الإعلام (MBS ؛ 88 مم كلوريد الصوديوم ، و 2.4 ملي NaHCO ₃ ، 1 ملم بوكل ، 0.33 ملي CaCl ₂ ، 0.41 ملم (كانو _{3) 2} ، 0.82 ملي MgSO ₄ ، 10 HEPES ملم (H3375 ، سيغما الدريخ ، سانت لويس MO)).
5. Danilchik للثقافة وسائل الاعلام آمي ازدراع (DFA و 53 ملي مول كلوريد الصوديوم ₂ ، 5 ملي نا ₂ CO ₃ ، غلوكونات البوتاسيوم 4.5 ملم ، 32 ملم غلوكونات الصوديوم ، 1MM CaCl ₂ ، 1MM MgSO _4). وتشمل الأبقار مصل الزلال مع 0.1 ٪ DFA (BSA ؛ A7906 ، سيغما الدريخ). يجب أن تكون معقمة DFA تصفيتها ولكن يمكن aliquoted في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها على -20 درجة مئوية. وينبغي أن يضاف إلى DFA إذابة حديثا لمنع نمو البكتيريا أو الفطريات ، والمضادات الحيوية antimycotics (A5955 ، سيغما الدريخ 0.8 ٪ في وسائل الإعلام).
6. 60 أو 100 ملم أطباق بتري *.
7. تغطية واسعة من الزجاج ، و 45 بنسبة 50 ملم (12-544 - F ، # 1.5 ؛ فيشر العلمية ، هامبتون ، NH) *.
8. تغطية الزجاج الصغيرة ، و 24 بنسبة 40 ملم (12 - 544C ، # 1.5 ؛ فيشر العلمية).
9. سيليكون الشحوم (فراغ السامي ، داو كيميكال) تحميلها في حقنة "السد بندقية" *.
10. الاكريليك غرف مخصصة أو غسالات النايلون (شركة أجزاء صغيرة ؛ ميرامار ، فلوريدا) *. يمكن المضروب غرف مخصصة في صناعة الآلات من 25 بنسبة 50 في 5 ملم كتلة الاكريليك لتوفير الغرفة الداخلية التي هو 1.2 سم 2.8 سم. هذه الغرفة وحجم العمل من 1،68 ملم. ويمكن اختيار غسالات النايلون اختيارية في مجموعة متنوعة من الأحجام ، ونحن نفضل أحجام متوافقة مع 18 مم coverslips الزجاج الدائرية.
11. قلم الماس *.

الجزء 1 : استئصال explants سقف الحيوانية

1. ثقافة الأجنة إلى مرحلة المطلوب ⁵ في MBS × 1 / 3. يمكن التحكم في معدل درجات الحرارة في التنمية مع الثقافة ما بين 15 و 21 درجة مئوية بحيث يمكن القيام به التجارب في وقت مناسب من اليوم. ويمكن استخدام درجة حرارة الغرفة ولكن سوف تطور الأجنة بصورة أسرع.
2. نقل الأجنة إلى DFA.
3. إزالة الغشاء المحي باستخدام ملقط.
4. تحت تشريح المكوس ، stereomicroscope an يزدرع الغطاء الحيواني باستخدام السكاكين والشعر الشعر ⁶ حلقات. استخدام الشعر حلقة لدعم أو الاستمرار على الجنين في موقف والشعر السكين إلى إجراء شق صغير في القطب الحيواني من الأجنة. الاستخدام المتكرر "نفض الغبار ، خفض" مع سكين الشعر لإجراء شق 360 درجة لإزالة الغطاء الحيواني من الأديم الظاهر للجنين. مع الممارسة ، يمكن للمرء أن إجراء تخفيضات على نحو سلس في أضرار طفيفة نتيجة لازدراع أو خلايا lysed في الهامش (الشكل 2A).
5. كرر الخطوة 4 لاستئصال 3-4 explants سقف الحيوانية ، والشروع في الجزء 2. يجب على المرء أن يكون سريعا بينما قطع explants ، لأن لديهم ميل إلى الكرة بسرعة. ويمكن لمرحلة تشريح تبرد ببطء عملية أو بدلا من ذلك يمكنك ان تجعل أقل explants.

الجزء 2 : الغرف تحضير ، explants تحميل ، وختم الغرفة للثقافة على المدى الطويل

1. استخدمالشحوم سيليكون لالغراء أو ختم الغرفة الاكريليك على الزجاج تغطية كبيرة.
2. للحد من الالتصاق explants إلى معطف الزجاج الزجاج داخل غرفة مع الركيزة غير لاصقة التي تفرخ في غرفة لمدة 2 إلى 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع جيش صرب البوسنة 1 ٪ في MBS × 1 / 3 (BSA MBS -).
3. إعداد شظايا صغيرة ساترة (حوالي 2 من 8 مم) باستخدام قلم الماس. ما قبل معطف شظايا مع MBS - BSA.
4. شطف MBS - BSA من غرفة واستبدال وسائل الإعلام مع DFA.
5. المكوس الحيوانية يزدرع قبعة (ق) (الجزء 1 ؛ الشكل 2A) ونقلها الى قاعة المحكمة. موقف كل يزدرع باستخدام الشعر حلقة (مع الطبقة الظهارية يواجه الجزء السفلي من الغرفة) ، وإصلاح بلطف يزدرع في مكان مع كوب جزء ساترة اللمسات الصغيرة التي تحتفظ بها من الشحوم عالية الفراغ (الشكل 2B). كن حذرا جدا في حين الضغط على ساترة منذ الضغط المفرط يمكن تحطيم بسهولة ازدراع. يمكن تحميل explants متعددة في كل من المجلسين على أساس حجم ساترة شظايا صغيرة تستخدم لعقد explants في المكان. يمكن مع الممارسة يمكن تحميل ما يصل الى 20 explants الى غرفة الاكريليك وصفها هنا. ملء الغرف مع DFA حتى حتى مع فتح في الأعلى. استخدام الشحوم سيليكون لختم الجزء العلوي من الغرفة مع ال 24 بنسبة 40 ملم الزجاج غطاء. إضافة أو إزالة DFA للحد من فقاعات الهواء في غرفة مغلقة ، وتجاوز وصمة عار من الغرفة.
6. وسوف تسمح هذه الغرفة مغلقة الثقافة على المدى الطويل والتصوير الحية من الحيوان explants قبعة كبيرة من خلال سطح الزجاج أقل من الغرفة. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على السطح السفلي للزجاج غرفة خالية من الاوساخ والشحوم ، أو وسائل الإعلام للتصوير في وقت لاحق. نوصي إعداد الورق منشفة القاع أطباق بتري غرف لتخزين وانهم مستعدون للتصوير.

الجزء 3 : عالية الدقة المجهر مبائر الحية التصوير

وقد تم تطوير بروتوكول في هذا القسم لاستخدام مجهر مبائر المتاحة لدينا مختبر (لايكا TCS SP5 ؛ ايكا مايكروسيستمز ، بانوكبورن IL). قد مبائر المجاهر المختلفة تتطلب تعديل طفيف ، ونحن ننصح المستخدمين اتبع تعليماتهم التشغيل ذات الصلة.

1. السلطة حتى نظام التصوير ، وتهيئة المسرح المجهر ، وبدوره على الليزر المناسب لfluorophores ، أي ليزر الأرجون لفلوريسئين أو EGFP HeNe و 543 ليزر لرودامين أو طلب تقديم العروض.
2. مكان السكن حجرة explants على خشبة المسرح المجهر. قبل وضع الغرفة هدف التحرك المناسب في المكان. نوصي باستخدام عالية العددية الهدف فتحة الهواء 20X (0.7 غ) من أجل التصوير الأولي ؛ نوصي using1.4 غ أهداف النفط 63x 40x او التصوير عالية الدقة وتتبع خلية كبيرة المجالات. (ملاحظة : يتم تطبيق بمجرد غمر النفط إلى توخي الحذر عند استخدام الهدف هدفا الهواء حتى لا تراجع عن غير قصد الهدف في مجال النفط.) استخدام الأوزان الصغيرة لعقد الغرفة في مكانها.
3. استخدام الحقل أو مشرق مضان الإضاءة وضبط التركيز حتى تشاهد ينتهي قمية من الخلايا السطحية. يجب الحرص على عدم "تحطم" الهدف في قاعدة الغرفة. تجنب بما في ذلك المنتجة أو فقاعات الهواء عند استخدام الغمر أهداف النفط. مرة واحدة يتم وضع عينات باستخدام "الخشنة" واسطة لتحديد المواقع ، وتغير إلى "بخير" واسطة لتحديد المواقع.
4. توصيات لتوليف مبائر للتصوير العيش :
   1. يجب أن تبقى السلطة ليزر منخفضة بقدر الإمكان : 1) لمنع تبييض ، 2) لمنع التأثيرات الضوئية ، و 3) لمنع أي عرضي تسبب تغير شكل الخلية ^7. الليزر السلطة شرط تختلف تبعا لمستوى ونوع من التعبير للصحفيين الجزيئية التي أعرب عنها في الأجنة.
   2. استخدام تنسيق مسح من 1024 بواسطة 1024 بكسل للتصوير حي لأنها توفر دقة وضوح الصورة جيدة. إذا كنت في حاجة عالية جدا معدل الإطار (الحد الأدنى لنظامنا 1.3s) ، ثم استخدم تنسيق المسح من 512 من قبل 512 بكسل. هذا سوف يقلل من دقة الصورة ، ولكن يمكن أن تكون كافية لاستخراج كمية معقولة من المعلومات.
   3. ضبط النطاق الطيفي للانبعاث ، مزدوج اللون ، وإثارة المرشحات ، حسب الاقتضاء.
   4. ضبط الثقب مبائر إلى ما بين 1 و 1.5 وحدات إيري.
   5. يجب أن يبقى كسب مضخم على مستوى الحد الأدنى للحد من الضوضاء بعد توفر إشارة كافية لتحديد هياكل الخلية والترجمة البروتين.
   6. ضبط مستوى الأسود إزاحة لضبط الخلفية لتحسين نوعية الصور.
   7. يتم تطبيق الخطوات تكرارا (1) من خلال (6) لإنتاج صورة أفضل جودة ممكنة. وينبغي أن صورا عالية الجودة لحل بنية البروتينات أو المترجمة مع شدة بكسل على نطاق واسع دينامية. إذا التحليلات الكمية هي هدف يجب أن يكون هناك أعداد ضئيلة من شدة الصفر أو بكسل المشبعة.
   8. الخطوات التالية (1) ، (3) ، (5) ، و (6) هناك ضرورة لتكرارها لقناة كل مضان إضافية لإنتاج صورة ذات نوعية أفضل للممكن.
   9. عندما اثنين من التصوير أو تحقيقات الفلورسنت من المهم ضمان وجود نزيف من خلال الأطياف الحد الأدنى من البروتين لأطياف الانبعاثات بروتين الثاني. ويمكن اختبار تنزف من خلال طريق تقليل قوة الليزر مثيرة للبروتين الأولى ومراقبة الإشارات التي تنتج في موجات المستخدمة من قبل البروتين الثاني. وربما يتم تخفيض تنزف من خلال الطيفية مع اختيار أكثر تقييدا ​​من المرشحات أو من خلال تقليل قوة الليزر المستخدمة لزيادة الإثارة وكسب المستخدمة للكشف عن البروتين الأولى.
5. مع ضبطها مبائر باستخدام هذه المبادئ التوجيهية ينبغي أن يكون من الممكن التقاط صور واحدة على عمق اتصال واحدة في وضع XY (الشكل 3A).
6. إذا كان مهتما واحدة في جمع الوقت الفاصل بين الأفلام لعملية تحدث بشكل حيوي مثل تغير شكل الخلية خلال تقلص ⁷ ، يتعين على المرء أن يختار من صيغ بديلة مبائر التالية :
   1. XYT : هذا الوضع يسمح احد لجمع سلسلة من الصور على مر الزمن ، دون تغيير Z - الطائرة. نستخدم هذا الوضع لمراقبة التقلبات المحلية في الخلايا الظهارية. عادة ، ونحن الحصول على إطار واحد كل 5 ثوان على مدى 20 دقيقة لمراقبة التغير الذاتية أو التغييرات الناجمة عن الشكل الخارجي لتحفيز الخلايا الظهارية. اختيار معدل الإطار تعتمد اعتمادا كليا على ما يهتم احد في رصد وكيف ديناميكية العملية.
   2. XYZ : استخدام هذا الوضع ، فإننا يمكن أن تجمع واحد Z - كومة من خلال سلسلة الخلايا الظهارية. الإعدادات الافتراضية لدينا لجمع Z - سلسلة من الخطوات 0،1 ميكرون على طائفة من 5 ميكرون. نستخدم هذا الوضع لتحديد ما إذا كانت التغييرات التي تحدث هيكل الخلية فقط في مواقف معينة ، مثل عند مستوى تقاطعات الملتصقة ، أو في كل مكان في القشرة الخلية.
   3. XZT (الشكل 3A ') : يستخدم هذا النمط أساسا لمراقبة التغيرات السريعة في تنظيم قمية - القاعدية من خلية في الظهارة. هذا الوضع الشعبي لفائدته في تأكيد أن وضع XYT مراسل موثوق بها من تغيرات في المجال خلية قمية وبأن الحصول على الصور مبائر ليس الانجراف على طول محور Z.
   4. XYZT : هذا يجمع بين وسائط وXYT XYZ. هذا الوضع يمكن تقديم تفاصيل غنية عن ديناميات قمية - القاعدية الكامل للظهارة لكن بطيئة للحصول على صورة كاملة والمداخن يمكن أن تقلل بشدة بسبب بقاء الخلية photobleaching والتأثيرات الضوئية.
7. ويمكن تحسين جودة الصورة على نطاق محدود باستخدام واحد أو مزيج من الأساليب الأربعة التالية : 1) خط المتوسط ​​، 2) تراكم سطر ، 3) الإطار المتوسط ​​، و 4) تراكم الإطار. ويمكن لهذه الأوضاع في المتوسط ​​الحصول على الصور تحسين نوعية الصورة ولكن سوف يقلل قابلية الخلايا وتتطلب المزيد من الوقت لجمع الصور.
8. مع كل تعديل الإعدادات بعناية ، وجمع وحفظ الصور ، سلسلة Z ، وبيانات السلاسل الزمنية لقرص صلب خارجي ، خادم الذاكرة USB العصا ، أو المتصلة بالشبكة.
9. ذات مرة كنت قد أكملت تجربتك ، وانخفاض هدف للسلامة ، وتنظيف النفط من موضوعية ومرحلة المجهر مع ورقة العدسة ، والسلطة باستمرار نظام مبائر.

الجزء 4 : عيش التصوير من طراز F - أكتين microfilaments

كما هو مبين في الجزء 3 ، وإضفاء الطابع المحلي على غشاء البروتين يمكن GFP - ذاكرة يمكن استخدامها لتسمية fluorescently أغشية الخلايا. ويتحقق العيش التصوير شبه الخلوية المكونات باستخدام بروتينات أخرى. ويمكن استخدام البروتين مثل moesin - GFP الذي يحتوي على نطاق F - أكتين الملزمة لتسمية F - الأكتين في الخلايا الحية. استراتيجيات مماثلة للخلية الحية التصوير وجمع من الوقت الفاصل بين متواليات اتباع الإجراءات الواردة في الجزء 3. يعيش التصوير F - أكتين يشمل المزيد من المهارات من التصوير المجهري للذاكرة ، GFP منذ الهياكل هي أدق وأكثر إحكاما من المترجمة الغشاء. على سبيل المثال ، يمكن لأي فقاعات صغيرة في انتاج النفط الغمر التحف انحراف مثل عدم وضوح أو سطوع المتغير في الصورة الملتقطة. وعلاوة على ذلك ، يمكن لأي انحراف صغير في تنسيق أو Z - الطائرة تسبب moesin GFP - F - المسمى القشرية أكتين للتحرك خارج التركيز. وبالتالي ، ينبغي للمرء أن يكون إعادة مضاعفة الجهود لتحقيق الاستقرار في هذه المرحلة ، ازدراع ، والغرفة في حين أن التصوير القشرية F - أكتين وغيرها من البروتينات الخلوية الفرعي. وتظهر الصور XZT XY وتبين moesin GFP - F - أكتين المسمى كأمثلة (الشكل 3B و "باء).

الجزء 5 : تحليل صورة

ويمكن تحليل الصور ومتواليات الوقت الفاصل بين الحصول عليها من دورة الخلية الحية مبائر لاختبار الفرضيات المتعلقة يتغير شكل أو أنماط الترجمة البروتين. بالعين المجردة في كثير من الأحيان أفضل وسيلة لتحليل نوعي ولكن يمكن زيادتها أو آليا بواسطة تقنيات تحليل الصور لاستخراج البيانات الكمية. ويمكن حفظ بيانات الصورة من أنظمة مبائر ايكا في شكل مفتوح مثل. TIF تنسيق ملفات الصور أو تنسيق LIF الملكية. يحتفظ بمعلومات مفصلة عن حالة المجهر خلال الاستحواذ. كلا. TIيمكن F وملفات. LIF المستوردة مباشرة من قبل تحليل الصور متاح بحرية J صورة البرنامج (Rasband ، وكان ، ImageJ الأميركية ، والمعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا بولاية ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية ، http://rsb.info.nih.gov/ij / ، 1997-2009) باستخدام تنسيقات الحيوية المكونات في (كيفن Eliceiri ، الامكنه ، جامعة ويسكنسون ، ماديسون ، ويسكونسن). في المقطع التالي نقدم مثالين لتوضيح كيفية المستخدمين قد يبدأ التحليل الكمي للبيانات الصور مبائر.

1. فتح أي ملف. LIF TIF أو (Fig.4 A و A ') باستخدام فتح ملف>
2. المثال 1 : قس منطقة خلية من الخلايا الظهارية (الشكل 4B باء ''').
   1. حدد المساحة في ANALYZE القياسات SET>.
   2. حدد المضلع أداة التحديد من شريط الأدوات صورة ياء ، والمخطط التفصيلي للخلية.
   3. فتح مدير دوروا من ANALYZE> أدوات MANAGER ROI> وإضافة مخطط لها عن طريق الضغط على [التحكم ر] ، والتي هي اختصار لإضافة أي جديد "منطقة اهتمام" أو العائد على الاستثمار إلى إدارة العائد على الاستثمار. من المهم إضافة هذا التحديد وحفظ ROI - تعيين حيث يمكنك العودة في وقت لاحق وإجراء أي قياسات المعلمة الأخرى. يمكن إعادة حفظ مجموعات من رويس (انقر على "حفظ") في وقت لاحق لمزيد من التحليل.
   4. يمكن للمرء أن تكرار الخطوة (ج) مع أي عدد من الخلايا في صورة وإضافة إلى إدارة ROI رويس. مرة واحدة قد تكفي رويس المسجلة ، انقر على "التدبير" في إدارة العائد على الاستثمار. في إطار النتائج ، ويمكن للمرء أن يرى الآن ضد المناطق رويس. أبعاد الصورة والقيم المناظرة في معلمات القياس.
3. مثال 2 : قياس كثافة غشاء الخلية (الشكل 4C إلى C ''').
   1. حدد "خط مستقيم" الأداة من شريط الأدوات صورة ياء ، ورسم خط على الصورة التي هو عمودي على غشاء الخلية من الاهتمام والصلبان الغشاء. هذا التحديد الخط المستقيم هو نوع آخر من عائد الاستثمار ، ويمكن إضافة إلى إدارة العائد على الاستثمار على النحو الوارد أعلاه.
   2. مؤامرة كثافة نسبية في وحدات التعسفي من قبل ANALYZE التخصيصات مؤامرة>. حفظ هذه الصورة وكما وقائمة من القيم التي SAVE النقر و> قائمة ملف> حفظ باسم على التوالي إطار المؤامرة.
4. ويمكن إجراء القياسات المختلفة وذلك باستخدام كمية J صورة اعتمادا على المصالح الباحثين وما يجري اختبار الفرضيات. يمكن استخدام Microsoft اكسل (مايكروسوفت كوربوريشن ، سياتل ، واشنطن) أو قطعة سيغما (Systat البرمجيات ، وشركة سان خوسيه ، كاليفورنيا) لرسم البيانات بيانيا. وقدمت أمثلة إضافية في تحليل الصور سابقا ^7.

الشكل 1. المواد المطلوبة. أ) الأدوات اللازمة لالمجهرية والجمعية العامة للغرفة الثقافة. طبق بتري (أ) ، زلة كبيرة الغطاء (ب) ، وأدوات الشعر (ج) ، قلم الماس (د) و ملقط (ه) ، الشحوم سيليكون "السد بندقية" (و) ، غسالة النايلون (ز) ، والعرف الثقافة الاكريليك الغرفة (ح). ب) عن قرب السكين الشعر ، وجيم) حلقة الشعر.

الشكل 2. استئصال explants الغطاء الحيواني. التخطيطي) من التلاعب المجهرية المستخدمة لإزالة الغطاء يزدرع الحيوانية (د ، الظهرية ، ت ، بطني ، آه ، حيوان نصف الكرة الأرضية ؛ VH ، نباتية نصف الكرة الأرضية). ب) رسم تخطيطي للازدراع (ه) وضعه تحت شظية ساترة في مكانها بواسطة الشحوم سيليكون (s) مع السطح القمي apposed على الزجاج المطلي BSA (ز). يتم وضع يزدرع ذلك هو الأقرب إلى الطبقة الظهارية الهدف المجهر (م). C) هو المثقف الحيوانية سقف ازدراع (السهم الأحمر) في وزارة الشؤون الخارجية في مجلس النواب يضم الاكريليك (السهم الأزرق) على ساترة زجاجية كبيرة (السهم الأسود) والذي عقد في مكان بواسطة قطعة زجاجية ساترة والشحوم سيليكون.

الشكل 3. الخلايا الظهارية وحظ باستخدام المجهر مبائر. أ) عرض وXY (A ') XZ رأي GFP غشاء توطين (MEM - GFP) المسمى رقة الظهارية. ب) عرض XY وعرض XZ (B ') لmoesin GFP - F - أكتين المسمى قمية قشرة الخلية.

الشكل 4. تحليل الصور باستخدام صورة J. A) صورة الأصل من ورقة غشاء الخلية المسمى GFP توطين. وعرض وارتفاع القرار (A ') من مربع أقحم في الفقرة (أ) يبين اثنين" مناطق المصالح "أو رويس. مخطط أصفر يدل على الحدود من خلية واحدة مختارة باستخدام أداة المضلع (انظر اللوحة ب) والخط الأخضر يشير إلى مسار ملف تعريف كثافة عبر الحدود الخلية الخلية المحددة باستخدام أداة خط مستقيم (انظر لوحة C). ب ') طريقة لتحديد الخيارات واختيار القياس" المنطقة "(B''). مرة واحدة يمكن أن يتم تحديد العائد على الاستثمار يمكن تخزينه في إدارة عائدات الاستثمار (B '''). 'C) أحاطت طريقة لتحديد الخيارات لقياس الشخصية. C '') وبمجرد اختيار خط مستقيم أو مجزأة أداة يمكن رسم خط ملف كثافة على طول الطريق مع الأمر" مؤامرة الشخصية ". قائمة intensويمكن أيضا القيم إيتي يتم حفظها في شكل جدول للقراءة.

Discussion

قدمنا ​​البروتوكولات التجريبية تستخدم بانتظام في المختبر لتغيير صورة الهيكل الخلوي حيوي في القشرة خلية قمية وتتأرجح أغشية الخلايا من الخلايا الظهارية في أجنة القيطم. ينبغي للمرء أن استخدام هذه البروتوكولات كنقطة انطلاق للتصوير يعيش من الأشكال الخلايا الظهارية ؛ الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول هو أمر ضروري وبعض الإعدادات سوف تتغير تبعا لنوع النظام المجهر أحد لديه وتهتم نوع من البروتينات واحدة في التصوير . معا ، والخطوات البروتوكول (يزدرع العزلة ، والتصوير والتصور المكونات الخلوية وشبه الخلوية ، ومنهجية القياس الكمي) توفير إجراء دراسة شاملة لالتشكل الظهارة.

الجوانب الحاسمة لنتذكر

1. من المهم أن تعد ذات جودة عالية لمرنا الدقيقة الحقن في الأجنة. يتم تخزين أنابيب مرنا على الجليد لتفادي التدهور. اختبار مرة واحدة ، يتم تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية في أصغر aliquots متعددة لتجنب تجميد أذاب دورات.
2. فمن الضروري ضخ مرنا في مواقع متعددة لضمان التوزيع العادل للمرنا أكثر من حقل كبير من الخلايا الحيوانية في الأديم الظاهر الغطاء.
3. إضافة مضاد حيوي / مضاد فطري ضروري للثقافة على المدى الطويل لتثبيط نمو البكتيريا والفطريات.
4. يجب توخي الحذر أثناء الضغط explants تحت شظايا ساترة منذ بأكثر من المطلوب الضغط يمكن سحق explants.
5. بينما التصوير ، وإعدادات الأمثل ضرورية لجمع البيانات القصوى مع نوعية أفضل صورة ممكنة تعكس سلوكيات الخلية المحلية والديناميات البروتين. اختيار الإعدادات المثلى يأتي مع الممارسة والخبرة.
6. لتحليل الصور نوصي بشدة ImageJ. ImageJ هي ممتازة مفتوحة المصدر الأداة التي يمكن تحميلها وتعديلها مع اضافة وحدات الماكرو المخصصة مكتوبة أو تنزيلها والمكونات الإضافية.