Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering, University of Pittsburgh, ²Developmental Biology, University of Pittsburgh

Summary

Xenopus embryonala epitel är ett idealiskt modellsystem för att studera celler beteenden såsom polaritet utveckling och form ändras under epiteliala morfogenes. Traditionell histologi av fast prov i allt högre grad kompletteras med live-cell konfokala imaging. Här visar vi metoder för att isolera groda vävnader och visualisera leva epitelceller och cytoskelettet med live-cell konfokalmikroskopi.

Abstract

Embryonala epitelceller tjäna som en idealisk modell för att studera morfogenes där flercelliga vävnader genomgår förändringar i sin geometri, till exempel förändringar i cellernas yta och cell höjd, och där celler genomgår mitos och migrera. Dessutom kan epitelceller reglerar också morfogenetiska rörelser i intilliggande vävnad

Protocol

Innan du börjar

1. Syntetisera tak mRNA från linjäriserade DNA-mall som kodar för fluorescerande taggade proteinet och rena mRNA med standardmetoder (AmpliCap Transkription set, Epicentrum Biotechnologies, Madison WI). mRNA bör alikvoteras för enda gång använda i 0,2 rör ml centrifugrör och förvaras vid -80 ° C.
2. Standardmetoder för att få ägg, provrörsbefruktning, och avlägsnande av ägget pälsen har beskrivits tidigare ^2. Ett förfarande för att få ägg från en Xenopus laevis kvinnlig groda har visats tidigare ^3. Befrukta ägg in vitro omedelbart efter att ha inhämtat dem från hongrodor använda testiklarna tidigare isolerade från en manlig groda. De-gelé ägg 20 minuter efter befruktning och injicera mRNA, protein, DNA eller dextran omedelbart att ge tillräcklig spridning av idag injiceras reagenser. Injektioner mer än 1 timme efter befruktningen misslyckas ofta diffusa från injektionsstället.
3. Äggcellen mikroinjektion har visats tidigare ⁴ med hjälp av en tryck-ventil styrd insprutare (PLI-100, Harvard Apparatus). Följ en liknande metod för att injicera mRNA i djuret halvklotet av groda embryon vid 1 - till 4-cell skede. Överföring befruktade embryon till 3% Ficoll (Sigma, St Louis MO) i 1x MBS (MBS-Ficoll) och microinject med önskad volym (2 till 4 NL) av det utjämnade mRNA kodning GFP inriktas på att membran (MEM-GFP) eller F -aktin (Moe-GFP). För att få jämn fördelning injicera mRNA vid 4 jämnt fördelade platser i djuret stolpen. Embryon kan vara kvar i MBS-Ficoll i flera timmar utan att behöva överföras till 1 / 3 x MBS innan gastrulation börjar.

Krävs material (artiklar markerade med * visas i figur 1.)

1. Dissection stereomikroskop med fiberoptisk belysning. En kyld dissektion skede rekommenderas men är valfritt.
2. Hår verktyg (hår kniv och hår slinga) *.
3. Tång (Dumont # 5 rostfritt stål; Fine Science Tools, Foster City, CA) *.
4. Modifierad Barth Saline embryo odlingsmedia (MBS, 88 mM NaCl, 2,4 mm NaHCO _3, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,41 mM (Cano _{3) 2,} 0,82 mM MgSO _4, 10 mm HEPES H3375 (, Sigma-Aldrich, St Louis MO)).
5. Danilchik är för Amy Explantation odlingsmedia (DFA, 53 mM NaCl _2, 5 mm Na ₂ CO _3, 4,5 mm Kalium glukonat, 32 mm Natriumglukonat, 1mm CaCl _2, 1 mm MgSO _4). Inkludera 0,1% bovint serumalbumin med DFA (BSA, A7906, Sigma-Aldrich). DFA måste vara sterila filtreras men kan alikvoteras i 50 ml koniska rör och förvaras vid -20 ° C. Antibiotika och antimykotika (0,8% i medierna, A5955, Sigma-Aldrich) bör läggas till nyligen tinas DFA för att förhindra bakterie-eller svamptillväxt.
6. 60 eller 100 mm petriskålar *.
7. Stora skyddsglas, 45 med 50 mm (12-544-F, # 1,5, Fisher Scientific, Hampton, NH) *.
8. Små skyddsglas, 24 med 40 mm (12-544C, # 1,5, Fisher Scientific).
9. Silikonfett (High Vacuum, Dow Chemical) laddas in i en spruta "fogtätning-gun" *.
10. Anpassad akryl kammare eller nylon brickor (små delar Inc.; Miramar, FL) *. Anpassad kammare kan fräses i en mekanisk verkstad från en 25 med 50 med 5 mm akryl blocket för att ge en inre kammare som är 1,2 cm x 2,8 cm. Denna kammare har en arbetsgrupp volym av 1,68 ml. Valfri nylon brickor kan väljas i olika storlekar, vi föredrar storlekar som är kompatibla med 18 runda mm glas täckglas.
11. Diamond penna *.

Del 1: Excision av explants djur mössa

1. Kultur embryon till önskad steg ⁵ i 1 / 3 x MBS. Graden av utveckling kan styras med kultur temperaturer mellan 15 och 21 ° C så att experimenten kan göras vid en lämplig tidpunkt på dagen. Rumstemperatur kan användas, men embryon kommer att utvecklas snabbare.
2. Överför embryon till DFA.
3. Ta bort vitelline membran med hjälp av pincett.
4. Enligt dissekera stereomikroskop, punktskatter ett djur cap Explantation med hår-knivar och hår-slingor ^6. Använd hår-loop för att stödja eller hålla embryot till en position och hår-kniv för att göra ett litet snitt i djuret pol embryon. Använd upprepade "flick-snitt" med hår-kniv för att göra en 360 ° snitt för att ta bort ektoderm djuret locket från embryot. Med övning kan man göra släta nedskärningar som leder till minimala skador på explantation eller lyserade celler på marginalen (Fig. 2A).
5. Upprepa steg 4 till punktskatt 3 till 4 explants djur locket och fortsätt till del 2. Man måste vara snabb och samtidigt minska explants, eftersom de har en tendens att klumpa ihop sig upp snabbt. En kyld dissektion skede kan bromsa processen eller alternativt kan du göra färre explants.

Del 2: Förbered kammare, explants belastning och försegla kammaren för långsiktig kultur

1. Användsilikonfett att limma eller tejpa akryl kammaren till stora skyddsglas.
2. För att minska vidhäftning explants mot glaset pälsen glaset i kammaren med en icke-självhäftande substrat genom inkubering av kammare för 2 till 4 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C med 1% BSA i 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
3. Förbered små täckglas fragment (ca 2 till 8 mm) med en diamant penna. Pre-coat fragment med BSA-MBS.
4. Skölj BSA-MBS från kammaren och ersätta media med DFA.
5. Punktskatter djur cap Explantation (s) (del 1,. Figur 2A) och transfer till kammaren. Placera varje Explantation med en hår-slinga (med epitelial skikt mot botten av kammaren) och försiktigt fixera Explantation på plats med ett glas täckglas fragment hos små sandskädda av högt vakuum fett (Fig. 2B). Var mycket försiktig när du trycker på täckglas eftersom högt tryck kan lätt krossa Explantation. Flera explants kan laddas in varje kammare baserat på storleken av den lilla täckglas fragment används för att hålla explants på plats. Med övning upp till 20 explants kan laddas in i akryl kammaren beskrivs här. Fyll kammare med DFA tills även med öppningen upptill. Använd silikonfett för att täta toppen av kammaren med 24 med 40 mm skyddsglas. Lägg till eller ta bort DFA för att minska luft-bubblor i sluten kammare och blot overflow från kammaren.
6. Detta sluten kammare gör att långsiktiga kultur och live-avbildning av explants djur locket genom de stora, lägre glasytan på kammaren. Det är avgörande att hålla den lägre glasytan kammaren fri från smuts, fett, eller media för senare avbildning. Vi rekommenderar förbereder pappers-handduk botten petriskålar att lagra kammare som de är förberedda för avbildning.

Del 3: Högupplösta lever-imaging konfokalmikroskopi

Protokollet i detta avsnitt har utvecklats för att använda ett konfokalmikroskop tillgängliga för våra labb (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Bannockburn IL). Olika konfokala mikroskop kan behöva justeras något och vi rekommenderar att användarna följer sina respektive bruksanvisning.

1. Uppstart av bildsystem, initiera mikroskop scenen och slå på lasrar lämpliga för fluoroforer, dvs Argon laser för fluorescein eller EGFP och 543 HeNe laser för Rhodamine eller offertförfrågan.
2. Placera kammaren bostäder explants på mikroskop scenen. Innan placering i kammaren flytta ett lämpligt mål på plats. Vi rekommenderar att du använder en hög numerisk bländare 20x luft mål (0,7 NA) för inledande bildbehandling; vi rekommenderar using1.4 NA 40x eller 63x olja mål för högupplöst bildbehandling och spårning stor cell-fält. (Notera: När immersionsolja används till målet iaktta försiktighet vid användning en luft objektiv så att du inte oavsiktligt dopp målet i oljan.) Använd små vikter för att hålla kammaren på plats.
3. Använd ljus-fält eller fluorescens belysning och justera fokus tills du ser den apikala ändar ytliga cellerna. Var noga med att inte "Crash" målet i kammaren basen. Undvik att inkludera eller producerar luftbubblor när man använder målen oljeimmersion. När proverna är placerade med "grov" positionering läget kan du ändra den "fina" positionering läge.
4. Rekommendationer för att stämma konfokala för live imaging:
   1. Lasereffekt bör hållas så låg som möjligt: ​​1) för att förhindra blekning, 2) för att förhindra fototoxisk effekter, och 3) för att förhindra oavsiktlig utlösning av cell formen förändring ^7. Laser-effektbehov varierar beroende på uttrycket nivå och typ av molekylära reportrar som uttrycks i embryon.
   2. Använd en genomsökning format 1024 x 1024 pixlar för live imaging, eftersom det ger bra bildupplösning. Om du behöver mycket hög bildhastighet (minimum är 1.3s för vårt system), använd sedan scanna format 512 av 512 pixlar. Detta kommer att minska bildens upplösning, men kan ändå vara tillräckligt för att utvinna en rimlig mängd information.
   3. Justera spektralområdet utsläpp, dikroiskt och excitation filter som är lämpligt.
   4. Justera konfokala hål till mellan 1 och 1,5 Airy enheter.
   5. Fotomultiplikatorrör vinna måste hållas på en miniminivå för att minska buller ändå ge tillräcklig signal för att identifiera cellstrukturer och protein lokalisering.
   6. Justera svärta offset för att justera bakgrunden för att förbättra kvaliteten på bilderna.
   7. Steg (1) till (6) är iterativt används för att producera den bästa möjliga bild. Kvalitet bilder bör lösa strukturen eller lokaliserade proteiner med pixel intensiteter över ett brett dynamiskt omfång. Om kvantitativa analyser är målet att det bör vara minimal antal noll-intensitet eller mättade pixlar.
   8. Steg (1), (3), (5), och (6) måste upprepas för varje ytterligare fluorescens kanal att producera den bästa bilden för möjligt.
   9. När avbildning två eller fluorescerande prober är det viktigt att säkerställa att det är minimal spektral genomblödning från ett protein till en andra proteinets emissionsspektra. Genomblödning kan testas genom att minska lasereffekten spännande första protein och observera signaler som produceras i våglängder som används av andra proteiner. Spectral genomblödning kan minskas med mer restriktiva val av filter eller genom att minska lasereffekten används för excitation och öka vinsten används för detektion av det första proteinet.
5. Med konfokala inställda med hjälp av dessa riktlinjer bör det vara möjligt att ta enstaka bilder på en och samma skärpedjup i XY-läge (Fig. 3A).
6. Om man är intresserad av att samla in time-lapse filmer av ett dynamiskt förekommande process som form ändras under cell kontraktion ^7, måste man välja mellan följande alternativ konfokala lägen:
   1. XYT: Detta läge tillåter en att samla en serie bilder över tid, utan att ändra Z-planet. Vi använder detta läge för att observera de endogena variationer i epitelceller. Normalt skaffa vi en bild varje 5 sekunder över 20 minuter att observera endogena variation eller ändrar form som orsakas av yttre stimulering av epitelceller. Val av frame-rate är helt beroende på vad man är intresserad av att observera och hur dynamiska processen.
   2. XYZ: Med detta läge kan vi samla in en enda Z-serien stacken genom epitelceller. Vår standardinställningarna för att samla in Z-serien är 0,1 ìm steg över en rad av 5 ìm. Vi använder det här läget för att avgöra om cytoskelettala förändringar sker bara vid en viss position, till exempel i nivå med de adherens korsningar, eller överallt i cellen cortex.
   3. XZT (Fig. 3A): Detta läge är huvudsakligen används för att observera snabba förändringar i den apikala-basala organisation av celler i epitelet. Detta läge är populär för sin nytta i att bekräfta att XYT läget är en pålitlig reporter av förändringar i den apikala cellen domänen och att konfokala bilden förvärvet inte är drivande längs z-axeln.
   4. XYZT: Detta kombinerar XYZ och XYT lägen. Detta läge kan ge rik information om hela apikala-basala dynamiken i epitel, men går långsamt att få hela bilden stackar och kan drastiskt minska cellviabiliteten grund fotoblekning och fototoxiska effekter.
7. Bildkvaliteten kan förbättras i begränsad omfattning genom att använda en eller en kombination av följande fyra metoder: 1) rad utjämning, 2) linje ackumulering, 3) ram i genomsnitt, och 4) ram ackumulering. Dessa genomsnitt lägen för bildtagning kan förbättra bildkvaliteten, men kommer att minska cellviabiliteten och kräver mer tid att samla bilder.
8. Med alla inställningar justeras noggrant, samla in och spara bilder, Z-serien och tidsserier data till en extern hårddisk, USB-minne, eller nätverksansluten server.
9. När du är har avslutat ditt experiment, sänka målet för säkerheten, rena oljan från de objektiva och mikroskopet scenen med linspapper, och power-ner konfokala systemet.

Del 4: Live-avbildning av F-aktin microfilaments

Som har visats i del 3, med-GFP membranet lokalisera proteinet kan användas för att fluorescerande etikett cellmembran. Live-avbildning av sub-cellulära komponenter uppnås med hjälp av andra proteiner. Ett protein som moesin-GFP som innehåller en F-aktin-bindande domän kan användas för att märka F-aktin i levande celler. Liknande strategier för live-cell imaging och insamling av Time-lapse-sekvenser följa de procedurer som beskrivs i del 3. Live-avbildning F-aktin omfattar mer mikroskopi kompetens än avbildning med-GFP eftersom strukturerna är finare och tätare lokal än membranet. Till exempel kan alla små bubblor i immersionsolja producera aberration artefakter såsom dimsyn eller variabel ljusstyrka i den tagna bilden. Dessutom kan någon liten drift i den centrala eller Z-planet orsaka moesin-GFP märkt kortikala F-aktin att flytta utanför fokus. Därför bör man vara fördubbla ansträngningarna för att stabilisera scenen, Explantation och kammaren medan imaging kortikala F-aktin och andra sub-cellulära proteiner. XY och XZT bilder som visar moesin-GFP märkt F-aktin visas som exempel (Fig. 3B och B).

Del 5: bildanalys

Bilder och Time-lapse-sekvenser fås från live-cell konfokala session kan analyseras för att testa hypoteser om de formförändringar eller mönster av protein lokalisering. Blotta ögat är ofta det bästa verktyget för kvalitativ analys, men kan ökas eller automatiserade genom metoder bildanalys för att extrahera kvantitativa data. Bilddata från Leica konfokala system kan sparas i ett öppet format som. TIF-formaterade bildfiler eller en egen. LIF format som behåller detaljerad information om mikroskopet tillstånd under förvärvet. Både och. TIF och. LIF-filer kan importeras direkt av en fritt tillgänglig bildanalys programmet Bild J (Rasband, var ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) med Bio-format plug-in (Kevin Eliceiri, Loci, University of Wisconsin, Madison, WI). I följande avsnitt erbjuder vi två exempel för att illustrera hur användare kan börja kvantitativ analys av konfokala bilddata.

1. Öppna ett. TIF eller. LIF-fil (Fig. 4 A och A ') med hjälp av Arkiv> Öppna
2. Exempel 1: Mät cellen området en epitelceller (Fig. 4B till B''').
   1. Välj område i ANALYSERA> SET mätningar.
   2. Välj polygon-markeringsverktyg från Image J verktygsfältet och beskriver hur cellen.
   3. Öppna ROI Manager från ANALYSERA> Verktyg> ROI MANAGER och lägga konturerna till den genom att trycka [Ctrl-t], som är en genväg för att lägga till några nya "regionen av intresse" eller ROI på ROI Manager. Det är viktigt att lägga till detta val och spara ROI-set eftersom du kan gå tillbaka vid ett senare tillfälle och göra någon annan parameter mätningar. Ställer sparade ROI (klicka på "Spara") kan laddas om senare för vidare analys.
   4. Man kan upprepa steg (c) med valfritt antal celler i en bild och lägga till ROI på ROI Manager. När man har tillräcklig ROI in, klicka på "åtgärd" i ROI Manager. I fönstret Resultat kan man se nu OMRÅDEN mot ROI. Bild dimensioner har motsvarande värden i mått.
3. Exempel 2: mäta graden av ett cellmembran (Fig. 4C till C''').
   1. Välj "Straight line" verktyg från Image J verktygsfältet och dra en linje på bilden som är vinkelrät mot cellmembranet av intresse och korsar membranet. Denna raka linje urval är en annan typ av ROI och kan lägga till ROI Manager enligt ovan.
   2. Tomt relativa intensiteterna i arbiträra enheter med ANALYSERA> PLOT PROFIL. Spara som bild och som värdelista genom att klicka på Save och LISTA> Arkiv> Spara som respektive på tomten fönstret.
4. Olika kvantitativa mätningar kan göras med Image J beroende på forskarnas intressen och vilka hypoteser testas. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) eller Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA) kan användas för att rita data grafiskt. Ytterligare exempel i bildanalys har presenterats tidigare ^7.

Figur 1. Material som behövs. A) Verktyg som behövs för mikrokirurgi och montering av kulturen kammaren. Petriskål (a), stort täckglas (b), verktyg hår (c), diamant blyerts (d), pincett (e), silikonfett "fogtätning gun" (f), nylon bricka (g), och anpassade akryl kultur kammare (h). B) Närbild på håret kniv, och C) hår slinga.

Figur 2. Excision av explants djur mössa. A) Schematisk bild av mikrokirurgisk manipulation används för att avlägsna en explantation djur cap (d-, bröst-, v, ventral, ah, djur halvklotet, vh, vegetabiliskt halvklotet). B) Schematisk bild av Explantation (e) placeras under ett täckglas fragment hålls på plats av silikonfett (s) med apikala ytan apposed till BSA belagt glas (g). Den Explantation är placerad så att epiteliala lagret är närmast mikroskop målet (m). C) animaliska cap Explantation (röd pil) är odlade i DFA och inrymt i akryl kammaren (blå pil) på ett stort glas täckglas (svart pil) och hålls på plats av glas täckglas fragment och silikonfett.

Figur 3. Epitelceller observerats med hjälp av konfokalmikroskop. A) En XY visa och en XZ (A) syn på membranet lokalisera GFP (MEM-GFP) märkt epiteliala ark. B) en XY visa och XZ vy (B) i en moesin-GFP märkt F-aktin apikala cell cortex.

Figur 4. Bildanalys med Image J. A) Original bild av ett membran lokalisera märkt GFP cell ark. En högupplöst view (A) i rutan infällda i (A) visar två "regioner-av-intresse" eller ROI. Den gula-översikt visar gränsen för en enda cell väljs med hjälp av verktyget Polygon (se panel B) och gröna linjen visar vägen för en intensitet profil för en cell-cell gränsen väljs med rak linje verktyget (se panelen C). B) Metod för att välja mätning alternativ och välj "Area" (B''). När ROI väljs den kan lagras i ROI Manager (B'''). C ") Metoden för att välja mätning alternativ för profilen tog. C'') När rak linje eller segmenterade linjen verktyget är valt intensiteten profil längs vägen kan ritas med "Plot profil"-kommandot. En lista över intensIty värden kan också sparas i ett kalkylblad läsbar form.

Discussion

Vi har presenterat experimentell protokoll som används regelbundet i vårt labb för att bilden dynamiskt föränderliga cytoskelettet i apikala cellen cortex och oscillerande cellmembranen av epitelceller i Xenopus embryon. Man bör använda dessa protokoll som utgångspunkt för live-avbildning av epitelceller former, optimering av detta protokoll är viktigt och en del inställningar kommer att ändras beroende på vilken typ av mikroskop systemet man har och vilken typ av proteiner man är intresserad av bildbehandling . Tillsammans protokollet steg (Explantation isolering, bildbehandling och visualisering av cellulära och sub-cellulära komponenter, och kvantifiering metodik) om ett samlat förfarande för att studera epiteliala morfogenes.

Kritiska aspekter att komma ihåg

1. Det är viktigt att förbereda högkvalitativa mRNA för mikro-injektion i embryon. mRNA rören lagras på is för att undvika degradering. När provas, rören förvaras i -80 ° C i mindre portioner för att undvika flera frys-tö cykler.
2. Det är viktigt att injicera mRNA i flera sajter för att försäkra jämn fördelning av mRNA över ett stort område av celler i djurets locket ektoderm.
3. Tillägg av antibiotika / antimykotika är avgörande för långsiktig kultur att motverka bakterie-och svamptillväxt.
4. Man måste vara försiktig när du trycker explants under täckglas fragment sedan mer än önskat tryck kan krossa explants.
5. Medan avbildning, optimala inställningar är nödvändiga för att samla in maximal data med bästa möjliga bildkvalitet som speglar endogena celler beteenden och dynamik protein. Att välja optimala inställningar kommer med övning och erfarenhet.
6. Att analysera bilder vi rekommenderar ImageJ. ImageJ är ett utmärkt open-source verktyg som kan laddas ner och modifieras med tillägg av egna skrivna eller ladda ner makron och plug-ins.