Summary
Xenopus भ्रूण epithelia एक आदर्श मॉडल प्रणाली सेल polarity और उपकला morphogenesis के दौरान आकार बदलने के विकास के रूप में इस तरह के व्यवहार का अध्ययन कर रहे हैं. तय नमूनों की पारंपरिक ऊतक विज्ञान तेजी से रहते सेल confocal इमेजिंग द्वारा पूरित किया जा रहा है. यहाँ हम मेंढक ऊतकों को अलग करने और जीना उपकला कोशिकाओं और उनके cytoskeleton रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कल्पना तरीकों का प्रदर्शन.
Abstract
भ्रूण उपकला कोशिकाओं जहां बहु सेलुलर ऊतकों में कोशिका की सतह क्षेत्र और सेल ऊंचाई में परिवर्तन के रूप में में उनके ज्यामिति में परिवर्तन से गुजरना morphogenesis अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में सेवा है, और जहां कोशिकाओं को पिंजरे का बँटवारा गुजरना और विस्थापित. इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं को भी आसन्न ऊतकों में morphogenetic आंदोलनों को विनियमित कर सकते हैं
Protocol
इससे पहले कि आप शुरू करें
- Linearized डीएनए fluorescently टैग प्रोटीन और शुद्ध mRNA एन्कोडिंग मानक तरीकों (, Epicentre जैव प्रौद्योगिकी, मैडिसन WI AmpliCap ट्रांसक्रिप्शन किट) द्वारा टेम्पलेट से छाया mRNA synthesize. mRNA 0.2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एक बार उपयोग के लिए aliquoted होना चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
- मानक अंडे इन विट्रो निषेचन में, प्राप्त करने के तरीकों, और अंडे कोट के हटाने 2 पहले से वर्णित किया गया है. एक प्रक्रिया एक Xenopus laevis महिला मेंढक से अंडे प्राप्त पहले 3 प्रदर्शन किया गया. इन विट्रो में अंडे को तुरंत खाद महिला एक नर मेंढक से पहले अलग testes का उपयोग मेंढ़क से उन्हें प्राप्त करने के बाद. डी - जेली अंडे 20 मिनट के बाद निषेचन और mRNA, प्रोटीन, डीएनए, या dextran इंजेक्षन तुरंत microinjected अभिकर्मकों के पर्याप्त प्रसार की अनुमति के लिए. इंजेक्शन से अधिक 1 घंटे पोस्ट निषेचन अक्सर इंजेक्शन साइट से फैलाना असफल.
- Oocyte microinjection 4 पहले प्रदर्शित किया गया है एक दबाव वाल्व नियंत्रित इंजेक्टर (पीएलआई-100, हार्वर्ड उपकरण) का उपयोग . 4 सेल चरण - मेंढक भ्रूण के पशु गोलार्द्ध में mRNAs 1 में इंजेक्शन के लिए एक समान विधि का पालन करें. 1x एमबीएस (एमबीएस - Ficoll) में 3% Ficoll (सिग्मा, सेंट लुइस MO) निषेचित भ्रूण स्थानांतरण और छाया mRNA एन्कोडिंग GFP झिल्ली (सदस्य GFP) या एफ के लिए लक्षित की वांछित मात्रा (2 से 4 nl) के साथ microinject actin-(मो GFP). प्राप्त करने के लिए भी वितरण जानवर पोल में 4 समान रूप से दूरी स्थलों पर mRNA इंजेक्षन करने के लिए. भ्रूण एमबीएस - Ficoll में कई घंटे के लिए रहते हैं लेकिन gastrulation शुरू होने से पहले 1 / 3 एक्स एमबीएस को हस्तांतरित किया जा आवश्यकता कर सकते हैं.
आवश्यक सामग्री (* द्वारा चिह्नित आइटम चित्र में दिखाए जाते हैं 1.)
- फाइबर ऑप्टिक रोशनी के साथ विच्छेदन stereomicroscope. एक ठंडा विच्छेदन चरण सिफारिश की है, लेकिन वैकल्पिक.
- बालों उपकरण (बाल चाकू और बाल पाश) *.
- संदंश (Dumont # 5 स्टेनलेस स्टील, ललित विज्ञान उपकरण, फोस्टर शहर, सीए) *.
- संशोधित है बार्थ खारा भ्रूण संस्कृति मीडिया (एमबीएस, 88 मिमी NaCl 2.4 मिमी 3 NaHCO, 1 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.41 (3 Cano) मिमी 2, 0.82 मिमी 4 MgSO, 10 मिमी HEPES (H3375, सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस) एमओ).
- Danilchik एमी explant संस्कृति मीडिया (53 मिमी NaCl 2, 5 मिमी ना 2 3 सीओ, 4.5 मिमी पोटेशियम gluconate, 32 मिमी सोडियम gluconate, 1mm 2 CaCl, 1mm MgSO 4 DFA) के लिए . 0.1% गोजातीय सीरम albumin DFA (; A7906, सिग्मा Aldrich BSA) के साथ शामिल है. DFA फ़िल्टर बाँझ हो सकता है, लेकिन 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में aliquoted जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करना चाहिए एंटीबायोटिक्स और antimycotics (मीडिया में 0.8%, A5955, सिग्मा Aldrich) हौसले thawed DFA जोड़ा जाना चाहिए बैक्टीरियल या फंगल विकास को बाधित.
- 60 या 100 मिमी पेट्री डिश *.
- बड़े कवर, 50 मिमी (12-544-F #, 1.5, फिशर साइंटिफिक, Hampton, राष्ट्रीय राजमार्ग) द्वारा कांच 45 *.
- लघु कांच कवर, 40 मिमी (12-544C, 1.5 #; फिशर साइंटिफिक) द्वारा 24.
- सिलिकॉन तेल (उच्च वैक्यूम, डॉव केमिकल) एक सिरिंज "caulking बंदूक" में लोड *.
- कस्टम एक्रिलिक कक्षों या नायलॉन वाशर (लघु पार्ट्स इंक, Miramar, FL) *. कस्टम कक्षों से 25 एक एक मशीन शॉप में milled किया जा सकता है 50 से 5 मिमी एक्रिलिक ब्लॉक के लिए एक आंतरिक कक्ष है कि 2.8 सेमी से 1.2 सेमी है प्रदान के द्वारा. इस चैम्बर 1.68 मिलीलीटर की एक काम की मात्रा है. वैकल्पिक नायलॉन वाशर आकार के एक किस्म में चुना जा सकता है, हम आकार 18 मिमी व्यास परिपत्र कांच coverslips के साथ संगत पसंद करते हैं.
- डायमंड पेंसिल *.
भाग 1: जानवर टोपी explants के छांटना
- 1 / 3 एक्स एमबीएस में वांछित 5 चरण संस्कृति भ्रूण. विकास की दर 15 और 21 के बीच संस्कृति तापमान डिग्री सेल्सियस इतना है कि प्रयोगों दिन के सुविधाजनक समय पर किया जा सकता है है के साथ नियंत्रित किया जा सकता है. कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया जा सकता है भ्रूण अधिक तेजी से विकास होगा.
- DFA के लिए भ्रूण स्थानांतरण.
- Vitelline संदंश का उपयोग झिल्ली निकालें.
- विदारक stereomicroscope आबकारी, के तहत एक जानवर टोपी explant बाल चाकू और बाल - छोरों 6 का उपयोग कर. बाल पाश उपयोग के लिए समर्थन के लिए या एक स्थिति और बाल चाकू जानवर भ्रूण के पोल में एक छोटा सा चीरा बनाने में भ्रूण पकड़. भ्रूण से पशु टोपी बाह्य त्वक स्तर निकालने के लिए एक 360 ° चीरा बनाने के लिए दोहराया बाल चाकू के साथ "झटका कटौती" का प्रयोग करें. अभ्यास के साथ, एक चिकनी explant या मार्जिन पर lysed कोशिकाओं (2A छवि) के लिए कम से कम नुकसान में परिणाम है कि कटौती कर सकते हैं.
- 4 पशु टोपी explants 3 आबकारी दोहराएँ कदम 4 और भाग 2 के लिए आगे बढ़ना. एक त्वरित explants काटने, जबकि चाहिए क्योंकि वे जल्दी से गेंद को एक प्रवृत्ति है. एक ठंडा विच्छेदन चरण की प्रक्रिया धीमी गति से या वैकल्पिक रूप से आप कम explants कर सकते हैं कर सकते हैं.
भाग 2: तैयार करें कक्षों, लोड explants, और सील दीर्घकालिक संस्कृति के लिए कक्ष
- प्रयोगसिलिकॉन गोंद को तेल या बड़े कांच कवर करने के लिए ऐक्रेलिक कक्ष मुहर.
- कांच कोट करने के लिए कमरे के तापमान पर 2 से 4 घंटे या 4 में रात भर के लिए कक्ष incubating द्वारा explants के आसंजन कक्ष के भीतर कांच कम गैर चिपकने वाला एक सब्सट्रेट के साथ 1 / 3 एक्स एमबीएस में 1% BSA के साथ डिग्री सेल्सियस (BSA एमबीएस).
- छोटे coverslip (लगभग 8 मिमी से 2) टुकड़े एक हीरे पेंसिल का उपयोग कर तैयार है. BSA - एमबीएस के साथ प्री - कोट टुकड़े.
- चैम्बर से BSA - एमबीएस कुल्ला और DFA के साथ मीडिया की जगह.
- आबकारी जानवर टोपी explant (ओं) (पार्ट 1;. अंजीर 2A) और कक्ष के लिए स्थानांतरण. प्रत्येक एक बाल पाश (उपकला परत के साथ कक्ष के नीचे का सामना करना पड़) का उपयोग explant स्थिति और धीरे जगह में एक गिलास coverslip उच्च वैक्यूम तेल (छवि 2B) के छोटे dabs द्वारा आयोजित टुकड़ा के साथ explant ठीक है. बहुत सावधान रहो, जबकि coverslip दबाने के बाद से अत्यधिक दबाव आसानी से explant को बाल से तोङना कर सकते हैं. एकाधिक explants छोटे coverslip जगह में explants पकड़ के लिए इस्तेमाल किया टुकड़े के आकार के आधार पर प्रत्येक कक्ष में लोड किया जा सकता है. अभ्यास के साथ अप करने के लिए 20 explants यहाँ वर्णित ऐक्रेलिक कक्ष में लोड किया जा सकता है. DFA कक्षों के साथ शीर्ष पर खोलने के साथ जब तक भी भरें. 24 के साथ 40 मिमी कवर कांच के कक्ष के ऊपर सील सिलिकॉन तेल का प्रयोग करें. जोड़ें या DFA को हटाने के लिए सील और कक्ष से दाग अतिप्रवाह चैम्बर में हवा के बुलबुले को कम.
- यह सील कक्ष बड़े, निचले सदन के कांच की सतह के माध्यम से दीर्घकालिक और जानवर टोपी explants के रहते इमेजिंग संस्कृति की अनुमति देगा. यह बाद में इमेजिंग के लिए कम गंदगी से मुक्त चैम्बर के कांच की सतह, तेल, या मीडिया रखने के लिए महत्वपूर्ण है. हम कागज तौलिया तली पेट्री डिश तैयार करने के लिए कक्षों की दुकान के रूप में वे इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं सलाह देते हैं.
भाग 3: उच्च संकल्प रहते इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी
इस खंड में प्रोटोकॉल एक confocal खुर्दबीन हमारी प्रयोगशाला (; Leica माइक्रोसिस्टम्स, Bannockburn आईएल Leica टीसीएस SP5) के लिए उपलब्ध का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है. विभिन्न confocal सूक्ष्मदर्शी मामूली संशोधन की आवश्यकता होती है और हम अनुशंसा उपयोगकर्ताओं को उनके संबंधित ऑपरेटिंग निर्देश का पालन कर सकते हैं.
- इमेजिंग प्रणाली पावर अप, माइक्रोस्कोप मंच इनिशियलाइज़ और fluorophores के लिए उपयुक्त लेज़रों पर बारी, fluorescein या EGFP लिए आर्गन लेजर और 543 HeNe लेजर rhodamine या आरएफपी के लिए अर्थात्.
- चैम्बर आवास खुर्दबीन मंच पर explants रखें. पहले स्थिति कक्ष जगह में एक उचित उद्देश्य कदम. हम प्रारंभिक इमेजिंग के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर 20x हवा उद्देश्य (0.7) का उपयोग करने की सलाह देते हैं, हम उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए 40x या 63x तेल उद्देश्यों ना using1.4 और अनुशंसा करते हैं बड़े सेल क्षेत्रों ट्रैकिंग. (ध्यान दें: एक बार विसर्जन तेल उद्देश्य उपयोग सावधानी से लागू किया जाता है जब एक हवाई उद्देश्य का उपयोग ताकि आप अनजाने में तेल उद्देश्य नहीं डुबकी करते हैं.) छोटे वजन का उपयोग करने के लिए जगह में चैम्बर पकड़ है.
- उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति रोशनी का प्रयोग करें और ध्यान केंद्रित समायोजित है जब तक आप सतही कोशिकाओं के शिखर छोर देखते हैं. चैम्बर आधार में नहीं उद्देश्य "दुर्घटना" के लिए सावधान रहें. सहित या हवाई बुलबुले का उत्पादन जब तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करने से बचें. एक बार नमूने "मोटे" पोजीशनिंग मोड का उपयोग कर तैनात हैं, "ठीक" पोजीशनिंग मोड के लिए बदल जाते हैं.
- रहते इमेजिंग के लिए confocal ट्यूनिंग के लिए अनुशंसाएँ:
- लेजर शक्ति कम के रूप में संभव के रूप में में रखा जाना चाहिए: 1) को रोकने के लिए, 2 विरंजन) phototoxic प्रभाव, और 3) को रोकने के लिए कक्ष आकार 7 परिवर्तन के किसी भी आकस्मिक ट्रिगर रोकने. लेजर बिजली की आवश्यकता अभिव्यक्ति के स्तर और भ्रूण में व्यक्त आणविक संवाददाताओं के प्रकार पर निर्भर करता है.
- 1024 पिक्सल द्वारा रहते इमेजिंग के लिए 1024 के एक स्कैन प्रारूप का उपयोग करें के रूप में यह अच्छी छवि संकल्प प्रदान करता है. यदि आप बहुत उच्च फ्रेम दर (न्यूनतम हमारी प्रणाली के लिए 1.3s है) की जरूरत है, तो 512 पिक्सल द्वारा 512 के स्कैन प्रारूप का उपयोग करें. यह छवि संकल्प कम होगा, लेकिन अभी भी जानकारी की उचित राशि निकालने के लिए पर्याप्त हो सकता है.
- उत्सर्जन, dichroic, और उचित रूप में फिल्टर उत्तेजना के वर्णक्रमीय रेंज को समायोजित करें.
- Confocal pinhole 1 और 1.5 के बीच हवादार इकाइयों को समायोजित करें.
- Photomultiplier लाभ एक न्यूनतम स्तर पर रखा जाना चाहिए शोर को कम करने के लिए अभी तक पर्याप्त संकेत करने के लिए सेल संरचनाओं और प्रोटीन स्थानीयकरण की पहचान प्रदान करते हैं.
- काले पृष्ठभूमि समायोजित करने के लिए छवियों की गुणवत्ता में सुधार के लिए ऑफसेट स्तर को समायोजित करें.
- कदम (1) के माध्यम से (6) iteratively के लिए सबसे अच्छी गुणवत्ता छवि को संभव उत्पादन के लिए लागू कर रहे हैं. गुणवत्ता छवियों या एक व्यापक गतिशील रेंज पर पिक्सेल तीव्रता के साथ संरचना और स्थानीयकृत प्रोटीन का समाधान करना चाहिए. यदि मात्रात्मक विश्लेषण लक्ष्य कर रहे हैं वहाँ शून्य तीव्रता या संतृप्त पिक्सल के कम से कम संख्या का होना चाहिए.
- (1) कदम, (3), (5), और (6) के लिए प्रत्येक अतिरिक्त प्रतिदीप्ति चैनल के लिए दोहराया जाना संभव के लिए सबसे अच्छा गुणवत्ता छवि का उत्पादन की जरूरत है.
- जब इमेजिंग दो या फ्लोरोसेंट जांच यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वहाँ एक प्रोटीन से एक दूसरे प्रोटीन उत्सर्जन स्पेक्ट्रा न्यूनतम वर्णक्रमीय के माध्यम से खून है. भरो माध्यम से पहले प्रोटीन रोमांचक लेजर शक्ति को कम करने और दूसरा प्रोटीन द्वारा इस्तेमाल किया तरंगदैर्य में उत्पादित संकेत देख द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. वर्णक्रमीय के माध्यम से खून फिल्टर का अधिक प्रतिबंधात्मक विकल्प के साथ या लेजर उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया शक्ति को कम करने और पहले प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया लाभ को बढ़ाने के द्वारा कम किया जा सकता है.
- साथ confocal इन दिशानिर्देशों का उपयोग कर देखते यह संभव हो सकता XY मोड (छवि 3A) में एक ही फोकल गहराई में एकल छवियों पर कब्जा करना चाहिए.
- यदि एक सेल 7 संकुचन के दौरान आकार परिवर्तन जैसे एक गतिशील रूप से होने वाली प्रक्रिया के समय चूक फिल्मों को इकट्ठा करने में रुचि है, एक के लिए निम्नलिखित विकल्प confocal मोड से चुन है:
- XYT: यह विधा एक समय पर छवियों की एक श्रृंखला को इकट्ठा करने के लिए Z विमान को बदलने के बिना अनुमति देता है. हम इस विधा का उपयोग करने के लिए उपकला कोशिकाओं में अंतर्जात उतार - चढ़ाव का पालन. आम तौर पर, हम एक फ्रेम प्राप्त हर 5 सेकंड 20 मिनट से अधिक अंतर्जात परिवर्तन या आकार में परिवर्तन उपकला कोशिकाओं की बाहरी उत्तेजना से प्रेरित का पालन. फ्रेम दर के विकल्प क्या एक अवलोकन में और गतिशील प्रक्रिया है दिलचस्पी है पर पूरी तरह निर्भर है.
- XYZ: इस मोड का उपयोग करना, हम उपकला कोशिकाओं के माध्यम से एक एकल Z श्रृंखला ढेर जमा कर सकते हैं. हमारी डिफ़ॉल्ट सेटिंग Z श्रृंखला इकट्ठा 5 सुक्ष्ममापी की एक सीमा से अधिक 0.1 सुक्ष्ममापी कदम उठाए हैं. हम इस विधा का उपयोग निर्धारित करने के लिए कि क्या cytoskeletal परिवर्तन केवल इस तरह के रूप में एक निश्चित, adherens जंक्शनों के स्तर पर पदों पर होने वाली हैं, या सेल प्रांतस्था में हर जगह.
- XZT (छवि 3A '): इस विधा मुख्य रूप से उपकला में सेल के संगठन के शिखर - बेसल में तेजी से परिवर्तन का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस मोड इसकी उपयोगिता के लिए पुष्टि है कि XYT मोड confocal छवि अधिग्रहण z-अक्ष के साथ नहीं बहती है शिखर सेल डोमेन और परिवर्तन की एक विश्वसनीय संवाददाता में लोकप्रिय है.
- XYZT: यह XYZ और XYT मोड को जोड़ती है. इस विधा उपकला से भरा शिखर बेसल गतिशीलता पर अमीर विवरण उपलब्ध कराने पर करने के लिए पूर्ण छवि के ढेर के अधिग्रहण और गंभीर सेल photobleaching और phototoxic प्रभाव के कारण व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं करने के लिए धीमी गति से कर सकता है.
- : 1) लाइन औसतन, 2) लाइन संचय, 3) फ्रेम औसतन, और 4) फ्रेम संचय छवि गुणवत्ता एक या एक से चार निम्नलिखित दृष्टिकोण के संयोजन का उपयोग करके एक सीमित हद तक सुधार किया जा सकता है. छवि अधिग्रहण के लिए इन औसत मोड छवि गुणवत्ता में सुधार, लेकिन सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा और अधिक समय के लिए छवियों को इकट्ठा की आवश्यकता होती है सकते हैं.
- सभी सेटिंग्स के साथ ध्यान से समायोजित जमा है, और एक बाहरी हार्ड ड्राइव, यूएसबी मेमोरी स्टिक, या नेटवर्क संलग्न सर्वर करने के लिए छवियों, z-श्रृंखला है, और समय श्रृंखला डेटा को बचाने के.
- एक बार जब आप अपने प्रयोग पूरा कर रहे हैं, सुरक्षा के लिए उद्देश्य कम है, उद्देश्य से तेल और लेंस कागज के साथ खुर्दबीन मंच को साफ करने के लिए, और बिजली डाउन confocal प्रणाली.
भाग 4: एफ actin microfilaments के लाइव इमेजिंग
के रूप में भाग 3 में दिखाया गया है, प्रोटीन स्थानीयकृत झिल्ली सदस्य GFP fluorescently कोशिका झिल्ली लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. उप सेलुलर घटकों के लाइव इमेजिंग अन्य प्रोटीन का उपयोग करके हासिल की है. Moesin - GFP जैसे एक प्रोटीन है कि एक एफ actin बाध्यकारी डोमेन शामिल जीवित कोशिकाओं में एफ actin लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रहने कक्ष और समय चूक अनुक्रम की इमेजिंग संग्रह के लिए इसी तरह की रणनीति के भाग 3 में उल्लिखित प्रक्रियाओं का पालन करें. लाइव इमेजिंग एफ actin संरचनाओं महीन झिल्ली और अधिक कसकर स्थानीयकृत रहे हैं के बाद से अधिक सदस्य GFP इमेजिंग माइक्रोस्कोपी कौशल की तुलना में शामिल है. उदाहरण के लिए, विसर्जन के तेल में किसी भी छोटे बुलबुले विपथन धुंधला या कब्जा कर लिया छवि में चर चमक के रूप में ऐसी कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं. इसके अलावा, केन्द्र या Z विमान में किसी भी छोटे बहाव के कारण moesin GFP cortical एफ actin के लेबल के लिए बाहर के ध्यान केंद्रित स्थानांतरित कर सकते हैं. इस प्रकार, एक फिर डबल करने के लिए मंच, explant, और कक्ष को स्थिर करने के प्रयास होना चाहिए जबकि cortical इमेजिंग एफ actin और अन्य उप सेलुलर प्रोटीन. XY और XZT दिखा moesin - GFP एफ actin लेबल छवियों उदाहरण हैं (छवि 3B और बी ') के रूप में दिखाए जाते हैं.
भाग 5: छवि विश्लेषण
छवियाँ और समय चूक दृश्यों रहते सेल confocal सत्र से प्राप्त क्रम में प्रोटीन स्थानीयकरण का आकार परिवर्तन या पैटर्न से संबंधित hypotheses परीक्षण विश्लेषण किया जा सकता है. नग्न आंखों अक्सर गुणात्मक विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा उपकरण है, लेकिन या संवर्धित किया जा सकता है छवि विश्लेषण तकनीक द्वारा स्वचालित करने के लिए मात्रात्मक डेटा निकालने है. Leica confocal सिस्टम से छवि डेटा TIF. स्वरूपित छवि फ़ाइलों या एक मालिकाना. LIF प्रारूप है कि अधिग्रहण के दौरान माइक्रोस्कोप शर्त पर विस्तृत जानकारी रखता है जैसे एक खुला प्रारूप में बचाया जा सकता है है. दोनों तिवारी.एफ और. LIF फाइलें सीधे एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण प्रोग्राम छवि (जम्मू Rasband, किया गया था, ImageJ, अमेरिकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, बेथेस्डा, मेरीलैंड, संयुक्त राज्य अमेरिका, http://rsb.info.nih.gov/ij से आयात किया जा सकता है / 1997-2009) जैव स्वरूपों का उपयोग प्लग में (केविन Eliceiri, loci, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन, WI). निम्न अनुभाग में हम दो उदाहरण को वर्णन करने के लिए कैसे उपयोगकर्ताओं को confocal छवि डेटा की मात्रात्मक विश्लेषण शुरू हो सकता है प्रदान करते हैं.
- किसी भी TIF या. LIF (Fig.4 एक और एक ') फ़ाइल का उपयोग करना> खुली फ़ाइल खोलें
- उदाहरण 1: एक उपकला सेल (बी छवि 4B सेल क्षेत्र उपाय''').
- > सेट माप विश्लेषण क्षेत्र का चयन करें.
- छवि जम्मू उपकरण पट्टी से बहुभुज चयन उपकरण का चयन करें, और सेल रूपरेखा.
- ओपन आरओआई से प्रबंधक> टूल्स> आरओआई पोर्टफोलियो का विश्लेषण और इसे करने के लिए [नियंत्रण टी] दबाकर बाह्यरेखा जोड़ने के लिए, जो आरओआई प्रबंधक को किसी भी नए "हित के क्षेत्र" या ROI को जोड़ने के लिए शॉर्टकट है. यह महत्वपूर्ण है इस चयन को जोड़ने और आरओआई सेट बचाने के बाद तुम वापस एक बाद में समय पर जाने के लिए और किसी भी अन्य पैरामीटर माप कर सकते हैं. बचाया ROIs ("सहेजें" पर क्लिक करें) के सेट को आगे के विश्लेषण के लिए बाद में पुनः लोड कर सकते हैं.
- एक एक छवि में कक्षों की किसी भी संख्या के साथ कदम (ग) दोहराएँ और आरओआई प्रबंधक ROIs जोड़ सकते हैं. एक बार एक पर्याप्त ROIs दर्ज है, आरओआई प्रबंधक में "उपायः" पर क्लिक करें. परिणामों के विंडो में, अब एक ROIs के खिलाफ क्षेत्रों को देख सकते हैं. छवि आयाम माप मानकों में संगत मानों है.
- उदाहरण 2: एक सेल झिल्ली (सी छवि 4C की तीव्रता उपाय''').
- छवि जम्मू उपकरण पट्टी से "सीधे लाइन" उपकरण का चयन करें, और छवि है कि ब्याज की कोशिका झिल्ली को सीधा है, और झिल्ली को पार पर एक रेखा खींचना. इस सीधी रेखा चयन रॉय के एक अन्य प्रकार है और आरओआई प्रबंधक को जोड़ने के लिए किया जा सकता है इसके बाद के संस्करण के रूप में.
- मनमाना इकाइयों में विश्लेषण> साजिश शख्सियत द्वारा सापेक्ष तीव्रता का प्लॉट. छवि के रूप में और मानों की सूची के रूप में सहेजें क्लिक सहेजें और सूची से फ़ाइल>> साजिश खिड़की पर के रूप में क्रमशः बचाओ.
- विभिन्न मात्रात्मक मापन छवि 'शोधकर्ताओं के हितों और परिकल्पना का परीक्षण किया जा रहा है पर निर्भर करता है जम्मू का उपयोग किया जा सकता है. माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल (Microsoft Corporation, सिएटल, WA) या सिग्मा (Systat सॉफ्टवेयर, Inc सैन जोस, CA) प्लॉट डेटा रेखांकन साजिश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 7 पहले छवि विश्लेषण में अतिरिक्त उदाहरण प्रस्तुत किया गया है.
चित्रा 1 आवश्यक सामग्री. ए) उपकरण और संस्कृति चैम्बर के microsurgery और विधानसभा के लिए की जरूरत है. पेट्री डिश (एक), बड़े कवर पर्ची (ख), हेयर उपकरण (ग), हीरा पेंसिल (घ), संदंश (ई), सिलिकॉन तेल "caulking बंदूक" (च), नायलॉन वॉशर (छ), और कस्टम एक्रिलिक संस्कृति चैम्बर (ज). बी) बाल चाकू के बंद करें, और सी) बाल पाश.
चित्रा 2 जानवर टोपी explants के छांटना. Microsurgical एक जानवर टोपी explant (घ, पृष्ठीय निकालने के लिए किया हेरफेर के) योजनाबद्ध, v, उदर, आह, पशु गोलार्द्ध, VH, वनस्पति गोलार्द्ध). बी) योजनाबद्ध (ई) के explant के एक coverslip शिखर BSA लेपित गिलास (छ) के लिए apposed सतह के साथ जगह में सिलिकॉन तेल (एस) द्वारा आयोजित टुकड़ा के तहत तैनात हैं. explant तो उपकला परत खुर्दबीन उद्देश्य (मीटर) के सबसे करीब है तैनात है. सी) पशु टोपी explant DFA (लाल तीर) में सभ्य है और एक बड़ा गिलास coverslip पर ऐक्रेलिक (नीले तीर) कक्ष (काला तीर) में रखे और गिलास coverslip टुकड़ा और सिलिकॉन तेल के द्वारा जगह में आयोजित.
चित्रा 3 उपकला कोशिकाओं confocal खुर्दबीन का उपयोग कर मनाया. ए) एक XY दृश्य और झिल्ली स्थानीयकृत GFP (सदस्य GFP) के एक XZ दृश्य (ए ') उपकला शीट लेबल. बी) एक XY देखने और XZ देखने (बी) के एक moesin GFP के एफ actin शिखर सेल प्रांतस्था लेबल.
चित्रा 4 छवि विश्लेषण छवि जे) एक झिल्ली स्थानीयकृत GFP सेल लेबल पत्रक के मूल छवि एक का उपयोग कर. (ए) में इनसेट बॉक्स के एक उच्च संकल्प दृश्य (ए ') दो "क्षेत्रों के हित" या ROIs से पता चलता है. रूपरेखा पीले एक एकल बहुभुज उपकरण (पैनल बी देखें) और हरे रंग की लाइन का उपयोग करने के लिए चयनित कक्ष की सीमा को इंगित करता है एक सेल सेल सीधी रेखा उपकरण (पैनल सी देखें) का उपयोग करने के लिए चयनित सीमा के पार एक तीव्रता प्रोफ़ाइल के पथ इंगित करता है. 'बी) विधि माप विकल्पों का चयन करें और "क्षेत्र" (बी''). चुनें एक बार आरओआई चयनित है यह आरओआई (प्रबंधक बी'''). में संग्रहीत किया जा सकता है है सी) 'प्रोफ़ाइल के लिए माप विकल्पों का चयन करने के लिए विधि लिया. सी'') एक बार सीधी रेखा या खंडों लाइन उपकरण चुना है मार्ग के किनारे तीव्रता प्रोफ़ाइल "प्लॉट प्रोफ़ाइल" कमांड के साथ प्लॉट किया जा सकता है. Intens की एक सूचीअल्पसंख्यक मान भी एक स्प्रेडशीट पठनीय रूप में बचाया जा सकता है है.
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Discussion
हम नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में छवि शिखर सेल प्रांतस्था और oscillating Xenopus भ्रूण में उपकला कोशिकाओं के कोशिका झिल्ली में गतिशील बदलते cytoskeleton के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. एक उपकला कोशिका आकार के रहते इमेजिंग के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में में इन प्रोटोकॉल का उपयोग करना चाहिए, इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए आवश्यक है और कुछ सेटिंग्स खुर्दबीन एक प्रणाली के प्रकार पर निर्भर करता है बदल जाएगा है और इमेजिंग के एक प्रोटीन के प्रकार में रुचि है . साथ में, प्रोटोकॉल कदम (explant अलगाव, इमेजिंग और सेलुलर और उप सेलुलर घटकों के दृश्य, और मात्रा का ठहराव पद्धति) उपकला morphogenesis अध्ययन के लिए एक व्यापक प्रक्रिया प्रदान करते हैं.
क्रिटिकल पहलुओं करने के लिए याद
- यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले mRNA तैयार. गिरावट से बचने के mRNA ट्यूब बर्फ पर संग्रहीत हैं. एक बार परीक्षण किया है, ट्यूब -80 में संग्रहीत किए जाते हैं ° C छोटे aliquots में एकाधिक फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के.
- यह करने के लिए कई साइटों में mRNA इंजेक्षन करने के लिए कक्षों की पशु टोपी बाह्य त्वक स्तर में एक बड़े क्षेत्र पर mRNA की भी वितरण बीमा आवश्यक है.
- के अलावा एंटीबायोटिक / antimycotic दीर्घकालिक संस्कृति के लिए जीवाणु और कवक विकास को हतोत्साहित करना आवश्यक है.
- केयर जबकि coverslip टुकड़े के तहत explants दबाने के बाद से अधिक से अधिक आवश्यक दबाव explants को बाल से तोङना कर सकते हैं लिया जाना चाहिए.
- इमेजिंग जबकि, इष्टतम सेटिंग्स करने के लिए सबसे अच्छा संभव छवि गुणवत्ता है कि अंतर्जात सेल व्यवहार और प्रोटीन की गतिशीलता को दर्शाता है के साथ अधिक से अधिक डेटा इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हैं. इष्टतम सेटिंग्स का चयन अभ्यास और अनुभव के साथ आता है.
- छवियों का विश्लेषण करने के लिए हम दृढ़ता से ImageJ की सिफारिश. ImageJ एक उत्कृष्ट खुला स्रोत उपकरण है कि और डाउनलोड किया जा सकता है कस्टम लिखा या मैक्रोज़ डाउनलोड और प्लग - इन के अलावा के साथ संशोधित है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01-HD044750), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से कैरियर अनुदान, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अनुदान में सहायता की शुरुआत) से समर्थन द्वारा समर्थित किया गया. आण्विक जीव विज्ञान और synthesizing के mRNA में उसकी सहायता के लिए हरियाणा किम, एम. वॉन Dassow और जे झोउ (दैनिक जिम्मेदारियों के साथ प्रयोगशाला मदद के लिए), और लिन झांग: लेखक डेविडसन लैब के सदस्यों को धन्यवाद. हम सभी मेंढक (विशेष रूप से रे केलर और डौग DeSimone) प्रयोगशालाओं, जो इस प्रोटोकॉल के कुछ भाग के लिए योगदान दिया है, विकास और वर्षों से विभिन्न तरीकों के परीक्षण के द्वारा, से प्रयोगात्मक प्रयासों को स्वीकार करते हैं. हम अपने सदस्य GFP और moesin GFP plasmids क्रमशः की तरह उपहार के लिए रिचर्ड Harland और जॉन Wallingford धन्यवाद.
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