Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering, University of Pittsburgh, ²Developmental Biology, University of Pittsburgh

Summary

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

תאים אפיתל עובריים לשמש מודל אידיאלי ללמוד המורפוגנזה שבו רב הסלולר רקמות עוברים שינויים בגיאומטריה שלהם, כגון שינויים באזור תא השטח גובה התא, שבו התאים עוברים מיטוזה ו לנדוד. יתר על כן, בתאי אפיתל יכול גם לווסת את תנועות המוךפו"גנטי שהולך ברקמות סמוכות

Protocol

לפני שתתחיל

1. לסנתז mRNA כתרים מתבנית DNA המקודד את החלבון לינארית מתויג fluorescently ו-mRNA לטהר על ידי שיטות סטנדרטיות (ערכת AmpliCap תמלול; ביוטכנולוגיות Epicentre, Madison WI). mRNA צריך להיות aliquoted לשימוש פעם אחת ב 0.2 צינורות צנטריפוגה מ"ל ומאוחסנים ב -80 ° C.
2. שיטות סטנדרטית להשיג ביצים, הפריה חוץ גופית, והסרה של המעיל ביצה תוארו בעבר ^2. הליך להשיג ביצים צפרדע Xenopus laevis נקבה הודגמה ³ קודם לכן. להפרות ביציות במבחנה מיד לאחר קבלת אותם צפרדעים הנשי באמצעות האשכים מבודדת בעבר מפני צפרדע זכר. De-ג'לי ביצים 20 דקות הפריה לפרסם מזריקים mRNA, חלבונים, DNA, או dextran מיד כדי לאפשר דיפוזיה של חומרים כימיים microinjected מספיק. זריקות יותר מ 1 שלאחר ההפריה שעה לעיתים קרובות אינם מצליחים לנטרל מן הזריקה.
3. Microinjection הביצית הודגמה בעבר ⁴ באמצעות הלחץ שסתום מבוקר ההזרקה (PLI-100, הרווארד Apparatus). פעל בשיטה דומה להזרקת mRNAs בחצי הכדור החי של עוברים צפרדע ב 1 - שלב 4 תאים. העברת עוברים המופרית אל Ficoll 3% (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) ב 1x MBS (MBS-Ficoll) ו microinject בנפח הרצוי (2-4 nl) של ה-GFP קידוד כתרים mRNA ממוקד קרום (מ-GFP) או F -אקטין (מו-GFP). כדי להשיג אפילו הפצה מזריקים mRNA ב 4 אתרים מרווחים באופן שווה מוט החי. העוברים יכולים להישאר MBS-Ficoll במשך כמה שעות אבל צריך להעביר 1 / 3 x MBS לפני תחילת gastrulation.

החומרים הדרושים (פריטים המסומנים על ידי * מוצגים איור 1.)

1. Dissection stereomicroscope עם תאורה של סיבים אופטיים. בשלב לנתיחה מקורר מומלץ אבל לא חובה.
2. שיער כלים (סכין שיער לולאה שיער) *.
3. מלקחיים (דומון # 5 נירוסטה; כלים המדע פיין, פוסטר סיטי, קליפורניה) *.
4. השתנה בארת' של מלוחים תרבות העובר התקשורת (MBS; 88 mM NaCl, 2.4 mM NaHCO _3, 1 mM KCl, 0.33 mM CaCl _2, 0.41 מ"מ (CaNO _{3) 2,} 0.82 mM MgSO _4, 10 HEPES מ"מ (H3375, סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי)).
5. Danilchik בשביל איימי explant תרבות מדיה (DFA; 53 mM NaCl _2, 5 mM Na ₂ CO _3, אשלגן גלוקונאט 4.5 מ"מ, 32 נתרן gluconate מ"מ, 1mm CaCl _2, 1mm MgSO _4). כלול בסרום שור 0.1% אלבומין עם DFA (BSA, A7906, סיגמא אולדריץ '). DFA חייב להיות מסונן סטרילי אבל יכול להיות aliquoted ב 50 צינורות חרוטי מ"ל ומאוחסנים ב -20 ° C. אנטיביוטיקה antimycotics (0.8% בתקשורת, A5955, סיגמא אולדריץ ') יש להוסיף DFA מופשר טרי לעכב התפתחות חיידקים או פטריות.
6. 60 או 100 מ"מ צלחות פטרי *.
7. מכסה זכוכית גדולה, 45 על ידי 50 מ"מ (12-544 F-1.5 #; פישר סיינטיפיק, המפטון, NH) *.
8. מכסה זכוכית קטנים, 24 על ידי 40 מ"מ (12-544C, # 1.5; פישר סיינטיפיק).
9. גריז סיליקון (ואקום גבוה, דאו כימיקלים) נטען לתוך מזרק "אטימה ירייה" *.
10. לתאי אקריליק אישית או מנקי ניילון (חלקים קטנים Inc; מיראמר, פלורידה) *. החדרים מותאמים אישית ניתן הסתובבו בחנות מכונת מתוך 25 על ידי 50 על ידי גוש 5 מ"מ אקריליק לספק תא פנימי כי הוא 1.2 ס"מ על 2.8 ס"מ. בחדר זה יש נפח עבודה של 1.68 מ"ל. מנקי ניילון אופציונלי ניתן לבחור במגוון גדלים, אנחנו מעדיפים בגדלים תואמים בקוטר 18 מ"מ coverslips זכוכית עגולה.
11. עיפרון היהלומים *.

חלק 1: כריתה של explants כובע בעלי חיים

1. התרבות עוברים לשלב הרצוי ⁵ ב MBS 1 / 3 x. קצב הפיתוח יכול להיות נשלט עם טמפרטורות תרבות בין 15 ל 21 מעלות צלזיוס, כך ניסויים אפשר לעשות בזמן נוח היום. בטמפרטורת החדר יכול לשמש אך העוברים יפתחו מהר יותר.
2. העברת עוברים ל DFA.
3. הסר ממברנות vitelline באמצעות מלקחיים.
4. תחת הבלו לנתח stereomicroscope, explant כובע חיה שיער באמצעות סכינים שיער לולאות ^6. השתמש שיער לולאה כדי לתמוך או להחזיק את העובר במיקום ועל השיער סכין לעשות חתך קטן מוט החיה של העוברים. שימוש חוזר "קפיצי חתכים" עם סכין השיער לעשות חתך 360 מעלות כדי להסיר את הכובע האאקטודרם חיה מן העובר. בעזרת תרגול, ניתן לבצע חתכים חלקה לגרום נזק מינימלי explant או תאים lysed בשוליים (איור 2 א).
5. חזור על שלב 4 כדי הבלו 3-4 explants כובע החיה והמשך חלק 2. אחת חייבת להיות מהירה תוך צמצום explants, מכיוון שיש להם נטייה הכדור במהירות. בשלב לנתיחה מקורר יכולים להאט את התהליך או לחילופין אתה יכול לעשות explants פחות.

חלק 2: בתאי הכן explants לטעון לאטום את חדר לתרבות לטווח ארוך

1. להשתמשסיליקון גריז להדביק או לאטום את תא אקריליק על זכוכית מכסה גדול.
2. כדי להפחית הידבקות של explants לצפות את משטח הזכוכית של זכוכית בתוך חדר עם המצע לא דבק דוגרים על ידי תא ל -2 עד 4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C עם BSA 1% 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
3. הכן שברי coverslip קטן (כ 2 מ"מ 8) באמצעות עיפרון היהלומים. טרום מעיל עם שברי BSA-MBS.
4. לשטוף BSA-MBS מהאולם ולהחליף את התקשורת עם DFA.
5. והבלו כובע חיה explant (ים) (חלק 1:. איור 2A) ולהעביר לחדר. מיקום כל explant באמצעות שיער לולאה (עם שכבת האפיתל מול התחתון של החדר) בעדינות לתקן את explant במקום עם שבר זכוכית coverslip בידי מורח קטנה של שומן ואקום גבוה (איור 2B). היזהר מאוד בזמן לחיצה על coverslip מאז לחץ מופרז יכולים בקלות לרסק את explant. Explants מרובות ניתן לטעון לתוך תא אחד מבוסס על הגודל של שברים coverslip קטן המשמש להחזיק את explants במקום. בעזרת תרגול עד 20 explants ניתן לטעון לתוך תא אקרילי המתואר כאן. ממלאים את חדרי עם DFA עד אפילו עם פתיחת בראש. השתמש גריז סיליקון לאטום את החלק העליון של החדר עם 24 על ידי כיסוי זכוכית 40 מ"מ. הוספה או הסרה של DFA להפחית בועות אוויר בתא אטום הצפת כתם מן החדר.
6. זה חדר אטום יאפשר לתרבות לטווח ארוך ולחיות הדמיה של explants כובע חיה דרך פני השטח, זכוכית גדול התחתון של החדר. זה חיוני כדי לשמור על משטח זכוכית התחתון של החדר ללא לכלוך, שומן, או אמצעי הדמיה מאוחר יותר. אנו ממליצים על הכנת נייר מגבת תחתית צלחות פטרי כדי לאחסן בתאי כפי שהם מוכנים הדמיה.

חלק 3: ברזולוציה גבוהה לחיות הדמיה מיקרוסקופיה confocal

הפרוטוקול בסעיף זה פותחה להשתמש במיקרוסקופ confocal לרשות המעבדה שלנו (TCS Leica SP5, Leica Microsystems, Bannockburn IL). מיקרוסקופים confocal שונים עשויים לדרוש שינוי קל ואנו ממליצים למשתמשים לעקוב אחר הוראות ההפעלה שלהם.

1. Power-up מערכת הדמיה, לאתחל את שלב המיקרוסקופ, ולהדליק לייזרים מתאים fluorophores, כלומר לייזר ארגון עבור והעמסת או EGFP ו 543 HeNe לייזר rhodamine או RFP.
2. מקום הדיור תא explants לבמה מיקרוסקופ. לפני מיקום החדר לנוע אובייקטיבי המתאים למקום. אנו ממליצים להשתמש הצמצם גבוהה המספרי 20x אוויר אובייקטיבי (0.7 na) עבור הדמיה ראשונית: אנו ממליצים using1.4 na מטרות שמן 40X או 63x עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ומעקב גדול התא שדות. (הערה: שמן טבילה לאחר מוחל על זהירות בשימוש אובייקטיבי בעת השימוש אובייקטיבי האוויר אז אתה לא בשוגג לטבול את המטרה בשמן.) השתמש משקולות קטנות להחזיק את התא במקום.
3. השתמש בהיר שדה או פלואורסצנטי תאורה ולהתאים את הפוקוס עד שתראה את הקצוות apical של התאים השטחית. היזהר לא "התרסקות" המטרה לבסיס קאמרית. הימנע כולל או לייצר בועות אוויר בעת השימוש טבילה מטרות שמן. לאחר דגימות ממוקמים באמצעות מצב "גס" מיצוב, שינוי במצב "עדין" מיצוב.
4. המלצות כוונון confocal הדמיה חיים:
   1. כוח לייזר צריך להישמר נמוך ככל האפשר: 1) כדי למנוע הלבנה, 2) כדי למנוע תופעות phototoxic, ו 3) כדי למנוע מקרי מפעילה של שינוי צורה תא ^7. לייזר כוח דרישה משתנה בהתאם לרמת הביטוי סוג של כתבים מולקולרית לידי ביטוי העוברים.
   2. השתמש בתבנית סריקה של 1024 על 1024 פיקסלים עבור הדמיה לחיות כפי שהוא מספק רזולוציית תמונה טובה. אם אתה צריך מסגרת שיעור גבוה מאוד (מינימום 1.3s עבור המערכת שלנו), ואז להשתמש בתבנית סריקה של 512 על 512 פיקסלים. זה יקטין את רזולוציית התמונה, אבל עדיין יכול להיות מספיק כדי לחלץ כמות סבירה של מידע.
   3. התאם את טווח ספקטרום הפליטה, dichroic, ואת עירור מסננים לפי הצורך.
   4. התאם את חריר confocal אל בין 1 ל 1.5 יחידות אוורירי.
   5. מכפיל רווח חייב להישמר ברמה המינימלית כדי להפחית את הרעש עדיין לספק אות מספיק כדי לזהות מבנים תאיים ולוקליזציה חלבון.
   6. התאם את רמת שחור לקזז כדי להתאים את הרקע כדי לשפר את האיכות של התמונות.
   7. שלבים (1) עד (6) מוחלים iteratively כדי לייצר את איכות התמונה הטובה ביותר האפשרית. תמונות איכות צריך לפתור את המבנה או חלבונים מקומי עם עוצמות פיקסל על פני טווח דינמי רחב. אם ניתוחים כמותיים הם המטרה לא צריכה להיות מינימלית של עוצמת המספרים אפס או פיקסלים רוויים.
   8. שלבים (1), (3), (5), ו (6) צורך לחזור על כל ערוץ נוסף הקרינה כדי להפיק את איכות התמונה הטובה ביותר שניתן.
   9. כאשר שני הדמיה או בדיקות ניאון חשוב לוודא כי יש לדמם דרך ספקטרלי מינימלית של חלבון אחד ספקטרום הפליטה של ​​החלבון השני. Bleed דרך ניתן לבדוק על ידי צמצום כוח לייזר מרגש החלבון הראשון התבוננות האות המיוצר אורכי הגל המשמש את החלבון השני. לדמם דרך Spectral עשוי להיות מופחת עם הבחירה מגבילים יותר של מסננים או על ידי הקטנת כוח לייזר המשמשים עירור והגדלת הרווח משמש לצורך זיהוי של חלבון הראשונה.
5. עם מכוון confocal באמצעות ההנחיות זה צריך להיות אפשרי ללכוד תמונות בודד בעומק מוקד יחיד XY מצב (איור 3A).
6. אם מישהו מעוניין באיסוף זמן לשגות סרטים של תהליך דינמי המתרחש כגון לשנות צורה במהלך התכווצות תא ^7, יש לבחור את המצבים הבאים חלופה confocal:
   1. XYT: מצב זה מאפשר לאסוף סדרה של תמונות לאורך זמן, מבלי לשנות את Z-המטוס. אנו משתמשים במצב זה כדי לבחון את התנודות אנדוגני בתאי האפיתל. בדרך כלל, אנו רוכשים מסגרת אחת בכל 5 שניות במשך 20 דקות כדי לבחון וריאציה אנדוגני או משנה את צורתו המושרה על ידי גירוי חיצוני של תאים אפיתל. בחירת קצב מסגרת תלויה לחלוטין מה הוא מעוניין לצפות ואיך התהליך הוא דינמי.
   2. XYZ: שימוש במצב זה, אנו יכולים לאסוף ערימה אחת Z-סדרת דרך לתאי האפיתל. הגדרות ברירת המחדל שלנו לאסוף Z-סדרת צעדים הם 0.1 מיקרומטר על פני טווח של 5 מיקרומטר. אנו משתמשים במצב זה כדי לקבוע אם השינויים cytoskeletal מתרחשים רק תפקידים מסוימים, כגון ברמה של הצמתים adherens, או בכל מקום בקליפת התא.
   3. XZT (איור "3A): מצב זה משמש בעיקר כדי לבחון שינויים מהירים בארגון apical-הבסיס של תא האפיתל. מצב זה הוא פופולרי עבור השירות שלה, המאשר כי מצב XYT הוא עיתונאי אמין של שינויים בתחום הסלולרי apical וכי רכישת התמונה confocal אינו נסחף לאורך ציר ה-Z.
   4. XYZT: זו משלבת מצבי XYZ ו XYT. מצב זה יכול לספק פרטים עשירים על apical-basal הדינמיקה מלא של האפיתל, אך הוא איטי לרכוש ערימות התמונה המלאה והוא יכול להפחית את כדאיות התא קשות בשל photobleaching ואפקטים phototoxic.
7. איכות התמונה ניתן לשפר במידה מוגבלת באמצעות אחד או שילוב של ארבעת הגישות הבאות: 1) ממוצע של הקו, 2) הצטברות קו, 3) ממוצע של מסגרת, ו 4) הצטברות מסגרת. מצבים בממוצע לרכישת התמונה יכול לשפר את איכות התמונה אבל יקטין כדאיות התא דורשים זמן רב יותר כדי לאסוף תמונות.
8. עם כל ההגדרות מותאם בקפידה, לאסוף ולשמור תמונות, Z-series, זמן סדרת הנתונים לכונן קשיח חיצוני, שרת ה-USB-Memory Stick, או המחובר ברשת.
9. ברגע שאתה סיימו את הניסוי שלך, להוריד את המטרה בטיחות, לנקות את השמן מן המטרה לבין שלב מיקרוסקופ עם נייר העדשה, כוח כלפי מטה את מערכת confocal.

חלק 4: Live-הדמיה של ה-F-אקטין microfilaments

כפי שהראינו בפרק 3, קרום localizing חלבון מ-GFP יכול לשמש fluorescently תווית קרום התא. Live-הדמיה של המשנה הסלולר רכיבים מושגת באמצעות חלבונים אחרים. חלבון כגון moesin-GFP המכיל תחום ה-F-אקטין מחייב ניתן להשתמש בתווית ה-F-אקטין בתאים חיים. אסטרטגיות דומות עבור הדמיה לחיות תאים ו אוסף של זמן לשגות sequences בצעו את ההנחיות המתוארות בחלק 3. Live-F-אקטין הדמיה כוללת מיומנויות במיקרוסקופ יותר מאשר הדמיה מ-GFP מאז המבנים הם עדינה מקומי חזק יותר מאשר הממברנה. למשל, כל בועות קטנות בשמן טבילה יכולים לייצר חפצים סטייה כגון טשטוש או בהירות משתנה בתמונה בשבי. יתר על כן, כל להיסחף קטן מוקד או Z-המטוס יכול לגרום moesin-GFP שכותרתו קליפת המוח F-אקטין לנוע מחוץ להתמקד. כך, אחד צריך להיות מחדש להכפיל את המאמצים לייצב את הבמה, explant, ובית הנבחרים בעוד הדמיה קליפת המוח F-אקטין אחרים המשנה הסלולר חלבונים. XY ו XZT תמונות מראה moesin-GFP שכותרתו F-אקטין מוצגים כדוגמאות (איור 3 ב ו 'ב').

חלק 5: ניתוח תמונה

תמונות זמן לשגות sequences שהתקבלו בפגישה לחיות התא confocal ניתן לנתח על מנת לבחון השערות לגבי שינויים צורה או דפוסים של לוקליזציה חלבון. בעין בלתי מזוינת לעיתים קרובות הכלי הטוב ביותר לניתוח איכותי אבל יכול להיות מוגבר או אוטומטית על ידי טכניקות ניתוח התמונה כדי לחלץ נתונים כמותיים. נתוני תמונה מתוך מערכות לייקה confocal ניתן לשמור בפורמט פתוח כגון קבצי. TIF תמונה מעוצב או פורמט קנייני. LIF אשר שומרים מידע מפורט על מצב מיקרוסקופ במהלך הרכישה. שניהם. TIF ו. LIF קבצים ניתן לייבא ישירות על ידי ניתוח זמין באופן חופשי J תמונה התוכנית (Rasband, היה, ImageJ, ארה"ב National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד, ארה"ב, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) באמצעות ביו פורמטים Plug-in (קווין Eliceiri, לוקוסים, באוניברסיטת וויסקונסין במדיסון, וויסקונסין). בסעיף הבא אנו מציעים שתי דוגמאות כדי להמחיש כיצד משתמשים עשוי להתחיל ניתוח כמותי של נתוני התמונה confocal.

1. פתח כלשהו. TIF או קובץ. LIF (Fig.4 ו ') באמצעות קובץ> פתח
2. דוגמא 1: מדדו את שטח התא של תא אפיתל (איור 4B ל-B''').
   1. בחר אזור לנתח> מדידות SET.
   2. בחר מצולע, מבחר כלי מסרגל הכלים J תמונה, המתאר את התא.
   3. פתח את מנהל ROI מ לנתח> כלים> מנהל ROI ולהוסיף את המתווה אליו על ידי לחיצה על [שליטה t], שהוא קיצור להוספת כל "אזור עניין" חדש או החזר על ההשקעה ROI למנהל. חשוב להוסיף את הבחירה להציל את ההחזר על ההשקעה שנקבע מאז אתה יכול לחזור במועד מאוחר יותר ולבצע מדידות פרמטר אחר. סטים של ROIs הציל (לחץ על "שמור") ניתן לטעון מאוחר יותר לניתוח נוסף.
   4. אפשר לחזור על שלב (ג) עם כל מספר של תאים תמונה ולהוסיף את ROIs ל ROI מנהל. ברגע אחד יש מספיק ROIs מוקלט, לחץ על "מדד" ההחזר על ההשקעה ב Manager. בחלון תוצאות, ניתן כעת לראות את תחומי נגד ROIs. ממדים תמונה יש ערכים המתאימים פרמטרים המדידה.
3. דוגמא 2: למדוד את העוצמה של קרום התא (איור 4C ל-C''').
   1. בחר "קו ישר" כלי מסרגל הכלים J תמונה, למתוח קו על התמונה כי הוא ניצב קרום התא עניין חוצה את הממברנה. זו בחירה קו ישר הוא סוג נוסף של ROI וניתן להוסיף ROI מנהל לעיל.
   2. מגרש בעוצמות יחסית ביחידות שרירותי על ידי פרופיל> לנתח PLOT. שמור את זה בתור תמונה כמו רשימת הערכים על ידי לחיצה SAVE LIST> File> Save AS בהתאמה על החלון PLOT.
4. מדידות כמותיות שונות יכולה להתבצע באמצעות J תמונה בהתאם לאינטרסים של החוקרים ומה השערות נבדקות. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, סיאטל, וושינגטון) או סיגמא מגרש (Systat Software Inc, בסן חוזה, קליפורניה) ניתן להשתמש כדי העלילה נתונים בצורה גרפית. דוגמאות נוספות בניתוח תמונה הוצגו בעבר ^7.

באיור 1. החומרים הדרושים. א) כלים הדרושים microsurgery והרכבה של חדר התרבות. צלחת פטרי (א), להחליק מכסה גדול (ב), כלי השיער (ג), יהלום עיפרון (ד), מלקחיים (ה), סיליקון גריז "אקדח אטימה" (ו), מכונת ניילון (ז), תרבות אקרילי מותאמים אישית תא (ח). ב) תקריב של הסכין שיער, ו-C) לולאה שיער.

איור 2. כריתה של explants כובע בעלי חיים. סכמטי) של מניפולציה microsurgical השתמשו כדי להסיר כובע חיה explant (ד, הגבי, v, הגחון, אה, חיים בחצי הכדור; VH, צמחי בחצי הכדור). ב) סכמטי של explant (ה) ממוצבת תחת שבר coverslip מוחזק במקום על ידי גריז סיליקון (ים) עם משטח apical apposed לזכוכית BSA מצופה (ז). Explant ממוקם כך את שכבת האפיתל הקרוב ביותר המטרה מיקרוסקופ (מ '). ג) בעלי חיים כובע explant (חץ אדום) הוא בתרבית DFA ו שוכנו בחדר אקרילי (החץ הכחול) על coverslip כוס גדולה (חץ שחור) מוחזק במקום על ידי רסיס זכוכית coverslip גריז סיליקון.

איור 3. לתאי האפיתל נצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal. א) להציג XY ונוף (א ') XZ של קרום GFP localizing (מ-GFP) שכותרתו גיליון אפיתל. ב) להציג XY ו XZ להציג (ב ') של moesin-GFP שכותרתו F-אקטין קליפת התא apical.

איור 4. ניתוח תמונה באמצעות תמונה ג') תמונה מקורית של קרום תא ה-GFP localizing גיליון שכותרתו. מבט ברזולוציה גבוהה (א ') של התיבה הבלעה ב (א) מציגה שני "אזורים של עניין" או ROIs. המתאר צהוב מציין את הגבול של תא בודד שנבחר באמצעות הכלי מצולע (ראה לוח ב ') את הקו הירוק מציין את הנתיב של פרופיל העוצמה מעבר לגבול תאים תאים שנבחר באמצעות הכלי קו ישר (ראה לוח ג). ב ') כדי לבחור את שיטת המדידה אפשרויות ובחר "שטח" (ב''). לאחר החזר ההשקעה נבחרה זה ניתן לאחסן מנהל את ההחזר על ההשקעה (ב'''). 'ג) שיטה כדי לבחור את האפשרויות מדידה עבור הפרופיל לקח. C'') לאחר קו ישר או כלי קו מקוטע נבחר פרופיל אינטנסיביות לאורך השביל ניתן להתוות עם הפקודה "פרופיל מגרש". רשימת intensערכים ity ניתן גם לשמור בצורה גיליון קריא.

Discussion

הצגנו פרוטוקולי הניסוי השתמשו בקביעות במעבדה שלנו cytoskeleton תמונה דינמית משתנה בקליפת התא apical ו נדנוד קרום התא של תאים אפיתל בעוברים Xenopus. אחד צריך להשתמש הפרוטוקולים הללו כנקודת פתיחה עבור הדמיה חיה של צורות תא אפיתל, אופטימיזציה של פרוטוקול זה הוא חיוני וחלק ההגדרות ישתנו בהתאם לסוג המערכת מיקרוסקופ יש ואת סוג של חלבונים אחד הוא מעוניין הדמיה . יחד, את הצעדים פרוטוקול (בידוד explant, הדמיה והמחשה של רכיבים סלולריים המשנה הסלולר, ומתודולוגיה כימות) לספק הליך מקיף ללמוד המורפוגנזה אפיתל.

היבטים קריטי לזכור

1. חשוב להכין באיכות גבוהה mRNA הזרקת מיקרו לעוברי. צינורות mRNA מאוחסנים על הקרח, כדי למנוע השפלה. נבדק פעם, הצינורות מאוחסנים -80 מעלות צלזיוס aliquots קטנים כדי להימנע מרובים להקפיא להפשיר מחזורים.
2. זה חיוני כדי להזריק לתוך mRNA אתרים מרובים כדי להבטיח אפילו והפצה של mRNA מעל שדה גדול של תאים האאקטודרם את הכובע בעלי חיים.
3. תוספת של אנטיביוטיקה / antimycotic חיונית לתרבות לטווח ארוך כדי להרתיע את התפתחות חיידקים ופטריות.
4. יש להקפיד תוך כדי לחיצה explants תחת שברי coverslip מאז יותר מן הרגיל נדרש הלחץ יכול לרסק את explants.
5. בעוד הדמיה, הגדרות אופטימליות חיוניים כדי לאסוף נתונים מקסימלי עם איכות התמונה הטובה ביותר האפשרית המשקף התנהגויות תא אנדוגני ואת הדינמיקה חלבון. בחירת הגדרות אופטימליות מגיע עם תרגול וניסיון.
6. כדי לנתח את התמונות אנו ממליצים ImageJ. ImageJ הוא כלי מצוין קוד פתוח שניתן להוריד שונה עם תוספת של פקודות מאקרו אישית בכתב או להוריד plug-ins.