Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em
Summary
Xenopus embryonala epitel är ett idealiskt modellsystem för att studera celler beteenden såsom polaritet utveckling och form ändras under epiteliala morfogenes. Traditionell histologi av fast prov i allt högre grad kompletteras med live-cell konfokala imaging. Här visar vi metoder för att isolera groda vävnader och visualisera leva epitelceller och cytoskelettet med live-cell konfokalmikroskopi.
Abstract
Embryonala epitelceller tjäna som en idealisk modell för att studera morfogenes där flercelliga vävnader genomgår förändringar i sin geometri, till exempel förändringar i cellernas yta och cell höjd, och där celler genomgår mitos och migrera. Dessutom kan epitelceller reglerar också morfogenetiska rörelser i intilliggande vävnad<sup> 1</sup>. En traditionell metod för att studera epiteliala celler och vävnader innebär kemisk fixering och histologiska metoder för att bestämma cellmorfologin eller lokalisering av särskilt proteiner av intresse. Dessa metoder fortsätta att vara användbara och ge "ögonblicksbilder" av cell former och vävnader arkitektur är dock mycket kvar att förstå hur celler förvärva specifika former, hur olika proteiner flytta eller lokalisera till särskilda positioner, och vad stigar celler följa mot sin slutliga differentierade öde. Högupplöst Bildproduktion kompletterar traditionella metoder och tillåter också mer direkt utredning dynamiska cellulära processer är inblandade i bildning, underhåll och morfogenes av flercelliga epiteliala ark. Här visar vi experimentella metoder från den isolering av vävnader djur keps från<em> Xenopus laevis</em> Embryon till konfokal avbildning av epitelceller och enkla metoderna mätning som tillsammans kan öka molekylära och cellulära studier av epitelceller morfogenes.
Protocol
Discussion
Vi har presenterat experimentell protokoll som används regelbundet i vårt labb för att bilden dynamiskt föränderliga cytoskelettet i apikala cellen cortex och oscillerande cellmembranen av epitelceller i Xenopus embryon. Man bör använda dessa protokoll som utgångspunkt för live-avbildning av epitelceller former, optimering av detta protokoll är viktigt och en del inställningar kommer att ändras beroende på vilken typ av mikroskop systemet man har och vilken typ av proteiner man är intresserad av b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health (R01-HD044750), en karriär bidrag från National Science Foundation, och stöd från American Heart Association (början Grant-i-stöd). Författarna tackar Davidson Lab medlemmar: HY Kim, M. von Dassow och J. Zhou (för hjälp med dagliga lab ansvar), och Lin Zhang för hennes stöd i molekylärbiologi och syntetisera mRNA. Vi erkänner experimentella ansträngningar från alla groda Labs (speciellt Ray Kellers och Doug DeSimone s) som har bidragit till någon del av detta protokoll, genom att utveckla och testa olika metoder genom åren. Vi tackar Richard Harland och John Wallingford för deras vänliga gåvor av leda-GFP och moesin-GFP plasmider respektive.
References
- Ninomiya, H., Winklbauer, R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).
- Kay, B. K., Peng, H. B. . Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , (1991).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. , (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).
- Joshi, S. D., Dassow, M. v. o. n., Davidson, L. A. Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction. Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).
