ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.
Abstract
תפקוד החלבון מצמידים הדוק לוקליזציה חלבון. למרות שחלק חלבונים מוגבלים במיקום מסוים או תא subcellular, חלבונים רבים נמצאים כאוכלוסייה לשדר באופן חופשי בתמורה חופשי עם האוכלוסייה משנה הקשור באופן הדוק עם תחום מבנה subcellular מסוים. חלוקה ב subcellular באתרו מאפשרת ויזואליזציה של חלבון מידור יכול גם לגלות חלבון תת אוכלוסיות למקם מבנים ספציפיים. למשל, הסרת חלבונים מסיסים cytoplasmic וחלבונים גרעיני שנערך רופף יכול לחשוף את הקשר היציב של כמה גורמי שעתוק עם הכרומטין. לאחר העיכול של דנ"א יכולה במקרים מסוימים לחשוף בשיתוף עם רשת של חלבונים RNAs אשר נקרא קולקטיבי הפיגום גרעיני או מטריצה גרעיני.
כאן אנו מתארים את השלבים הנדרשים במהלך של חלוקה באתרו של בתאי יונקים חסיד ולא חסיד על coverslips מיקרוסקופ. ויזואליזציה חלבון יכולה להיות מושגת באמצעות נוגדנים ספציפיים או חלבונים היתוך ניאון מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נוגדנים ו / או צבעי ניאון כי לשמש סמנים של תאים או מבנים ספציפיים לאפשר לוקליזציה חלבון למפות בפירוט. חלוקה ב באתרו ניתן גם לשלב עם המערבי סופג להשוות את כמויות החלבון הנמצאים בכל חלק. גישה זו ביוכימי פשוט יכול לחשוף עמותות שאחרת להישאר מבלי שיבחינו בו.
Protocol
I. הכנה חלוקה סעיף זה מתאר את ההכנה של פולי-L-ליזין coverslips מיקרוסקופ מצופה את הקובץ המצורף של תאים לפני חלוקה. אם יש צורך בתאים ניתן transfected transiently עם וקטורים ביטוי חלבון לפני או אחרי המצורף. א הכנת pol…
Discussion
בעיות נפוצות והצעות:
כל או רוב התאים הם איבדו במהלך הכביסה. במהלך השלבים כביסה נוזלים יש להוסיף באיטיות לצד צלחת 6-היטב את הימנעות coverslip. כמו כן נוזלים יש להסיר על ידי הטיית הצלחת בזהירות ולאט לאט pipetting את הנוזלים העודפים. הידבקות התא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai ו Nazefah עבדול חמיד מודים לממשלת רויאל תאילנדי ממשלת מלזיה בהתאמה Ph.D. מלגות. עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט להעניק הוענק PSJ ו KG. אנחנו גם מודה לאוניברסיטת מתקן bioimaging וולפסון בריסטול.
Sawasdichai, A., Chen, H., Abdul Hamid, N., Jayaraman, P., Gaston, K. In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (41), e1958, doi:10.3791/1958 (2010).