In situ subcellulaire fractionatie van zoogdiercellen op microscoop dekglaasjes kan de visualisatie van eiwit lokalisatie.
Eiwit-functie is nauw gekoppeld aan eiwit lokalisatie. Hoewel sommige eiwitten zijn beperkt tot een specifieke locatie of subcellulaire compartiment, veel eiwitten aanwezig zijn als een vrij verspreiden van de bevolking in de vrije uitwisseling met een sub-populatie die nauw is gekoppeld aan een bepaalde subcellulaire domein of structuur. In situ subcellulaire fractionering kan de visualisatie van eiwit verkokering en kan ook zien eiwit subpopulaties die lokaliseren om specifieke structuren. Bijvoorbeeld, kan verwijdering van de oplosbare cytoplasmatische eiwitten en losjes nucleaire eiwitten onthullen de stabiele vereniging van een aantal transcriptiefactoren met chromatine. Latere spijsvertering van DNA kan in sommige gevallen openbaren associatie met het netwerk van eiwitten en RNA's die collectief wordt genoemd de nucleaire steiger of nucleaire matrix.
Hier beschrijven we de stappen die nodig zijn tijdens de in situ fractionering van het aanklevende en niet-hechtende cellen van zoogdieren op microscoop dekglaasjes. Eiwit visualisatie kan worden bereikt met behulp van specifieke antilichamen of TL-fusie-eiwitten en fluorescentie microscopie. Antilichamen en / of fluorescente kleurstoffen die fungeren als markers voor specifieke vakken of structuren laten eiwit lokalisatie in kaart worden gebracht in detail. In situ fractionering kan ook worden gecombineerd met western blotting om de hoeveelheden eiwit aanwezig is in elke fractie vergelijken. Deze eenvoudige biochemische benadering kan onthullen verenigingen die anders onopgemerkt zouden blijven.
Vaak voorkomende problemen en suggesties:
Alle of de meeste van de cellen verloren zijn gegaan tijdens het wassen. Tijdens het wassen stappen vloeistoffen moeten langzaam worden toegevoegd aan de kant van de 6-wells plaat het vermijden van de dekglaasje aan. Op dezelfde vloeistoffen moeten worden verwijderd door voorzichtig kantelen van de plaat en langzaam pipetteren overtollige vloeistof. Celadhesie kan worden verhoogd met behulp van poly-L-Lysine beklede dekglaasjes.
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
Anyaporn Sawasdichai en Nazefah Abdul Hamid Met dank aan de Koninklijke Thaise regering en de regering van Maleisië respectievelijk Ph.D. Beurzen. Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust projectsubsidie toegekend aan PSJ en KG. We zijn ook dankbaar voor de Universiteit van Bristol Wolfson BioImaging Facility.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
Trypsin | Chemical | |||
EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |