Summary
प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए सामान्य रोगी उत्परिवर्तन द्वारा संचालित एक इम्यूनोसक्षम, ऑटोक्थोनस ट्यूमर मॉडल का उपयोग करना इम्यूनोथेराप्यूटिक परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल प्लास्मिड डीएनए के इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण का उपयोग करके मस्तिष्क ट्यूमर माउस मॉडल उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है जो सामान्य रोगी उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है, इस प्रकार एक सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत माउस मॉडल प्रदान करता है।
Abstract
ट्यूमर मॉडल नए, अधिक प्रभावोत्पादक उपचारों की खोज के मामले में मस्तिष्क ट्यूमर के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं। इम्यूनोथेरेपी में महत्वपूर्ण रुचि के साथ, मस्तिष्क में ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी और उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक सुसंगत, चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक, इम्यूनोसक्षम माउस मॉडल होना और भी महत्वपूर्ण है। जबकि अधिकांश प्रीक्लिनिकल मॉडल स्थापित ट्यूमर सेल लाइनों के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण का उपयोग करते हैं, यहां प्रस्तुत मॉडलिंग सिस्टम विवो में विभाजित तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में डाले गए डीएनए संरचनाओं से क्रमिक, अभी तक प्रभावी विकास में रोगी-विशिष्ट ट्यूमर उत्परिवर्तन के "व्यक्तिगत" प्रतिनिधित्व की अनुमति देता है। डीएनए संरचनाओं में दोहरे-रिकोम्बिनेस-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (एमएडीआर) विधि के साथ मोज़ेक विश्लेषण की सुविधा होती है, जो ड्राइवर उत्परिवर्तन के एकल-प्रतिलिपि, दैहिक म्यूटेनेसिस की अनुमति देता है। जन्म और 3 दिन की उम्र के बीच नवजात माउस पिल्ले का उपयोग करके, एनपीसी को पार्श्व वेंट्रिकल्स को अस्तर करने वाली इन विभाजित कोशिकाओं का लाभ उठाकर लक्षित किया जाता है। वेंट्रिकल्स में डीएनए प्लास्मिड (जैसे, एमएडीआर व्युत्पन्न, ट्रांसपोसन, सीआरआईएसपीआर-निर्देशित एसजीआरएनए) के माइक्रोइंजेक्शन के बाद पैडल का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन किया जाता है जो सिर के रोस्ट्रल क्षेत्र को घेरता है। विद्युत उत्तेजना पर, डीएनए को विभाजित कोशिकाओं में ले जाया जाता है, जिसमें जीनोम में एकीकृत होने की क्षमता होती है। इस पद्धति का उपयोग बाल चिकित्सा और वयस्क मस्तिष्क ट्यूमर दोनों को विकसित करने में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है, जिसमें सबसे आम घातक मस्तिष्क ट्यूमर, ग्लियोब्लास्टोमा शामिल है। यह लेख इस तकनीक का उपयोग करके एक मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल विकसित करने के विभिन्न चरणों पर चर्चा करता है और प्रदर्शित करता है, जिसमें युवा माउस पिल्ले को एनेस्थेटाइज करने की प्रक्रिया, प्लास्मिड मिश्रण के माइक्रोइंजेक्शन, इसके बाद इलेक्ट्रोपोरेशन शामिल है। इस ऑटोकॉन्थोनस, इम्यूनोसक्षम माउस मॉडल के साथ, शोधकर्ताओं के पास प्रभावोत्पादक कैंसर उपचार को बेहतर बनाने और जांचने के प्रयासों में प्रीक्लिनिकल मॉडलिंग दृष्टिकोण का विस्तार करने की क्षमता होगी।
Introduction
मस्तिष्क ट्यूमर के गठन और उपचार के तंत्र को समझने के लिए मुराइन ब्रेन ट्यूमर मॉडल महत्वपूर्ण हैं। वर्तमान मॉडल में आमतौर पर आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ट्यूमर सेल लाइनों के तेजी से उत्पादित चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण शामिल होते हैं, जो सीमित संख्या में ड्राइवर म्यूटेशन या रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल पर आधारित होते हैं, इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों का उपयोग करते हुए जो उचित इम्यूनोथेरेपी अध्ययनमें बाधा डालते हैं 1,2,3,4. इसके अतिरिक्त, ये प्रीक्लिनिकल परिणाम झूठे सकारात्मक हो सकते हैं, जिसमें ऐसे मॉडल चिकित्सा के जवाब में नाटकीय, अक्सर उपचारात्मक प्रभाव प्रदर्शित कर सकते हैं, लेकिन यह क्लिनिक 2,5,6,7 में अनुवाद नहीं करता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल का तेजी से उत्पादन करने की क्षमता होना जो रोगी उत्परिवर्तन हस्ताक्षर के अधिक प्रतिबिंबित होते हैं, प्रीक्लिनिकल परिणामों की वैधता में सुधार के लिए अनिवार्य है।
डीएनए प्लास्मिड का इलेक्ट्रोपोरेशन (ईपी)-आधारित वितरण कार्य के नुकसान (एलओएफ) और गेन ऑफ फंक्शन (जीओएफ) उत्परिवर्तन दोनों को प्रेरित करने के लिए ऐसे मॉडल ों की पीढ़ी की अनुमति देता है। हमने जीओएफ ड्राइवर म्यूटेशन के और भी सटीक प्रतिनिधित्व के लिए एक विधि विकसित की है जिसे दोहरे-रिकॉम्बिनेस-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज, या एमएडीआर8 के साथ मोज़ेक विश्लेषण कहा जाता है। यह विधि दैहिककोशिकाओं में एक नियंत्रित, लोक-विशिष्ट तरीके से रुचि के जीन (या जीन) की अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। अन्य आणविक उपकरणों के साथ संयोजन में, जैसे कि नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर), माउस ब्रेन ट्यूमर मॉडल विकसित करने के लिए विभिन्न रोगी उत्परिवर्तन ों को जोड़ा जा सकता है। इस विधि का उपयोग विभिन्न बाल चिकित्सा मस्तिष्क ट्यूमर के लिए किया गया है, जिसमें ग्लियोमास और एपेंडिमोमास8, साथ ही वयस्क मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल, जैसे ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) शामिल हैं।
जबकि ट्यूमर मॉडलिंग की ईपी विधि एक प्रत्यारोपण के रूप में आम नहीं है, निम्नलिखित इस मॉडलिंग प्रणाली की आसानी और उच्च प्रजनन क्षमता को दर्शाता है। एमटीएमजी चूहों का उपयोग एमएडीआर-प्लास्मिड डीएनए 8,9 के सम्मिलन के लिए किया जाता है। यह प्रणाली दाता डीएनए प्लास्मिड (यानी, जीओएफ जीन ऑफ इंटरेस्ट) 8,9 के बाद के सम्मिलन के लिए रोसा 26 लोकस में स्थित लॉक्सपी और एफएलपी रिकोम्बिनेस टारगेट (एफआरटी) साइटों के पुनर्संयोजन की अनुमति देती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल मेहनती अभ्यास के बाद इस विधि की सीधेपन को प्रदर्शित करता है, और माउस ब्रेन ट्यूमर मॉडल को एक स्वचालित, सुसंगत तरीके से विकसित करने की क्षमता को दर्शाता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं को सीडर सिनाई मेडिकल सेंटर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। होमोजीगस एमटीएमजी चूहों को सी 57बीएल / 6 जे चूहों के साथ पैदा किया गया था ताकि निम्नलिखित प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए मिश्रित-लिंग, विषम एमटीएमजी चूहों के कूड़े प्राप्त किए जा सकें। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)। माउस पिल्ले को प्रसवोत्तर दिनों 0 और 3 (पी 0-पी 3) के बीच इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था।
1. सर्जिकल सेटअप
- रासायनिक कीटाणुनाशक (जैसे, विमोबा) के साथ सर्जिकल टेबल को स्प्रे करें और पोंछ दें, इसके बाद 70% इथेनॉल, और फिर से पोंछ दें।
- सर्जिकल टेबल पर निम्नलिखित उपकरणों / सामग्रियों को रखें: खींचे गए ग्लास केशिका पिपेट (पिपेट खींचने के तरीके पर संदर्भ10 देखें), छोटी कैंची, छोटे बायोहेजार्ड शार्प ्स वेस्ट कंटेनर, माइक्रोलीटर पिपेटर और पिपेट टिप्स, पैराफिन फिल्म के 2 एक्स कटे हुए वर्ग टुकड़े, इलेक्ट्रोड जेल, इलेक्ट्रोड, माइक्रोइंजेक्टर के लिए धारक, और डीएनए प्लास्मिड मिश्रण (सामग्री और पूरक फ़ाइल 1 की तालिका देखें)।
- संकेत दिए जाने पर सर्जिकल टेबल पर या फर्श पर उपकरण पर निम्नलिखित संलग्नक रखें: माइक्रोइंजेक्टर कंट्रोल पैनल, धारक और मशीन से जुड़े प्लग, माइक्रोइंजेक्टर धारक को साइड में रखने के लिए खड़े हैं (सोल्डरिंग सहायता), माइक्रोइंजेक्टर पैर पेडल (फर्श पर), मशीन से जुड़े इलेक्ट्रोड, और इलेक्ट्रोड फुट पेडल (फर्श पर) (सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: इलेक्ट्रोड फुट पेडल को उपयोग के क्रम के अनुस्मारक के रूप में माइक्रोइंजेक्टर फुट पेडल के दाईं ओर रखा गया था। - माइक्रोइंजेक्टर और इलेक्ट्रोड नियंत्रण पैनल चालू करें।
- माइक्रोइंजेक्टर पर सेटिंग्स की जांच करें जो प्रयोग के लिए सही हैं: दबाव 220-450 एचपीए के बीच होना चाहिए, यह इस बात पर निर्भर करता है कि प्लास्मिड मिश्रण कैसे लिया जाता है।
- इलेक्ट्रोड पैनल पर सेटिंग्स की जांच करें जो प्रयोग के लिए सही हैं।
नोट: वर्तमान प्रयोग (और हमारे अधिकांश मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल) के लिए, 120 वी (50 एमएस; 950 एमएस से अलग) की पांच दालों का उपयोग किया जाता है।
2. पूर्व शल्य चिकित्सा तैयारी
- माइक्रोइंजेक्टर में प्लास्मिड मिश्रण तैयार करें।
- एक खींचे गए ग्लास केशिका पिपेट को पुनः प्राप्त करें और इसे माइक्रोइंजेक्टर धारक में डालें। सुनिश्चित करें कि टिप को जगह पर रखने के लिए पेंच किया गया है।
- एक हाथ में माइक्रोइंजेक्टर धारक और दूसरे हाथ से छोटी कैंची पकड़ें; पिपेट की नोक को एक छोटे से शार्प्स बायोहेजार्ड कंटेनर पर रखें। कैंची बंद होने के साथ, लंबे ग्लास केशिका पिपेट पर हल्के से दबाएं। जहां मोड़ दिखाई देता है, उसे काटें, उद्घाटन से लगभग 2 मिमी। यदि कट सफल दिखता है, तो सावधानी से साइड में रखें।
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड मिक्स ट्यूब को सर्जिकल टेबल पर सपाट रखें और खोलें। प्लास्मिड मिश्रण तैयार करते समय इसे स्थिर रखने के लिए ट्यूब के तल के पीछे पिपेट टिप बॉक्स या कोई अन्य आइटम रखें। ग्लास पिपेट जो माइक्रोइंजेक्टर लाइन से जुड़ा हुआ है, उसे टेबल पर सपाट रखें और प्लास्मिड मिश्रण की ट्यूब में धीरे से डालें, यह सुनिश्चित करें कि टिप ट्यूब के तल के पास मिश्रण में अच्छी तरह से है।
नोट: प्राकृतिक गुरुत्वाकर्षण चूषण के कारण, प्लास्मिड मिक्स सक्शनिंग सक्रिय रूप से खींचने से पहले ग्लास पिपेट में शुरू हो जाएगा। - प्लास्मिड मिश्रण में ग्लास पिपेट की नोक के साथ, खींची जा रही मात्रा को बढ़ाने के लिए माइक्रोइंजेक्टर पैनल का उपयोग करें। 0 से शुरू करते हुए, दाएं नॉब को मोड़ें और -60 की ओर नकारात्मक दिशा में डायल करें-यह प्लास्मिड मिश्रण को ग्लास पिपेट में लाएगा। केवल ~ 1 इंच प्लास्मिड मिश्रण लाएं। नॉब को वापस 0 पर घुमाएं, और फिर मिश्रण से पिपेट टिप को हटा दें।
नोट: नकारात्मक दिशा में रहते हुए मिश्रण से पिपेट टिप को न हटाएं, क्योंकि यह मिश्रण को माइक्रोइंजेक्टर और संभवतः टयूबिंग में शूट करेगा। - पैराफिन फिल्म की एक पट्टी पर मिश्रण को इंजेक्ट करके एक इंजेक्शन में मिश्रण की मात्रा का परीक्षण करें। पैर पेडल का उपयोग करें और पैराफिन फिल्म पर मिश्रण को इंजेक्ट करने के लिए एक बार दबाएं। पैराफिन फिल्म पर मिश्रण लेने के लिए 1 μL पर पिपेटर सेट का उपयोग करें यह देखने के लिए कि क्या यह बिल्कुल 1 μL है।
नोट: यदि यह 1 μL से थोड़ा कम है, तो माइक्रोइंजेक्टर का दबाव बढ़ाया जा सकता है। यदि दबाव 450 एचपीए तक पहुंच रहा है और अभी भी 1 μL से कम है, तो ग्लास पिपेट ओपनिंग बहुत छोटी है और इसे और अधिक ट्रिम करने की आवश्यकता होगी। ट्रिमिंग से पहले प्लास्मिड मिश्रण को वापस ट्यूब में रखने का सुझाव दिया जाता है। इसके बावजूद, कैंची पर अभी भी एक अवशिष्ट मिश्रण होगा, इसलिए किसी भी शेष मिश्रण को हटाने के लिए डीनेस के साथ बाद में कैंची को अच्छी तरह से साफ करना अनिवार्य है। यदि इंजेक्शन 1 μL से अधिक है, तो एक नए खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करने और छंटनी करने की आवश्यकता होगी। जब परीक्षण राशि बिल्कुल 1 μL होती है, तो ग्लास पिपेट टिप सही आकार में होता है। - प्रक्रिया के लिए अतिरिक्त प्लास्मिड मिश्रण में खींचने के लिए चरण 2.1.4 को दोहराएं, या खींचे गए ग्लास पिपेट में लगभग 2-3 इंच। सुनिश्चित करें कि मिश्रण माइक्रोइंजेक्टर में बहुत दूर नहीं जाता है जहां कोई अंत नहीं देख सकता है।
नोट: प्लास्मिड मिश्रण में ड्राइंग करते समय, हवा के बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है। यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो खींचे गए ग्लास पिपेट से प्लास्मिड मिश्रण को हटाकर और फिर से शुरू करके इस चरण को फिर से करना आवश्यक है। पिल्ला के वेंट्रिकल में इंजेक्शन लगाते समय मौजूद हवा के बुलबुले निम्नलिखित चरणों के लिए हानिकारक होंगे। - खींचे गए ग्लास पिपेट में प्लास्मिड मिश्रण तैयार होने के साथ, तैयार पिपेट को सोल्डरिंग एड स्टैंड पर किनारे पर रखें और रास्ते से बाहर रखें ताकि गलती से इसे छूना / टक्कर न हो।
- प्रयोग के लिए जानवरों को तैयार करें।
- पिल्ले को एनेस्थेटाइज करने के लिए एक बर्फ की बाल्टी तैयार करें। पिघलने के लिए बर्फ की बाल्टी में पानी जोड़ें और एनेस्थेटाइजिंग धारक (जैसे, पिपेट बॉक्स टॉप) को ठंडा करने में मदद करें।
- बॉक्स को पिघली हुई बर्फ पर ठंडा होने के लिए रखें।
- पिंजरे से पिल्ला (ओं) को ध्यान से निकालें और उन्हें ठंडा बॉक्स टॉप में रखें, जो बर्फ पर रहता है। शीतलन प्रक्रिया में मदद करने के लिए नीचे के ऊपर एक और शीर्ष रखें।
- 2-3 मिनट के बाद, पिल्ले की जांच करें। प्रवण स्थिति में रहते हुए पिल्ले को एक दूसरे से अलग करें।
नोट: पिल्ले बच जाएंगे, लेकिन यह धीमा हो जाएगा क्योंकि ठंडा एनेस्थेटाइजेशन शुरू होता है। पिल्ले को आसानी से देखने के लिए बॉक्स टॉप को छोड़ दिया जा सकता है। - उचित संज्ञाहरण की जांच करने के लिए, पिल्ला की पूंछ को चुटकी लें और प्रतिक्रिया की तलाश करें। यदि कोई प्रतिक्रिया होती है, तो चरण 2.2.4 दोहराएँ। यदि कोई स्क्वील या थोड़ा आंदोलन नहीं किया जाता है, तो पिल्ला प्रक्रिया के लिए तैयार है।
नोट: चूहों को विस्तारित अवधि के लिए बर्फ पर नहीं रखा जाना चाहिए क्योंकि यह प्रक्रिया के बाद ठीक होने की उनकी क्षमता को प्रभावित करेगा। संज्ञाहरण के तहत अभी भी इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेट दोनों किए जा सकने वाले पिल्लों की संख्या को एक समय में बर्फ पर रखा जाना चाहिए; अनुभव के साथ अधिक संख्या में काम किया जा सकता है।
3. मस्तिष्क वेंट्रिकल में डीएनए प्लास्मिड मिश्रण का माइक्रोइंजेक्शन।
- उदर स्थिति में मेज पर एक पिल्ला रखें।
- त्वचा के माध्यम से खोपड़ी सीवन की कल्पना करने के लिए सिर के पीछे थोड़ा पीछे खींचें। खोपड़ी पर लैम्ब्डा का पता लगाएं। वेंट्रिकल/इंजेक्शन साइट लैम्ब्डा और आंख के बीच में होगी।
नोट: लैम्ब्डा वह जगह है जहां धनु और लैम्बडोइड सीवन प्रतिच्छेद करते हैं। माउस खोपड़ी पर लैम्ब्डा की पहचान के लिए संदर्भ11 देखें। - एक लंबवत कोण पर ग्लास पिपेट टिप के साथ त्वचा को छेदें (पिपेट सीधे छत की ओर है)। खोपड़ी और प्रारंभिक प्रतिरोध पर दबाव डालते समय एक मामूली अवतल इंडेंटेशन का निरीक्षण करें। एक बार छेद ने और ग्लास पिपेट टिप अवतल इंडेंटेशन के माध्यम से निकल जाता है, तो उचित इंजेक्शन स्तर तक पहुंच जाता है।
- ग्लास पिपेट टिप को जगह में रखें और प्लास्मिड मिश्रण के 1 μL इंजेक्ट करने के लिए एक बार माइक्रोइंजेक्टर पैर पेडल दबाएं।
नोट: स्पष्ट रूप से देखने के दो तरीके हैं कि इंजेक्शन सफल था। सबसे पहले, एक अन्य प्रयोगशाला सदस्य को ग्लास पिपेट में प्लास्मिड मिश्रण को नीचे जाते हुए देखें क्योंकि इसे इंजेक्ट किया जाता है। इसके अलावा, यदि प्लास्मिड मिश्रण में फास्ट ग्रीन या किसी अन्य डाई का उपयोग किया जाता है, तो डाई एक बार इंजेक्शन के बाद त्वचा के नीचे वेंट्रिकल में स्पष्ट रूप से फैल जाएगी और सर्जिकल लैंप तक पकड़े जाने पर आसानी से दिखाई देती है।
4. इलेक्ट्रोपोरेशन
- टेबल पर पैराफिन फिल्म (एक वर्ग) का एक टुकड़ा रखें और फिल्म के शीर्ष पर इलेक्ट्रोड जेल को निचोड़ें। प्रत्येक पैडल पर एक उदार मात्रा में ब्रश करके इलेक्ट्रोड पैडल को इलेक्ट्रोड जेल में कवर करें। कोई भी अतिरिक्त जेल जो टपक रहा है, उसे पेपर टॉवल पर स्वाइप किया जा सकता है।
नोट: पहले ईपी के बाद, प्रत्येक पैडल से जेल को दूसरी तरफ छूने न दें। यह चार्ज को स्थानांतरित करेगा और, पिल्ला के सिर पर लागू करते समय, एक सिज़लिंग ध्वनि सुनाई दे सकती है। यह तब भी होगा जब एक इलेक्ट्रोड से पिल्ला के सिर पर जेल दूसरे से जेल के संपर्क में आता है।
सावधानी: इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान उंगलियों को पैडल से दूर रखने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। - पिल्ला के शरीर को एक हाथ (आमतौर पर गैर-प्रमुख हाथ) में पकड़ें, उंगलियों को सिर के पीछे अच्छी तरह से रखें।
नोट: यदि दाएं हाथ से, पिल्ला को बाएं हाथ से और इलेक्ट्रोड को दाईं ओर से पकड़ना सबसे आसान है। यदि बाएं हाथ से काम करते हैं, तो इसके विपरीत करें। - यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे उचित स्थिति में हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रोड को पिल्ला के सिर के करीब लाएं कि वे उचित स्थिति में हैं, जहां वेंट्रिकल को लक्षित किया जा रहा है (उदाहरण के लिए, यदि बाएं वेंट्रिकल को लक्षित किया जा रहा है, तो पिल्ला के बाईं ओर सकारात्मक और पिल्ला के दाईं ओर नकारात्मक रखें)। इलेक्ट्रोड की स्थिति बनाते समय, सिर को स्थिति में उठाने में मदद करने के लिए धीरे-धीरे शरीर / गर्दन के पृष्ठीय पक्ष पर एक उंगली (आमतौर पर अंगूठे) को सिर के पीछे की ओर स्लाइड करें।
- पूंछ को चुटकी देकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें और इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ केवल तभी आगे बढ़ें जब पिल्ला संज्ञाहरण के उपयुक्त विमान में हो। माउस के सिर के रोस्ट्रल हिस्से पर इलेक्ट्रोड पैडल को हल्के से निचोड़ें, उन्हें आंखों पर रखें। इलेक्ट्रोपोरेशन शुरू करने के लिए एक बार इलेक्ट्रोड फुट पेडल दबाएं। यह प्रोटोकॉल 120 वी की पांच दालों का उपयोग करता है (50 एमएस, 950 एमएस से अलग); प्रत्येक नाड़ी श्रव्य होगी।
- प्रत्येक पल्स के साथ, इलेक्ट्रोड पैडल को काउंटर-क्लॉकवाइज दिशा में थोड़ा घुमाएं ताकि सकारात्मक पैडल सिर के शीर्ष की ओर बढ़ रहा हो।
नोट: उचित इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ, कोई भी प्रत्येक पल्स के साथ माउस पिल्ला के शरीर को हिलता हुआ महसूस / देखेगा।
- प्रत्येक पल्स के साथ, इलेक्ट्रोड पैडल को काउंटर-क्लॉकवाइज दिशा में थोड़ा घुमाएं ताकि सकारात्मक पैडल सिर के शीर्ष की ओर बढ़ रहा हो।
- अंतिम नाड़ी के बाद, पैडल को हटा दें और साइड में रखें। पिल्ला को एक साफ पेपर तौलिया पर ले जाएं और एक अन्य प्रयोगशाला सदस्य को पिल्ला के सिर से जेल को साफ करें और पेपर तौलिया "नाव" पर हीट लैंप के नीचे रखें।
नोट: सुनिश्चित करें कि गर्मी दीपक पिल्ले के बहुत करीब नहीं है। सुनिश्चित करें कि इस कदम के साथ एक और प्रयोगशाला सदस्य की मदद करें और पिल्ले पर लगातार नजर रखें। यह अक्सर पिल्ले के लिए गर्मी बढ़ाने के लिए गर्मी लैंप के नीचे पिल्ले को एक हाथ में पकड़ने में मदद करता है। धीरे से पिल्ला के पेट की मालिश करने से भी वसूली में मदद मिल सकती है। - पिल्लों को घर के पिंजरे में वापस कर दें जब उनके शरीर में एक स्वस्थ गुलाबी रंग हो जाए और हल्की पूंछ की चुटकी के लिए एक स्पष्ट प्रतिक्रिया हो।
नोट: उन्हें पिंजरे में वापस रखने से पहले, घर के पिंजरे बिस्तर सामग्री की एक छोटी मात्रा लें और पिंजरे की खुशबू के लिए पिल्ले को हल्के से ब्रश करें। पिल्ले को बिस्तर सामग्री के नीचे पिंजरे में वापस रखें और होल्डिंग रूम में लौट ें।
5. पोस्ट-सर्जिकल चरण
- अप्रयुक्त प्लास्मिड मिश्रण को माइक्रोइंजेक्टर ग्लास पिपेट से ट्यूब में वापस लौटाएं। यदि पर्याप्त मिश्रण बचा है, तो इसका उपयोग भविष्य की प्रक्रियाओं में किया जा सकता है। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- पेपर तौलिए के साथ इलेक्ट्रोड पैडल से जेल को पोंछ लें।
- सभी उपकरण भागों को उनके मूल स्थान पर वापस करें।
नोट: यदि प्लास्मिड मिश्रण लेने के बाद ग्लास पिपेट टिप को काटने के लिए कैंची का उपयोग किया गया था, तो कैंची को डीनेस समाधान के साथ अच्छी तरह से साफ करने के लिए छोड़ दें। - रासायनिक कीटाणुनाशक के साथ मेज को स्प्रे करें, फिर पोंछ दें, इसके बाद 70% इथेनॉल का स्प्रे करें, फिर फिर से पोंछ दें।
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Representative Results
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग बाल चिकित्सा और वयस्क मस्तिष्क ट्यूमर माउस मॉडल दोनों को सफलतापूर्वक विकसित करने के लिए किया गया है, जिसमें पूर्व किम एट अल .8 में व्यापक विस्तार से प्रकाशित किया गया है। प्लास्मिड डिजाइन की उचित तकनीक और सावधानीपूर्वक योजना के साथ, ट्यूमर के ईपी विकास के लिए सफलता आमतौर पर 100% है। हिस्टोलॉजी सफल डीएनए प्लास्मिड सम्मिलन की जांच करने का सबसे तेज़ और आसान तरीका है जब एक रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में 100% पेनेट्रेंस के साथ जीबीएम ब्रेन ट्यूमर मॉडल विकसित करने के तरीके पर कदम शामिल हैं, जैसा कि हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है। एक एमएडीआर दाता प्लास्मिड ने एक रिपोर्टर प्रोटीन (एसएमटैगबीएफपी 2-वी 5) और स्पास 9 (पूरक फ़ाइल 1) दोनों को व्यक्त किया। एनएफ 1 और टीआरपी 53 पर निर्देशित दो मजबूत ड्राइवर एलओएफ ट्यूमर शमन जीन सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को भी शामिल किया गया था (एसजीआरएनए क्लोनिंग रणनीति के लिए संदर्भ12 देखें; इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। अंत में, सीआरई और एफएलपी रिकॉम्बिनेस प्लास्मिड को रोसा 26 लोकस में पुनर्संयोजन के लिए प्लास्मिड मिश्रण में जोड़ा गया था (चित्रा 1 ए; पूरक फ़ाइल 1 देखें)। ईपी के बाद 5 महीने तक चूहे मृत थे, रिपोर्टर प्रोटीन और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 1 बी) के माध्यम से पूर्ण ट्यूमर वृद्धि का पता लगाया गया था।
चित्र 1: ईपी के बाद 5 महीने में सफल ट्यूमर विकास का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन । (ए) एसपीसीएएस 9 के लिए एमएडीआर दाता प्लास्मिड और रिपोर्टर प्रोटीन टैगबीएफपी 2-वी 5। प्लास्मिड मिश्रण में एक क्रे-एफएलपी रिकॉम्बिनेस प्लास्मिड भी शामिल था, जिसमें एनएफ 1 और टीआरपी 53 पर निर्देशित एसजीआरएनए शामिल थे। (बी) एनएफ 1 और टीआरपी 53 एलओएफ द्वारा संचालित जीबीएम ट्यूमर के 5 महीने बाद ईपी पर लिया गया एक कोरोनल सेक्शन। ट्यूमर कोशिकाओं को टैगबीएफपी-वी 5 रिपोर्टर प्रोटीन के साथ लेबल किया जाता है जो एसपीसीएएस 9 (बी 3) से जुड़ा होता है। विरल ईजीएफपी लेबलिंग का भी पता लगाया जाता है (बी 2) उन सभी कोशिकाओं के साथ जो टीडीटोमैटो (बी 1) के साथ लेबल किए गए प्लास्मिड को व्यक्त नहीं करते हैं। स्केल बार = 1,000 μm. संक्षेप: Ctx = कॉर्टेक्स; सीसी = कॉर्पस कॉलोसम; एलवी = पार्श्व वेंट्रिकल; एसटीआर = स्ट्रेटम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1: प्लास्मिड अनुक्रम। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी प्लास्मिड और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के पूर्ण अनुक्रम, जिनमें पीडोनर-एसएम-टैगबीएफपी 2-वी 5-पी 2 ए-एसपीसीएएस 9-डब्ल्यूपीआरई, पीकैग-एफएलपीओ-2 ए-सीआरई, और टीआरपी 53 और एनएफ 1 को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के लिए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण आणविक जीव विज्ञान के विवो उपयोग के लिए अनुमति देता है, जैसा कि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में उपयोग किया जाता है, लेकिन वायरल ट्रांसडक्शन 8,13,14 की गति, स्थानीयकरण और दक्षता के साथ। उत्तरार्द्ध के साथ, हालांकि, सुरक्षा चिंताओं के साथ-साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं भी आती हैं। हमने प्लास्मिड डीएनए के ईपी-वितरण का उपयोग करके अपनी मॉडलिंग प्रणाली में दिखाया है कि मस्तिष्क वेंट्रिकल8 में ग्लास केशिका पिपेट के प्रारंभिक सम्मिलन के कारण न्यूनतम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। इसलिए, इम्यूनोथेरेपी के लिए वर्तमान ट्यूमर मॉडलिंग सिस्टम में सुधार करने के लिए, ऊपर प्रस्तुत प्रोटोकॉल मस्तिष्क ट्यूमर के लिए अधिक समीचीन और मजबूत प्रीक्लिनिकल मॉडलिंग सिस्टम की अनुमति देता है।
इस विधि का उपयोग करके सफल ब्रेन ट्यूमर मॉडलिंग के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम प्लास्मिड डिजाइन है। जबकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है, यह बाल चिकित्सा मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल के लिए किम एट अल.8 और रिनकॉन फर्नांडीज पाचेको एट अल.10 में बड़े पैमाने पर चर्चा की गई है, साथ ही अतिरिक्त उपयोगों के लिए अन्य स्रोत15,16। जबकि हमारी प्रयोगशाला ने सफलतापूर्वक छह प्लास्मिड तक इलेक्ट्रोपोरेट किया है, एक ऊपरी सीमा होगी कि कितना डीएनए वितरित किया जा सकता है। यह ऊपरी सीमा प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता, प्लास्मिड आकार, वोल्टेज और वितरित डीएनए की मात्रा से बाधित है, जो इलेक्ट्रोपोरेशन की उम्र में मस्तिष्क वेंट्रिकल के आकार से सीमित है। इसके अलावा, मिश्रण में कई डीएनए प्लास्मिड के साथ, इंजेक्शन से पहले एक अच्छी तरह से निलंबित प्लास्मिड मिश्रण होना अनिवार्य है। यदि मिश्रण को अच्छी तरह से पुन: निलंबित नहीं किया जाता है, तो संकीर्ण ग्लास केशिका पिपेट में लेना मुश्किल होगा। इसके अलावा, उचित प्लास्मिड मिश्रण के साथ, फास्ट ग्रीन डाई (10% वी / वी) के अलावा प्रशासन के दौरान मस्तिष्क वेंट्रिकल में लिए गए प्लास्मिड मिश्रण को स्पष्ट रूप से देखने की अनुमति देता है (चरण 3.4)। हालांकि, इसके लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी यह है कि डाई ईपी8 के बाद कई हफ्तों के भीतर संसाधित ऊतक के दूर-लाल तरंग दैर्ध्य (जैसे, Cy5) में एंटीबॉडी धुंधला होने में हस्तक्षेप कर सकती है। हालांकि पहली बार ईपी सीखने पर फास्ट ग्रीन डाई बहुत मददगार होती है, लेकिन गलत-सकारात्मक धुंधलापन से बचने के लिए इसे समाप्त किया जा सकता है। यह ध्यान रखने योग्य है कि, चरण 3.4 के लिए, वेंट्रिकल में प्लास्मिड मिश्रण का वितरण दिखाई नहीं देगा, इसलिए इंजेक्शन के रूप में मात्रा कम होने के लिए ग्लास पिपेट को देखना महत्वपूर्ण होगा।
इंजेक्शन की स्थिरता और उचित हैंडलिंग के लिए, ध्यान में रखने के लिए कई कारक हैं: 1) इंजेक्शन की मात्रा। यद्यपि ग्लास केशिका पिपेट को सटीक रूप से काटने के लिए कई प्रयास हो सकते हैं (चरण 2.1.2), यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक जानवर के लिए प्लास्मिड मिश्रण का केवल 1 μL इंजेक्ट किया जाए। जानवरों के बीच मात्रा में वृद्धि या कमी निश्चित रूप से ट्यूमर के गठन की विलंबता को प्रभावित करेगी। 2) एक बार इंजेक्शन की मात्रा सेट हो जाने के बाद, माइक्रोइंजेक्टर के मापदंडों को नहीं बदला जाना चाहिए, क्योंकि यह मात्रा को प्रभावित करेगा। 3) एक बार प्लास्मिड मिश्रण को ग्लास केशिका पिपेट में लाया जाता है, तो पिपेट को रास्ते से बाहर रखा जाना चाहिए ताकि गलती से खुद को या दूसरों को न मारा जा सके। माइक्रोपिपेट स्टैंड (सोल्डरिंग सहायता; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करना जो माइक्रोइंजेक्टर धारक पर क्लिप करता है, इसके लिए उपयोगी है। हालांकि, अगर प्लास्मिड मिश्रण को जल्द ही इंजेक्ट नहीं किया जाता है, तो यह संभवतः टिप को रोक देगा। इसलिए, मस्तिष्क वेंट्रिकल में इंजेक्ट करने से तुरंत पहले पैराफिल्म के एक टुकड़े पर एक परीक्षण माइक्रोइंजेक्शन करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि छिद्र को अवरुद्ध करने वाला कोई क्लॉग नहीं है। अंत में, हर दूसरे सर्जिकल तकनीक के समान, प्रोटोकॉल का निष्पादन प्रत्येक व्यक्ति के लिए अलग है। इसलिए, एक प्रयोग में चूहों के सभी समूहों के लिए माइक्रोइंजेक्शन और / या ईपी करने वाले एक ही तकनीशियन का होना अनिवार्य है।
हमारी प्रयोगशाला में विकसित मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल ने ग्लियोमास पर ध्यान केंद्रित किया है। एक न्यूरोबायोलॉजिकल परिप्रेक्ष्य से, प्रसवोत्तर दिनों 0-3 के बीच इस विधि का प्रदर्शन ग्लियोजेनेसिस अवधि और भ्रूण न्यूरोजेनेसिस के बाद की अवधि को लक्षित करता है। वैकल्पिक मस्तिष्क ट्यूमर में रुचि के लिए समय बिंदु और / या इलेक्ट्रोड की स्थिति में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। गर्भाशय ईपी के लिए कई प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं जो तंत्रिका-आधारित ट्यूमर15,17,18 के लिए प्रासंगिक होंगे।
इस विधि की कुछ सीमाएँ हैं। सीआरआईएसपीआर, ट्रांसपोसंस का उपयोग करके एलओएफ और जीओएफ डीएनए प्लास्मिड दोनों को क्लोन और मिश्रण और मिलान करने की क्षमता, और, हाल ही में, एमएडीआर प्रणाली रोगी उत्परिवर्तन के अंतहीन संयोजनों को मॉडलिंग करने की अनुमति देती है। माइक्रोइंजेक्शन और ईपी की तकनीक अपेक्षाकृत सरल हैं, हालांकि वे सुधार करने और सुसंगत बनने के लिए कुछ अभ्यास प्रयास करते हैं। प्रस्तुत मॉडल की एक सीमा जीबीएम ट्यूमर को पूरी तरह से विकसित होने में लगने वाले समय की लंबाई है (5 महीने)। इसके बावजूद, हम वर्तमान में सामान्य रोगी ट्यूमर उत्परिवर्तन का उपयोग करके अतिरिक्त मॉडल पर काम कर रहे हैं जो 2 महीने से कम समय तक चलने वाले आक्रामक ट्यूमर के विकास का कारण बनता है। सीमाओं के अलावा, उपकरण स्वयं एक पर्याप्त प्रारंभिक निवेश है (लगभग $ 20,000- $ 30,000); हालांकि, एक बैठक में सैकड़ों चूहों को इलेक्ट्रोपोरेट करने की क्षमता प्रीक्लिनिकल प्रयोग के लिए अविश्वसनीय शक्ति की अनुमति देती है। कहा जा रहा है कि, यदि माउस प्रजनन के साथ समस्याएं हैं, तो यह सबसे बड़ी सीमा बन सकती है, क्योंकि स्वस्थ प्रजनकों और स्वस्थ कूड़े का होना अनिवार्य है।
ब्रेन ट्यूमर उपचार में प्रगति के बाद से कई दशक हो गए हैं, केमोथेरेपीटिक टेमोज़ोलोमाइड के अंतिम सबसे बड़े सुधार के साथ केवलकुछ महीनों तक जीवित रहने का विस्तार हुआ है। इम्यूनोथेरेपी ने कई अलग-अलग कैंसर में क्रांति ला दी है, लेकिन न्यूरो-ऑन्कोलॉजी में देखभाल के मानक पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालना बाकी है। दिलचस्प बात यह है कि वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले माउस ब्रेन ट्यूमर मॉडल ने इम्यूनोथेरेपी के साथ बड़ी सफलता दिखाई है, लेकिन लगातार क्लिनिक में अनुवाद करने और रोगियों के साथ सफलता दिखाने में विफल रहते हैं। इसलिए एक कदम पीछे लेना और उपयोग किए गए माउस ट्यूमर मॉडल का पुनर्मूल्यांकन करना अनिवार्य है। वर्तमान मॉडल सीमित उत्परिवर्तन के साथ पुरानी सेल लाइनों का उपयोग करने पर निर्भर करते हैं जो आमतौर पर मस्तिष्क में हजारों कोशिकाओं को इंजेक्ट करते समय रोगियों में नहीं पाए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल में चर्चा की गई तकनीक के साथ, माउस मॉडल में विभिन्न रोगी ट्यूमर म्यूटेशन प्रोफाइल को फिर से तैयार किया जाता है, जिससे एक समय सीमा के भीतर ट्यूमर के एक स्वचालित, क्रमिक विकास की अनुमति मिलती है जो इम्यूनोसक्षम चूहों में प्रीक्लिनिकल परीक्षण की अनुमति देगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और छवियों के लिए गी बम किम को धन्यवाद देते हैं। हम प्रोटोकॉल पर उपयोगी सलाह के लिए एमिली हटनाका, नाओमी कोब्रिट्ज़ और पॉल लिनेश को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
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