Summary
Este protocolo detalla los pasos involucrados en la producción y caracterización fisicoquímica de un producto probiótico secado por pulverización.
Abstract
Los probióticos y prebióticos son de gran interés para las industrias alimentaria y farmacéutica debido a sus beneficios para la salud. Los probióticos son bacterias vivas que pueden conferir efectos beneficiosos sobre el bienestar humano y animal, mientras que los prebióticos son tipos de nutrientes que alimentan a las bacterias intestinales beneficiosas. Los probióticos en polvo han ganado popularidad debido a la facilidad y practicidad de su ingestión e incorporación a la dieta como complemento alimenticio. Sin embargo, el proceso de secado interfiere con la viabilidad celular ya que las altas temperaturas inactivan las bacterias probióticas. En este contexto, este estudio tuvo como objetivo presentar todos los pasos involucrados en la producción y caracterización fisicoquímica de un probiótico secado por pulverización y evaluar la influencia de los protectores (simulada leche descremada y asociación inulina:maltodextrina) y las temperaturas de secado en el aumento del rendimiento en polvo y la viabilidad celular. Los resultados mostraron que la leche descremada simulada promovió una mayor viabilidad probiótica a 80 °C. Con este protector, la viabilidad probiótica, el contenido de humedad y la actividad del agua (Aw) se reducen siempre que aumente la temperatura de entrada. La viabilidad de los probióticos disminuye a la inversa con la temperatura de secado. A temperaturas cercanas a 120 °C, el probiótico seco mostró una viabilidad de alrededor del 90%, un contenido de humedad de 4,6% p/p y un Aw de 0,26; valores adecuados para garantizar la estabilidad del producto. En este contexto, se requieren temperaturas de secado por atomización superiores a 120 °C para garantizar la viabilidad y la vida útil de las células microbianas en la preparación en polvo y la supervivencia durante el procesamiento y almacenamiento de alimentos.
Introduction
Para ser definidos como probióticos, los microorganismos añadidos a los alimentos (o suplementos) tienen que ser consumidos vivos, ser capaces de sobrevivir durante el paso en el tracto gastrointestinal del huésped, y llegar al sitio de acción en cantidades adecuadas para ejercer efectos beneficiosos 1,2,7.
El creciente interés en los probióticos se debe a los varios beneficios para la salud humana que confieren, como la estimulación del sistema inmunológico, la reducción de los niveles de colesterol sérico y la mejora de la función de barrera intestinal al actuar contra los microbios dañinos, así como sus efectos beneficiosos en el tratamiento del síndrome del intestino irritable. entre otros 2,3. Además, varios estudios han demostrado que los probióticos pueden afectar positivamente a otras partes del cuerpo humano donde las comunidades microbianas desequilibradas pueden causar enfermedades infecciosas 3,4,5.
Para que los probióticos sean terapéuticamente efectivos, el producto debe contener entre 10 6-107 UFC/g de bacterias en el momento del consumo6. Por otro lado, el Ministerio de Salud italiano y el Ministerio de Salud de Canadá han establecido que el nivel mínimo de probióticos en los alimentos debe ser de 10a 9 UFC / g de células viables por día o por porción, respectivamente7. Teniendo en cuenta que se necesitan altas cargas de probióticos para garantizar que tendrán efectos beneficiosos, es esencial garantizar su supervivencia durante el procesamiento, el almacenamiento en estantería y el paso a través del tracto gastrointestinal (GI). Varios estudios han demostrado que la microencapsulación es un método eficaz para mejorar la viabilidad global de los probióticos 8,9,10,11.
En este contexto, se han desarrollado varios métodos para la microencapsulación de probióticos, como el secado por pulverización, la liofilización, el enfriamiento por pulverización, la emulsión, la extrusión, la coacervación y, más recientemente, los lechos fluidizados11,12,13,14. La microencapsulación por secado por pulverización (SD) es ampliamente utilizada en la industria alimentaria porque es un proceso simple, rápido y reproducible. Es fácil de ampliar y tiene un alto rendimiento de producción con bajos requisitos de energía11,12,13,14. Sin embargo, la exposición a altas temperaturas y bajo contenido de humedad puede afectar la supervivencia y viabilidad de las células probióticas15. Ambos parámetros pueden mejorarse para una cepa dada determinando los efectos de la edad y las condiciones de cultivo para preadaptar el cultivo y optimizar las condiciones de secado por pulverización (temperaturas de entrada y salida, proceso de atomización) y la composición encapsulante 8,14,16,17,18.
La composición de la solución encapsulante también es un factor importante durante la SD, ya que puede definir el nivel de protección contra condiciones ambientales adversas. La inulina, la goma arábiga, las maltodextrinas y la leche descremada son ampliamente utilizadas como agentes encapsulantes para el secado probiótico 5,17,18,19. La inulina es un fructooligosacárido que presenta una fuerte actividad prebiótica y promueve la salud intestinal19. La leche descremada es muy eficaz para mantener la viabilidad de las células bacterianas secas y genera un polvo con buenas propiedades de reconstitución17.
Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 es una bacteria del ácido láctico que produce bacteriocina y presenta actividad antilisterial, además de rasgos probióticos20,21. Es una bacteria Grampositiva heterofermentativa facultativa en forma de bastoncillo que crece de 15 °C a 37 °C20 y es compatible con la temperatura corporal homeostática. Este estudio tuvo como objetivo presentar todos los pasos involucrados en la producción y caracterización fisicoquímica de un probiótico secado por atomización (L. paraplantarum FT-259) y evaluar la influencia de los protectores y las temperaturas de secado.
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Protocol
1. Producción de las células probióticas
- Prepare el caldo De Man Rogosa y Sharpe (MRS).
- Reactivar el 1% (v/v) del cultivo de interés en el caldo MRS (aquí se utilizó Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259).
- Incubar durante 24 h a una temperatura adecuada (utilizamos 37 °C).
2. Separar las bacterias del cultivo
- Centrifugar el cultivo bacteriano a 7.197 x g durante 5 min a 4 °C utilizando tubos cónicos de 50 ml. Es importante que el peso de las trompas esté equilibrado antes del procedimiento.
- Con una pipeta, retire el sobrenadante y deséchelo en un recipiente adecuado. Lave los gránulos con un tampón fosfato (pH 7) y homogeneice la solución.
- Repita el proceso de centrifugación como se mencionó anteriormente.
- Para obtener el pellet, utilice una pipeta para extraer y desechar el sobrenadante en un recipiente apropiado.
3. Adición de coadyuvantes de secado
- Seleccione la combinación de dos composiciones auxiliares de secado (protectores): mezcla inulina:maltodextrina y leche desnatada simulada (Tabla 1)22,23.
- Pesar 5 g de inulina y 5 g de maltodextrina para obtener la primera combinación de protectores.
- Pesar 3 g de inulina, 3 g de lactosa, 0,4 g deSiO2 coloidal y 3,6 g de proteína de suero para obtener la segunda combinación de protectores.
- Agregue cada uno de los auxiliares de secado al agua ultrapura (1:10) y sométalos a agitación magnética hasta la solubilización.
- Asegúrese de que los protectores y el agua sean homogéneos, luego agregue los gránulos de probióticos a la mezcla y revuelva moderadamente durante 20 minutos.
| Coadyuvantes de secado | Inulina y maltodextrina | Leche descremada simulada |
| Maltodextrina | 5% | - |
| Proteína de suero | - | 3.60% |
| Lactosa | - | 3% |
| Inulina | 5% | 3% |
| SiO2 coloidal | - | 0.40% |
Tabla 1: Composición de los auxiliares de secado.
4. Secado por atomización
- Encienda el secador por atomización (SD) y ajuste el caudal de gas de secado, la temperatura de secado de entrada y el caudal y la presión del gas del atomizador de la siguiente manera:
Temperatura de entrada: 80 °C
Caudal de aire: 60 m³/h
Velocidad de alimentación: 4 g/min
Caudal de atomización: 17 L/min
Presión de atomización: 1.5 kgf/cm²
Diámetro de la boquilla del atomizador: 1 mm - Prepare la composición protectora y agregue los gránulos probióticos concentrados.
- Comience la alimentación de la composición probiótica (células más protectores) a través de una bomba peristáltica.
- Encienda el temporizador y coloque el recipiente de recolección de productos cuando la solución ingrese al atomizador.
- Registre la temperatura de salida cada 5 minutos para realizar un seguimiento de las posibles inestabilidades de temperatura.
- Detenga el temporizador cuando toda la composición probiótica se haya alimentado al SD.
- Pesar el recipiente de recolección de producto para determinar la cantidad de composición alimentada al sistema y la cantidad de producto seco recolectado, para calcular el rendimiento de secado (producto recuperado) a través de un balance de masa en el secador.
- Utilice leche descremada simulada para evaluar el efecto de la temperatura en la viabilidad de las células probióticas, estableciendo cinco temperaturas diferentes de secado por pulverización (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C y 160 °C frente a temperaturas de salida de 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C y 108 °C).
5. Caracterización del polvo
- Contenido de humedad del producto
- Pese con precisión 100 mg del producto seco y colóquelo en el recipiente de valoración del equipo Karl-Fischer.
- Pulse el botón de iniciación para iniciar la valoración biamperométrica del agua presente en la muestra.
- Actividad acuática
- Pesar 0,6 g del producto seco en el compartimento de muestras del higrómetro a 25 °C.
- Cierre la tapa del equipo.
NOTA: La prueba comenzará automáticamente y se detendrá cuando la muestra alcance la presión de vapor de equilibrio dentro del compartimiento de muestras.
6. Viabilidad probiótica
- Diluir las suspensiones bacterianas previamente preparadas en 9 ml de agua de peptona (0,1%, v/v).
- Vórtice hasta la dispersión completa.
- Realizar diluciones decimales seriadas (1:10) en 9 ml de solución salina (NaCl al 0,9%).
- Sembrar las diluciones en placas de agar MRS e incubar a 37 °C durante 24-48 h.
- Cuente las unidades formadoras de colonias (UFC/g) utilizando un contador de colonias con lupa.
- Calcule la viabilidad probiótica en el producto seco de acuerdo con la siguiente ecuación:
EE (%) = (N∕N o) × 100
donde, N es el número de células viables después del secado por pulverización, y No es el número de células bacterianas antes del secado por pulverización. - Expresar el número de células viables en UFC/g de dispersión del producto.
7. Análisis de datos
- Tabular los datos obtenidos en software estadístico y realizar el análisis utilizando una prueba de comparación múltiple (ANOVA).
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Representative Results
En este estudio, L. paraplantarum fue encapsulado por SD utilizando agentes encapsulantes de grado alimenticio (inulina:maltodextrina y leche en polvo simulada), mostrando alta calidad del producto y eficacia en la preservación de la viabilidad celular bacteriana17,19.
Los resultados de la DE de probióticos a 80 °C mostraron que los distintos sistemas protectores (inulina:maltodextrina y leche descremada simulada) promovieron una protección eficiente de las células probióticas, con viabilidades de 95,1% y 97,0%, respectivamente. El rendimiento del producto fue cercano al 50% p/p para ambos sistemas de protección y fue ligeramente superior para la leche descremada simulada, lo que generó un producto con una mejor apariencia y fluidez. Luego, la composición probiótica combinada con la leche descremada simulada se sometió a secado por pulverización a temperaturas más altas de 80 ° C a 160 ° C (Figura 1).
Como era de esperar, el aumento de la temperatura SD tendió a disminuir la viabilidad de los probióticos, que alcanzaron casi el 80% a 160 °C. También se puede observar en la Figura 1 que el efecto de la temperatura de secado sobre el rendimiento del producto fue insignificante, con un valor promedio de 50,7% ± 2,4% p/p; Estos valores se observan comúnmente para los secadores por atomización a escala de laboratorio. Estos resultados indican que la leche descremada simulada es un buen sistema protector para el secado probiótico, ya que genera un producto de alta calidad con un buen rendimiento del sistema (rendimiento del producto).
El contenido de humedad de los polvos y la actividad del agua disminuyeron a la inversa con la temperatura de secado por pulverización, como se esperaba (Figura 2).
Figura 1: Rendimiento en polvo (%) y viabilidad probiótica (%) según la temperatura SD (°C), con leche descremada simulada como auxiliar de secado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Contenido de humedad y actividad hídrica de las muestras probiópicas secas según la temperatura SD (°C), con leche descremada simulada como sistema protector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
L. paraplantarum FT-259 es una bacteria Gram-positiva, en forma de bastoncillos, es un productor de bacteriocinas con actividad antilisterial y tiene un alto potencial probiótico20. Son et al.24 demostraron previamente la capacidad inmunoestimulante y antioxidante de las cepas de L. paraplantarum. Además, tienen un gran potencial probiótico, con propiedades como la estabilidad en condiciones gástricas y biliares artificiales, la susceptibilidad a los antibióticos y la unión a las células intestinales. Además, no producen metabolitos que puedan afectar negativamente el tracto gastrointestinal. Además, Choi y Chang25, estudiaron el EM de L. plantarum e informaron su potencial para la reducción del colesterol basado en su actividad hidrolasa de sales biliares y su capacidad de unión a la superficie celular. Además de exhibir tolerancia al estrés ácido y biliar, L. plantarum EM también mostró actividad antimicrobiana contra patógenos y resistencia a antibióticos, validando su potencial como probiótico.
Sin embargo, la producción de probióticos secos para la comercialización es un desafío ya que los microorganismos están expuestos a diversos factores de estrés, como el estrés térmico, mecánico, osmótico y oxidativo. Las altas temperaturas involucradas en el proceso pueden promover la desnaturalización de las enzimas y proteínas involucradas en el metabolismo de la célula, causando pérdidas de viabilidad microbiana. La eliminación de agua durante el secado también es un factor crítico, ya que es necesario un contenido mínimo de agua para mantener la actividad metabólica esencial26. Las altas fuerzas de cizallamiento causadas por el paso de la mezcla probiótica a través del atomizador durante la SD también pueden dañar la estructura de la célula probiótica, contribuyendo a las pérdidas de viabilidad27,28. Por lo tanto, la selección correcta de las condiciones de funcionamiento de SD (por ejemplo, las temperaturas de secado de entrada y salida, el caudal de gas de secado, el caudal de alimentación de la composición probiótica, la presión de atomización y el caudal de gas) es esencial para minimizar las pérdidas de viabilidad de la celda durante el secado por pulverización, mejorar la calidad del producto y, por lo tanto, obtener un rendimiento aceptable del secador.
La composición de los componentes cargados con los probióticos también es un factor relevante ya que las formulaciones mal diseñadas no protegen los probióticos durante el secado y el almacenamiento, causando pérdidas significativas de viabilidad. Las propiedades de composición se mejoran mediante la adición de los llamados auxiliares de secado (o agentes protectores), que pueden proporcionar cierta protección a las células del microorganismo durante el SD y el almacenamiento26,29. Los carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, oligosacáridos, etc.), proteínas y leche descremada reconstituida generalmente se agregan a la composición probiótica para proteger las células del microorganismo durante la DE. Aunque no está claro, el efecto protector de la leche descremada se asocia con su composición compleja, ya que contiene lactosa, grasa, caseína, proteína de suero y Ca2 + cationes; algunos autores han argumentado que las proteínas de suero y Ca2+ tienen un efecto más prominente que la lactosa30,31. Según Fu et al.17, el uso de leche descremada con suero añadido confiere una alta protección térmica a los probióticos debido a las interacciones hidrofóbicas entre las proteínas lácteas y las células bacterianas 17.
Los efectos protectores de los coadyuvantes de secado sobre la viabilidad de los probióticos se explican por tres hipótesis utilizadas para justificar el mantenimiento de la conformación proteica y las actividades enzimáticas durante la DE, a saber, la teoría de la vitrificación, la hipótesis del reemplazo de agua y la hipótesis de las fuerzas de hidratación, que han sido ampliamente discutidas por Broeckx et al.30.
Estresar los probióticos durante el cultivo es otro método que se puede utilizar para mejorar la resistencia celular probiótica durante la SD.
En el presente protocolo, se evaluaron los efectos de los sistemas protectores (una mezcla de inulina: maltodextrina y leche descremada simulada) y la temperatura de secado por pulverización sobre la viabilidad y las propiedades del probiótico seco, así como el rendimiento de SD.
La elección de la leche desnatada simulada se basó en el trabajo de Písecký22. El fructooligosacárido inulina y la lactosa se agregaron como carbohidratos (en lugar de solo lactosa), y el dióxido de silicio se agregó como ceniza. La elección de la inulina se basó en la literatura, donde ha sido descrita como un agente prebiótico que puede mejorar los beneficios de los probióticos en el intestino32,33. La comparación de los efectos protectores de estos auxiliares de secado sobre la viabilidad de los probióticos después de la SD se realizó a 80 °C. Los resultados mostraron que la leche descremada simulada promovió una mayor viabilidad probiótica que la combinación inulina:maltodextrina a 80 °C. Por lo tanto, se realizó un estudio de los efectos de la temperatura de secado (80 °C a 160 °C) sobre la viabilidad probiótica y el rendimiento en polvo con la leche desnatada simulada. Como se muestra en la Figura 1, el aumento en la temperatura de entrada, que condujo a una temperatura de salida más alta, redujo la supervivencia de las bacterias, como se esperaba17. Sin embargo, el rendimiento del polvo no cambió a ninguna temperatura, permaneciendo alrededor del 50%.
El nivel de deshidratación de los probióticos también está relacionado con sus pérdidas de viabilidad durante el secado y el almacenamiento del producto. Las reacciones de deterioro físico y químico de un producto seco dependen del nivel de agua libre34, pero la deshidratación excesiva puede reducir significativamente la viabilidad del probiótico seco. Como era de esperar, el aumento de la temperatura de secado promovió una reducción en el contenido de humedad del producto y la actividad del agua, que alcanzaron valores de 3.01% ± 0.30% (p/p) y 0.201 ± 0.006 a 160 °C, respectivamente. Los valores de Aw por debajo del contenido de humedad monocapa (~0,40) generalmente se asocian con una vida útil más larga debido a la reducción del agua libre disponible para las reacciones bioquímicas y el crecimiento microbiano34. Sin embargo, a actividades de agua muy bajas (<0.20), las reacciones de peroxidación lipídica aumentan significativamente, lo que puede ser perjudicial para la viabilidad del producto durante el almacenamiento. En cuanto al contenido de humedad, es preferible que los valores permanezcan en el rango de 2,8% a 5,6% para garantizar la preservación de los probióticos y reducir las reacciones bioquímicas deteriorativas a largo plazo35,36.
La figura 2 muestra que se requieren temperaturas de secado por atomización superiores a 120 °C para producir un producto con el Aw recomendado. A esta temperatura, el probiótico seco mostró una viabilidad de alrededor del 90%, un contenido de humedad de 4,6% p/p y un Aw de 0,26, que son excelentes resultados. Martins et al.37, en un estudio de optimización del secado por pulverización de células de Lactococcus lactis , recomendaron un valor de Aw de 0,198 y una temperatura de secado por atomización de entrada de 126 °C para minimizar las pérdidas de viabilidad de microorganismos, que están en estrecha concordancia con los valores de este protocolo.
Se podrían realizar otras metodologías de caracterización de polvos, como examinar las características morfológicas, pegajosidad36, fluidez y compresibilidad38.
En este contexto, se requieren temperaturas de secado por atomización superiores a 120 °C para garantizar la viabilidad y la vida útil de las células microbianas en una preparación en polvo y su supervivencia durante el procesamiento y almacenamiento de alimentos. En términos industriales, este es un excelente resultado, ya que la tecnología de secado por atomización es de bajo costo en comparación con la liofilización, lo que reduce el precio del producto. Además, la supervivencia por encima del 50% parece ser un rango robusto que garantiza la funcionalidad del polvo probiótico28, lo que significa que la supervivencia es un buen indicador para reproducir este protocolo a escala industrial. Sin embargo, la ampliación a condiciones industriales debe probarse para garantizar que el producto tenga las mismas características que el polvo obtenido en este protocolo.
Los métodos descritos en este protocolo tenían como objetivo aclarar la importancia de la selección correcta de la composición y el procesamiento de las variables durante el secado por pulverización de bacterias probióticas para garantizar la viabilidad y estabilidad del polvo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanzas 001. Este estudio también fue apoyado en parte por la FAPESP - Fundación de Investigación de São Paulo. E.C.P.D.M. agradece una beca de investigación del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) 306330/2019-9.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Lab 4TEV | Decagon Devices | - | Water activity meter |
| Centrifuge (mod. 5430 R ) | Eppendorf | - | Centrifuge |
| Colloidal SiO2 (Aerosil 200) | Evokik | 7631-86-9 | drying aid |
| Fructooligosaccharides from chicory | Sigma-Aldrich | 9005-80-5 | drying aid |
| GraphPad Prism (version 8.0) software | GraphPad Software | - | San Diego, California, USA |
| Karl Fischer 870 Titrino Plus | Metrohm | - | Moisture content |
| Lactose | Milkaut | 63-42-3 | drying aid |
| Maltodextrin | Ingredion | 9050-36-6 | drying aid |
| Milli-Q | Merk | - | Ultrapure water system |
| MRS Agar | Oxoid | - | Culture medium |
| MRS Broth | Oxoid | - | Culture medium |
| OriginPro (version 9.0) software | OriginLab | - | Northampton, Massachusetts, USA |
| Spray dryer SD-05 | Lab-Plant Ltd | - | Spray dryer |
| Whey protein | Arla Foods Ingredients S.A. | 91082-88-1 | drying aid |
References
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