Summary
Este protocolo detalha as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um produto probiótico seco por pulverização.
Abstract
Probióticos e prebióticos são de grande interesse para as indústrias alimentícia e farmacêutica devido aos seus benefícios para a saúde. Os probióticos são bactérias vivas que podem conferir efeitos benéficos ao bem-estar humano e animal, enquanto os prebióticos são tipos de nutrientes que alimentam as bactérias benéficas do intestino. Os probióticos em pó ganharam popularidade devido à facilidade e praticidade de sua ingestão e incorporação à dieta como suplemento alimentar. No entanto, o processo de secagem interfere na viabilidade celular, uma vez que altas temperaturas inativam bactérias probióticas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo apresentar todas as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um probiótico spray-dried e avaliar a influência dos protetores (leite desnatado simulado e associação inulina:maltodextrina) e das temperaturas de secagem no aumento do rendimento do pó e da viabilidade celular. Os resultados mostraram que o leite desnatado simulado promoveu maior viabilidade probiótica a 80 °C. Com esse protetor, a viabilidade do probiótico, o teor de umidade e a atividade de água (Aw) diminuem enquanto a temperatura de entrada aumenta. A viabilidade dos probióticos diminui inversamente com a temperatura de secagem. Em temperaturas próximas a 120 °C, o probiótico seco apresentou viabilidade em torno de 90%, teor de água de 4,6% p/p e Aw de 0,26; valores adequados para garantir a estabilidade do produto. Neste contexto, temperaturas de secagem por pulverização acima de 120 °C são necessárias para garantir a viabilidade e a vida útil das células microbianas na preparação em pó e a sobrevivência durante o processamento e armazenamento de alimentos.
Introduction
Para serem definidos como probióticos, os microrganismos adicionados aos alimentos (ou suplementos) devem ser consumidos vivos, ser capazes de sobreviver durante a passagem no trato gastrintestinal do hospedeiro e atingir o local de ação em quantidades adequadas para exercer efeitos benéficos 1,2,7.
O crescente interesse nos probióticos deve-se aos diversos benefícios à saúde humana que conferem, como a estimulação do sistema imunológico, a redução dos níveis séricos de colesterol e o aumento da função de barreira intestinal por atuar contra micróbios nocivos, bem como seus efeitos benéficos no tratamento da síndrome do intestino irritável, entre outros 2,3. Além disso, vários estudos têm demonstrado que os probióticos podem afetar positivamente outras partes do corpo humano, onde comunidades microbianas desequilibradas podem causar doenças infecciosas 3,4,5.
Para que os probióticos sejam terapeuticamente eficazes, o produto deve conter entre 10 6-107 UFC/g de bactérias no momento do consumo6. Por outro lado, o Ministério da Saúde italiano e o Canadá estabeleceram que o nível mínimo de probióticos nos alimentos deve ser de 10a 9 UFC/g de células viáveis por dia ou por porção, respectivamente7. Considerando que altas cargas de probióticos são necessárias para garantir que eles terão efeitos benéficos, é essencial garantir sua sobrevivência durante o processamento, armazenamento de prateleira e passagem pelo trato gastrointestinal (GI). Vários estudos têm demonstrado que a microencapsulação é um método eficaz para melhorar a viabilidade global dos probióticos 8,9,10,11.
Nesse contexto, vários métodos têm sido desenvolvidos para a microencapsulação de probióticos, como spray-drying, liofilização, spray-chilling, emulsão, extrusão, coacervação e, mais recentemente, leitos fluidizados11,12,13,14. A microencapsulação por spray-drying (SD) é amplamente utilizada na indústria alimentícia por ser um processo simples, rápido e reprodutível. É de fácil escalonamento, com alto rendimento de produção e baixa demanda energética11,12,13,14. No entanto, a exposição a altas temperaturas e baixo teor de umidade pode afetar a sobrevivência e a viabilidade das células probióticas15. Ambos os parâmetros podem ser melhorados para uma determinada linhagem, determinando-se os efeitos da idade e das condições de pré-adaptação da cultura e otimização das condições de spray-drying (temperaturas de entrada e saída, processo de atomização) e da composição encapsulante 8,14,16,17,18.
A composição da solução encapsulante também é um fator importante durante a SD, pois pode definir o nível de proteção contra condições ambientais adversas. Inulina, goma arábica, maltodextrinas e leite desnatado são amplamente utilizados como agentes encapsulantes para secagem de probióticos 5,17,18,19. A inulina é um frutooligossacarídeo que apresenta forte atividade prebiótica e promove a saúde intestinal19. O leite desnatado é muito eficaz na manutenção da viabilidade das células bacterianas secas e gera um pó com boas propriedades de reconstituição17.
Lactiplantibacillus paraplantarum O FT-259 é uma bactéria do ácido lático que produz bacteriocina e apresenta atividade antilisterial e características probióticas20,21. É uma bactéria Gram-positiva heterofermentativa facultativa em forma de bastonete que cresce de 15 °C a 37 °C20 e é compatível com a temperatura corporal homeostática. Este trabalho teve como objetivo apresentar todas as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um probiótico spray-dried (L. paraplantarum FT-259) e avaliar a influência dos protetores e das temperaturas de secagem.
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Protocol
1. Produção das células probióticas
- Prepare o caldo De Man Rogosa e Sharpe (MRS).
- Reativar 1% (v/v) da cultura de interesse no caldo MRS (aqui, Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 foi usado).
- Incubar por 24 h em temperatura adequada (utilizamos 37 °C).
2. Separe as bactérias da cultura
- Centrifugar a cultura bacteriana a 7.197 x g por 5 min a 4 °C usando tubos cônicos de 50 mL. É importante que o peso dos tubos seja equilibrado antes do procedimento.
- Usando uma pipeta, retire o sobrenadante e descarte-o em um recipiente adequado. Lave os pellets com um tampão fosfato (pH 7) e homogeneize a solução.
- Repita o processo de centrifugação como mencionado anteriormente.
- Para obter o pellet, use uma pipeta para remover e descartar o sobrenadante em um recipiente apropriado.
3. Adição de auxiliares de secagem
- Selecionar a combinação de duas composições de auxiliares de secagem (protetores): mistura de inulina:maltodextrina e leite desnatado simulado (Tabela 1)22,23.
- Pesar 5 g de inulina e 5 g de maltodextrina para obter a primeira combinação de protetores.
- Pesar 3 g de inulina, 3 g de lactose, 0,4 g de SiO2 coloidal e 3,6 g de whey protein para obter a segunda combinação de protetores.
- Adicionar cada um dos auxiliares de secagem à água ultrapura (1:10) e submeter à agitação magnética até a solubilização.
- Certifique-se de que os protetores e a água estejam homogêneos, adicione os pellets de probióticos à mistura e mexa moderadamente por 20 min.
| Auxiliares de secagem | Inulina e maltodextrina | Leite desnatado simulado |
| Maltodextrina | 5% | - |
| Proteína de soro de leite | - | 3.60% |
| Lactose | - | 3% |
| Inulina | 5% | 3% |
| SiO coloidal2 | - | 0.40% |
Tabela 1: Composição dos auxiliares de secagem.
4. Secagem por pulverização
- Ligue o spray dryer (SD) e defina a taxa de fluxo de gás de secagem, a temperatura de secagem de entrada e a taxa de fluxo e pressão do gás do atomizador da seguinte maneira:
Temperatura de entrada: 80 °C
Vazão de ar: 60 m³/h
Taxa de alimentação: 4 g/min
Fluxo de atomização: 17 L/min
Pressão de atomização: 1,5 kgf/cm²
Diâmetro do bocal do atomizador: 1 mm - Prepare a composição dos protetores e adicione os pellets probióticos concentrados.
- Inicie a alimentação da composição probiótica (células mais protetores) através de uma bomba peristáltica.
- Inicie o temporizador e coloque o recipiente coletor do produto quando a solução entrar no atomizador.
- Registre a temperatura de saída a cada 5 min para rastrear possíveis instabilidades de temperatura.
- Pare o temporizador quando toda a composição probiótica tiver sido alimentada para o SD.
- Pesar o recipiente coletor do produto para determinar a quantidade de composição fornecida ao sistema e a quantidade de produto seco coletado, para calcular o rendimento de secagem (produto recuperado) através de um balanço de massa no secador.
- Use leite desnatado simulado para avaliar o efeito da temperatura na viabilidade das células probióticas, estabelecendo cinco diferentes temperaturas de secagem por pulverização (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C e 160 °C vs. temperaturas de saída de 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C e 108 °C).
5. Caracterização do pó
- Teor de umidade do produto
- Pesar precisamente 100 mg do produto seco e colocá-lo no recipiente de titulação do equipamento Karl-Fischer.
- Pressione o botão de iniciação para iniciar a titulação biamperométrica da água presente na amostra.
- Atividade aquática
- Pesar 0,6 g do produto seco no compartimento de amostras do higrómetro a 25 °C.
- Feche a tampa do equipamento.
NOTA: O ensaio arrancará automaticamente e terminará quando a amostra atingir a pressão de vapor de equilíbrio dentro do compartimento da amostra.
6. Viabilidade do probiótico
- Diluir as suspensões bacterianas previamente preparadas em 9 mL de peptona água (0,1%, v/v).
- Vórtice até a dispersão completa.
- Realizar diluições decimais seriadas (1:10) em 9 mL de solução salina (NaCl a 0,9%).
- Semeando as diluições em placas de ágar MRS e incubar a 37 °C por 24-48 h.
- Conte as unidades formadoras de colônias (UFC/g) usando um contador de colônias com lente de aumento.
- Calcular a viabilidade do probiótico no produto seco de acordo com a seguinte equação:
EE (%) = (N∕No) × 100
onde, N é o número de células viáveis após a secagem por pulverização e N o é o número de células bacterianas antes da secagem por pulverização. - Expressar o número de células viáveis em UFC/g de dispersão do produto.
7. Análise dos dados
- Tabular os dados obtidos em software estatístico e realizar a análise por meio de um teste de comparações múltiplas (ANOVA).
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Representative Results
Neste estudo, L. paraplantarum foi encapsulada por SD utilizando agentes encapsulantes de grau alimentício (inulina:maltodextrina e leite em pó simulado), mostrando alta qualidade do produto e eficácia na preservação da viabilidade celular bacteriana17,19.
Os resultados da SD dos probióticos a 80 °C mostraram que os distintos sistemas protetores (inulina:maltodextrina e leite desnatado simulado) promoveram eficiente proteção das células probióticas, com viabilidade de 95,1% e 97,0%, respectivamente. O rendimento do produto foi próximo de 50% p/p para ambos os sistemas protetores e ligeiramente superior para o leite desnatado simulado, o que gerou um produto com melhor aparência e fluidez. Em seguida, a composição probiótica combinada com o leite desnatado simulado foi submetida à secagem por aspersão em temperaturas mais elevadas, de 80 °C a 160 °C (Figura 1).
Como esperado, o aumento da temperatura SD tendeu a diminuir a viabilidade do probiótico, que atingiu cerca de 80% a 160 °C. Observa-se também na Figura 1 que o efeito da temperatura de secagem sobre o rendimento do produto foi desprezível, com valor médio de 50,7% ± 2,4% p/p; Esses valores são comumente observados para secadores por pulverização em escala de laboratório. Estes resultados indicam que o leite desnatado simulado é um bom sistema protetor para a secagem de probióticos, pois gera um produto de alta qualidade com bom desempenho do sistema (rendimento do produto).
O teor de umidade e a atividade de água dos pós diminuíram inversamente com a temperatura de secagem por aspersão, como esperado (Figura 2).
Figura 1: Rendimento em pó (%) e viabilidade do probiótico (%) de acordo com a temperatura SD (°C), com leite desnatado simulado como auxiliar de secagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Teor de umidade e atividade de água das amostras de probiótico secas de acordo com a temperatura SD (°C), com o leite desnatado simulado como sistema protetor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
L. paraplantarum A FT-259 é uma bactéria Gram-positiva, em forma de bastonete, produtora de bacteriocinas com atividade antilisterial e com alto potencial probiótico20. Son et al.24 demonstraram previamente a capacidade imunoestimulante e antioxidante de cepas de L. paraplantarum. Além disso, possuem grande potencial probiótico, com propriedades como estabilidade em condições gástricas e biliares artificiais, suscetibilidade a antibióticos e ligação às células intestinais. Além disso, eles não produzem metabólitos que podem afetar negativamente o trato gastrointestinal. Além disso, Choi e Chang25, estudaram o L. plantarum EM e relataram seu potencial para redução do colesterol com base em sua atividade de hidrolase de sais biliares e capacidade de ligação à superfície celular. Além de apresentar tolerância a estresses ácidos e biliares, L. plantarum EM também apresentou atividade antimicrobiana contra patógenos e resistência a antibióticos, validando seu potencial como probiótico.
No entanto, a produção de probióticos secos para comercialização é um desafio, uma vez que os microrganismos estão expostos a vários fatores de estresse, como térmicos, mecânicos, osmóticos e oxidativos. As altas temperaturas envolvidas no processo podem promover a desnaturação das enzimas e proteínas envolvidas no metabolismo celular, causando perdas de viabilidade microbiana. A remoção de água durante a secagem também é um fator crítico, uma vez que um teor mínimo de água é necessário para sustentar a atividade metabólica essencial26. As altas forças de cisalhamento causadas pela passagem da mistura probiótica pelo atomizador durante a MS também podem danificar a estrutura da célula probiótica, contribuindo para perdas de viabilidade27,28. Assim, a seleção correta das condições operacionais SD (por exemplo, as temperaturas de secagem de entrada e saída, vazão de gás de secagem, vazão de alimentação da composição probiótica, pressão de atomização e vazão de gás) é essencial para minimizar as perdas de viabilidade celular durante a secagem por pulverização, melhorar a qualidade do produto e, assim, obter um desempenho aceitável do secador.
A composição dos constituintes carregados com os probióticos também é um fator relevante, uma vez que formulações mal elaboradas não protegem os probióticos durante a secagem e armazenamento, causando perdas significativas de viabilidade. As propriedades de composição são melhoradas pela adição dos chamados auxiliares de secagem (ou agentes protetores), que podem conferir certa proteção às células do microrganismo durante a MS e armazenamento26,29. Carboidratos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos, oligossacarídeos, etc.), proteínas e leite desnatado reconstituído são geralmente adicionados à composição probiótica para proteger as células do microrganismo durante a SD. Embora não esteja claro, o efeito protetor do leite desnatado está associado à sua composição complexa, pois contém lactose, gordura, caseína, proteína do soro do leite e cátions Ca2+; alguns autores argumentam que as proteínas do soro do leite e o Ca2+ têm um efeito mais proeminente do que a lactose30,31. Segundo Fu et al.17, o uso de leite desnatado com adição de soro confere alta proteção térmica aos probióticos devido às interações hidrofóbicas entre as proteínas lácteas e as célulasbacterianas17.
Os efeitos protetores dos auxiliares de secagem sobre a viabilidade probiótica são explicados por três hipóteses utilizadas para justificar a manutenção da conformação proteica e das atividades enzimáticas durante a MS, a saber, a teoria da vitrificação, a hipótese da reposição de água e a hipótese das forças de hidratação, que foram amplamente discutidas por Broeckx et al.30.
Enfatizar os probióticos durante o cultivo é outro método que pode ser usado para aumentar a resistência celular probiótica durante a SD.
No presente protocolo, foram avaliados os efeitos dos sistemas protetores (mistura de inulina:maltodextrina e leite desnatado simulado) e da temperatura de spray-drying sobre a viabilidade e propriedades do probiótico seco, bem como o desempenho SD.
A escolha do leite desnatado simulado foi baseada no trabalho de Písecký22. O frutooligossacarídeo inulina e lactose foram adicionados como carboidratos (em vez de apenas lactose), e dióxido de silício foi adicionado como cinza. A escolha da inulina foi baseada na literatura, onde tem sido descrita como um agente prebiótico que pode melhorar os benefícios dos probióticos no intestino32,33. A comparação dos efeitos protetores desses auxiliares de secagem sobre a viabilidade dos probióticos após SD foi realizada a 80 °C. Os resultados mostraram que o leite desnatado simulado promoveu maior viabilidade probiótica do que a combinação inulina:maltodextrina a 80 °C. Assim, foi realizado um estudo dos efeitos da temperatura de secagem (80 °C a 160 °C) sobre a viabilidade probiótica e o rendimento de pó com o leite desnatado simulado. Como mostrado na Figura 1, o aumento da temperatura de entrada, que levou a uma maior temperatura de saída, reduziu a sobrevivência da bactéria, como esperado17. No entanto, o rendimento do pó não se alterou em nenhuma temperatura, mantendo-se em torno de 50%.
O nível de desidratação dos probióticos também está ligado às suas perdas de viabilidade durante a secagem e armazenamento do produto. As reações físicas e químicas deteriorativas de um produto seco dependem do nível de água livre34, mas a desidratação excessiva pode reduzir significativamente a viabilidade do probiótico seco. Como esperado, o aumento da temperatura de secagem promoveu redução no teor de umidade do produto e na atividade de água, que atingiram valores de 3,01% ± 0,30% (p/p) e 0,201 ± 0,006 a 160 °C, respectivamente. Valores de Aw abaixo do teor de umidade da monocamada (~0,40) são geralmente associados a uma maior vida de prateleira devido à redução da água livre disponível para reações bioquímicas e crescimento microbiano34. No entanto, em atividades hídricas muito baixas (<0,20), as reações de peroxidação lipídica aumentam significativamente, o que pode ser prejudicial à viabilidade do produto durante o armazenamento. Em relação ao teor de umidade, é preferível que os valores permaneçam na faixa de 2,8% a 5,6% para garantir a preservação dos probióticos e reduzir as reações bioquímicas deteriorantes em longo prazo35,36.
A Figura 2 mostra que temperaturas de secagem por pulverização acima de 120 °C são necessárias para produzir um produto com o Aw recomendado. Nessa temperatura, o probiótico seco apresentou viabilidade em torno de 90%, teor de umidade de 4,6% p/p e Aw de 0,26, excelentes resultados. Martins et al.37, em estudo de otimização da spray-drying de células de Lactococcus lactis , recomendaram um valor de Aw de 0,198 e uma temperatura de secagem por atomização de 126 °C para minimizar as perdas de viabilidade de microrganismos, que estão em estreita concordância com os valores deste protocolo.
Outras metodologias de caracterização de pós podem ser realizadas, como examinar as características morfológicas, aderência36, fluidez e compressibilidade38.
Neste contexto, temperaturas de secagem por pulverização acima de 120 °C são necessárias para garantir a viabilidade e a vida de prateleira das células microbianas em uma preparação em pó e sua sobrevivência durante o processamento e armazenamento de alimentos. Em termos industriais, este é um excelente resultado, pois a tecnologia de spray-drying é de baixo custo em comparação com a liofilização, reduzindo assim o preço do produto. Além disso, a sobrevida acima de 50% parece ser uma faixa robusta que garante a funcionalidade do pó probiótico28, significando que a sobrevivência é um bom indicador para a reprodução desse protocolo em escala industrial. No entanto, o escalonamento até as condições industriais precisa ser testado para garantir que o produto tenha as mesmas características do pó obtido neste protocolo.
Os métodos descritos neste protocolo visaram esclarecer a importância da correta seleção da composição e processamento das variáveis durante a spray-drying de bactérias probióticas para garantir a viabilidade e estabilidade do pó.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
O presente estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código 001. Este estudo também foi parcialmente financiado pela FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo. A E.C.P.D.M. agradece a Bolsa de Pesquisador do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 306330/2019-9.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Lab 4TEV | Decagon Devices | - | Water activity meter |
| Centrifuge (mod. 5430 R ) | Eppendorf | - | Centrifuge |
| Colloidal SiO2 (Aerosil 200) | Evokik | 7631-86-9 | drying aid |
| Fructooligosaccharides from chicory | Sigma-Aldrich | 9005-80-5 | drying aid |
| GraphPad Prism (version 8.0) software | GraphPad Software | - | San Diego, California, USA |
| Karl Fischer 870 Titrino Plus | Metrohm | - | Moisture content |
| Lactose | Milkaut | 63-42-3 | drying aid |
| Maltodextrin | Ingredion | 9050-36-6 | drying aid |
| Milli-Q | Merk | - | Ultrapure water system |
| MRS Agar | Oxoid | - | Culture medium |
| MRS Broth | Oxoid | - | Culture medium |
| OriginPro (version 9.0) software | OriginLab | - | Northampton, Massachusetts, USA |
| Spray dryer SD-05 | Lab-Plant Ltd | - | Spray dryer |
| Whey protein | Arla Foods Ingredients S.A. | 91082-88-1 | drying aid |
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