Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi coinvolte nella produzione e nella caratterizzazione fisico-chimica di un prodotto probiotico essiccato a spruzzo.
Abstract
I probiotici e i prebiotici sono di grande interesse per le industrie alimentari e farmaceutiche a causa dei loro benefici per la salute. I probiotici sono batteri vivi che possono conferire effetti benefici sul benessere umano e animale, mentre i prebiotici sono tipi di nutrienti che alimentano i batteri intestinali benefici. I probiotici in polvere hanno guadagnato popolarità grazie alla facilità e alla praticità della loro ingestione e incorporazione nella dieta come integratore alimentare. Tuttavia, il processo di essiccazione interferisce con la vitalità cellulare poiché le alte temperature inattivano i batteri probiotici. In questo contesto, questo studio mirava a presentare tutte le fasi coinvolte nella produzione e caratterizzazione fisico-chimica di un probiotico spray-dried e valutare l'influenza dei protettori (associazione simulata latte scremato e inulina:maltodestrina) e le temperature di essiccazione nell'aumentare la resa in polvere e la vitalità cellulare. I risultati hanno mostrato che il latte scremato simulato ha promosso una maggiore vitalità probiotica a 80 ° C. Con questo protettivo, la vitalità probiotica, il contenuto di umidità e l'attività dell'acqua (Aw) si riducono finché aumenta la temperatura di ingresso. La vitalità dei probiotici diminuisce inversamente con la temperatura di essiccazione. A temperature vicine a 120 ° C, il probiotico essiccato ha mostrato una vitalità intorno al 90%, un contenuto di umidità del 4,6% p / p e un Aw di 0,26; valori adeguati a garantire la stabilità del prodotto. In questo contesto, sono necessarie temperature di essiccazione a spruzzo superiori a 120 °C per garantire la vitalità e la durata di conservazione delle cellule microbiche nella preparazione in polvere e la sopravvivenza durante la lavorazione e la conservazione degli alimenti.
Introduction
Per essere definiti probiotici, i microrganismi aggiunti agli alimenti (o integratori) devono essere consumati vivi, essere in grado di sopravvivere durante il passaggio nel tratto gastrointestinale dell'ospite e raggiungere il sito di azione in quantità adeguate per esercitare effetti benefici 1,2,7.
Il crescente interesse per i probiotici è dovuto ai numerosi benefici per la salute umana che conferiscono, come la stimolazione del sistema immunitario, la riduzione dei livelli sierici di colesterolo e il potenziamento della funzione di barriera intestinale agendo contro i microbi dannosi, nonché i loro effetti benefici nel trattamento della sindrome dell'intestino irritabile, tra gli altri 2,3. Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che i probiotici possono influenzare positivamente altre parti del corpo umano in cui comunità microbiche squilibrate possono causare malattie infettive 3,4,5.
Affinché i probiotici siano terapeuticamente efficaci, il prodotto deve contenere tra 10 6-107 CFU / g di batteri al momento del consumo6. D'altra parte, il Ministero della Salute italiano e della Salute del Canada ha stabilito che il livello minimo di probiotici negli alimenti dovrebbe essere di 109 CFU/g di cellule vitali al giorno o per porzione, rispettivamente7. Considerando che sono necessari carichi elevati di probiotici per garantire che avranno effetti benefici, è essenziale garantire la loro sopravvivenza durante la lavorazione, la conservazione a scaffale e il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale (GI). Diversi studi hanno dimostrato che la microincapsulazione è un metodo efficace per migliorare la vitalità complessiva dei probiotici 8,9,10,11.
In questo contesto, sono stati sviluppati diversi metodi per la microincapsulazione dei probiotici, come spray-drying, liofilizzazione, spray-chilling, emulsione, estrusione, coacervazione e, più recentemente, letti fluidizzati11,12,13,14. La microincapsulazione mediante essiccazione a spruzzo (SD) è ampiamente utilizzata nell'industria alimentare perché è un processo semplice, veloce e riproducibile. È facile da scalare e ha un alto rendimento produttivo a basso fabbisogno energetico11,12,13,14. Tuttavia, l'esposizione alle alte temperature e al basso contenuto di umidità può influenzare la sopravvivenza e la vitalità delle cellule probiotiche15. Entrambi i parametri possono essere migliorati per un dato ceppo determinando gli effetti dell'età e delle condizioni di coltura per pre-adattare la coltura e ottimizzare le condizioni di essiccazione a spruzzo (temperature di ingresso e uscita, processo di atomizzazione) e la composizione incapsulante 8,14,16,17,18.
Anche la composizione della soluzione incapsulante è un fattore importante durante la SD in quanto può definire il livello di protezione contro condizioni ambientali avverse. Inulina, gomma arabica, maltodestrine e latte scremato sono ampiamente usati come agenti incapsulanti per l'essiccazione probiotica 5,17,18,19. L'inulina è un fruttooligosaccaride che presenta una forte attività prebiotica e promuove la salute intestinale19. Il latte scremato è molto efficace nel mantenere la vitalità delle cellule batteriche essiccate e genera una polvere con buone proprietà di ricostituzione17.
Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 è un batterio dell'acido lattico che produce batteriocin e presenta attività antilisteriale, oltre ai tratti probiotici20,21. È un batterio Gram-positivo eterofermentativo facoltativo a forma di bastoncino che cresce da 15 °C a 37 °C20 ed è compatibile con la temperatura corporea omeostatica. Questo studio mirava a presentare tutte le fasi coinvolte nella produzione e caratterizzazione fisico-chimica di un probiotico spray-dried (L. paraplantarum FT-259) e valutare l'influenza dei protettori e le temperature di essiccazione.
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Protocol
1. Produzione delle cellule probiotiche
- Preparare il brodo De Man Rogosa e Sharpe (MRS).
- Riattivare l'1% (v/v) della coltura di interesse nel brodo MRS (qui è stato utilizzato Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259).
- Incubare per 24 ore ad una temperatura adeguata (abbiamo usato 37 °C).
2. Separare i batteri dalla coltura
- Centrifugare la coltura batterica a 7.197 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando provette coniche da 50 ml. È importante che il peso dei tubi sia bilanciato prima della procedura.
- Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante e gettarlo in un contenitore adatto. Lavare i pellet con un tampone fosfato (pH 7) e omogeneizzare la soluzione.
- Ripetere il processo di centrifugazione come menzionato prima.
- Per ottenere il pellet, utilizzare una pipetta per rimuovere e gettare il surnatante in un contenitore appropriato.
3. Aggiunta di coadiuvanti per l'essiccazione
- Selezionare la combinazione di due coadiuvanti essiccanti (protettivi): miscela inulina:maltodestrina e latte scremato simulato (tabella 1)22,23.
- Pesare 5 g di inulina e 5 g di maltodestrina per ottenere la prima combinazione di protettivi.
- Pesare 3 g di inulina, 3 g di lattosio, 0,4 g diSiO 2 colloidale e 3,6 g di proteine del siero di latte per ottenere la seconda combinazione di protettivi.
- Aggiungere ciascuno dei coadiuvanti di essiccazione all'acqua ultrapura (1:10) e sottoporli all'agitazione magnetica fino alla solubilizzazione.
- Assicurarsi che i protettori e l'acqua siano omogenei, quindi aggiungere i pellet probiotici alla miscela e mescolare moderatamente per 20 minuti.
| Coadiuvanti per l'asciugatura | Inulina e maltodestrina | Latte scremato simulato |
| Maltodestrina | 5% | - |
| Proteine del siero di latte | - | 3.60% |
| Lattosio | - | 3% |
| Inulina | 5% | 3% |
| SiO colloidale2 | - | 0.40% |
Tabella 1: Composizione dei coadiuvanti per l'essiccazione.
4. Essiccazione a spruzzo
- Accendere lo spray dryer (SD) e impostare la portata del gas di essiccazione, la temperatura di essiccazione in ingresso e la portata e la pressione del gas dell'atomizzatore come segue:
Temperatura di ingresso: 80 °C
Portata d'aria: 60 m³/h
Velocità di avanzamento: 4 g/min
Flusso di atomizzazione: 17 L/min
Pressione di atomizzazione: 1,5 kgf/cm²
Diametro dell'ugello atomizzatore: 1 mm - Preparare la composizione dei protettori e aggiungere i pellet probiotici concentrati.
- Avviare l'alimentazione della composizione probiotica (cellule più protettivi) attraverso una pompa peristaltica.
- Avviare il timer e posizionare il recipiente di raccolta del prodotto quando la soluzione entra nell'atomizzatore.
- Registrare la temperatura di uscita ogni 5 minuti per tenere traccia di possibili instabilità della temperatura.
- Arrestare il timer quando tutta la composizione probiotica è stata alimentata alla SD.
- Pesare il recipiente di raccolta del prodotto per determinare la quantità di composizione alimentata al sistema e la quantità di prodotto secco raccolto, per calcolare la resa di essiccazione (prodotto recuperato) attraverso un bilancio di massa nell'essiccatore.
- Utilizzare latte scremato simulato per valutare l'effetto della temperatura sulla vitalità delle cellule probiotiche, impostando cinque diverse temperature di essiccazione a spruzzo (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C e 160 °C rispetto alle temperature di uscita di 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C e 108 °C).
5. Caratterizzazione delle polveri
- Contenuto di umidità del prodotto
- Pesare con precisione 100 mg del prodotto essiccato e posizionarlo nel recipiente di titolazione dell'apparecchiatura Karl-Fischer.
- Premere il pulsante di iniziazione per avviare la titolazione bi-amperometrica dell'acqua presente nel campione.
- Attività acquatiche
- Pesare 0,6 g di prodotto essiccato nel vano campione dell'igrometro a 25 °C.
- Chiudere il coperchio dell'apparecchiatura.
NOTA: Il test si avvia automaticamente e si interrompe quando il campione raggiunge la pressione di vapore di equilibrio all'interno del compartimento del campione.
6. Vitalità probiotica
- Diluire le sospensioni batteriche precedentemente preparate in 9 ml di acqua peptone (0,1%, v/v).
- Vortice fino alla completa dispersione.
- Eseguire diluizioni decimali seriali (1:10) in 9 mL di soluzione salina (0,9% NaCl).
- Semiare le diluizioni su piastre di agar MRS e incubare a 37 °C per 24-48 ore.
- Contare le unità formanti colonie (CFU/g) utilizzando un contacolonie con lente d'ingrandimento.
- Calcolare la vitalità probiotica nel prodotto essiccato secondo la seguente equazione:
EE (%) = (N∕N o) × 100
dove, N è il numero di cellule vitali dopo l'essiccazione a spruzzo e No è il numero di cellule batteriche prima dell'essiccazione a spruzzo. - Esprimere il numero di cellule vitali in CFU/g di dispersione del prodotto.
7. Analisi dei dati
- Tabulare i dati ottenuti in un software statistico ed eseguire l'analisi utilizzando un test di confronto multiplo (ANOVA).
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Representative Results
In questo studio, L. paraplantarum è stato incapsulato da SD utilizzando agenti incapsulanti per uso alimentare (inulina: maltodestrina e latte in polvere simulato), dimostrando un'elevata qualità del prodotto ed efficacia nel preservare la vitalità cellulare batterica17,19.
I risultati della SD dei probiotici a 80 °C hanno mostrato che i distinti sistemi protettivi (inulina: maltodestrina e latte scremato simulato) hanno promosso una protezione efficiente delle cellule probiotiche, con vitalità rispettivamente del 95,1% e del 97,0%. La resa del prodotto è stata vicina al 50% p/p per entrambi i sistemi di protezione ed è stata leggermente superiore per il latte scremato simulato, che ha generato un prodotto con un aspetto e una fluidità migliori. Quindi, la composizione probiotica combinata con il latte scremato simulato è stata sottoposta ad essiccazione a spruzzo a temperature più elevate da 80 ° C a 160 ° C (Figura 1).
Come previsto, l'aumento della temperatura SD tendeva a diminuire la vitalità probiotica, che raggiungeva quasi l'80% a 160 °C. Si può anche vedere nella figura 1 che l'effetto della temperatura di essiccazione sulla resa del prodotto è stato trascurabile, con un valore medio del 50,7% ± 2,4% p/p; Questi valori sono comunemente osservati per gli spray dryer su scala di laboratorio. Questi risultati indicano che il latte scremato simulato è un buon sistema protettivo per l'essiccazione probiotica, in quanto genera un prodotto di alta qualità con buone prestazioni del sistema (resa del prodotto).
Il contenuto di umidità delle polveri e l'attività dell'acqua sono diminuiti inversamente con la temperatura di essiccazione a spruzzo, come previsto (Figura 2).
Figura 1: Resa in polvere (%) e vitalità probiotica (%) in base alla temperatura SD (°C), con latte scremato simulato come coadiuvante di essiccazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Contenuto di umidità e attività dell'acqua dei campioni probiotici essiccati in base alla temperatura SD (°C), con latte scremato simulato come sistema protettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L. paraplantarum FT-259 è un batterio Gram-positivo, a forma di bastoncello, è un produttore di batteriocine con attività antilisteriale e ha un alto potenziale probiotico20. Son et al.24 hanno precedentemente dimostrato la capacità immunostimolante e antiossidante dei ceppi di L. paraplantarum. Inoltre, hanno un grande potenziale probiotico, con proprietà come la stabilità in condizioni gastriche e biliari artificiali, la suscettibilità agli antibiotici e il legame alle cellule intestinali. Inoltre, non producono metaboliti che possono influire negativamente sul tratto gastrointestinale. Inoltre, Choi e Chang25, hanno studiato il L. plantarum EM e hanno riportato il suo potenziale per la riduzione del colesterolo in base alla sua attività di idrolasi di sali biliari e alla capacità di legare la superficie cellulare. Oltre a mostrare tolleranza agli stress acidi e biliari, L. plantarum EM ha anche mostrato attività antimicrobica contro gli agenti patogeni e la resistenza agli antibiotici, convalidando il suo potenziale come probiotico.
Tuttavia, la produzione di probiotici secchi per la commercializzazione è impegnativa poiché i microrganismi sono esposti a vari fattori di stress, come stress termici, meccanici, osmotici e ossidativi. Le alte temperature coinvolte nel processo possono favorire la denaturazione degli enzimi e delle proteine coinvolte nel metabolismo cellulare, causando perdite di vitalità microbica. Anche la rimozione dell'acqua durante l'essiccazione è un fattore critico poiché è necessario un contenuto minimo di acqua per sostenere l'attività metabolica essenziale26. Le elevate forze di taglio causate dal passaggio della miscela probiotica attraverso l'atomizzatore durante la SD possono anche danneggiare la struttura della cellula probiotica, contribuendo alle perdite di vitalità27,28. Pertanto, la corretta selezione delle condizioni operative SD (ad esempio, le temperature di essiccazione in ingresso e in uscita, la portata del gas di essiccazione, la portata di alimentazione della composizione probiotica, la pressione di atomizzazione e la portata del gas) è essenziale per ridurre al minimo le perdite di vitalità delle celle durante l'essiccazione a spruzzo, migliorare la qualità del prodotto e, quindi, ottenere prestazioni accettabili dell'essiccatore.
Anche la composizione dei costituenti caricati con i probiotici è un fattore rilevante poiché formulazioni mal progettate non proteggono i probiotici durante l'essiccazione e la conservazione, causando significative perdite di vitalità. Le proprietà di composizione sono migliorate dall'aggiunta dei cosiddetti coadiuvanti essiccanti (o agenti protettivi), che possono fornire una certa protezione alle cellule dei microrganismi durante la SD e la conservazione26,29. I carboidrati (ad esempio, monosaccaridi, disaccaridi, polisaccaridi, oligosaccaridi, ecc.), Le proteine e il latte scremato ricostituito vengono solitamente aggiunti alla composizione probiotica per proteggere le cellule dei microrganismi durante la SD. Sebbene poco chiaro, l'effetto protettivo del latte scremato è associato alla sua complessa composizione, in quanto contiene lattosio, grassi, caseina, proteine del siero di latte e cationi Ca2+; alcuni autori hanno sostenuto che le proteine del siero di latte e Ca2+ hanno un effetto più prominente rispetto al lattosio30,31. Secondo Fu et al.17, l'uso di latte scremato con aggiunta di siero conferisce un'elevata protezione termica ai probiotici a causa delle interazioni idrofobiche tra le proteine del latte e le cellule batteriche 17.
Gli effetti protettivi degli ausili essiccanti sulla vitalità probiotica sono spiegati da tre ipotesi utilizzate per giustificare il mantenimento della conformazione proteica e delle attività enzimatiche durante la SD, vale a dire la teoria della vetrificazione, l'ipotesi della sostituzione dell'acqua e l'ipotesi delle forze di idratazione, che sono state ampiamente discusse da Broeckx et al.30.
Stressare i probiotici durante la coltivazione è un altro metodo che può essere utilizzato per migliorare la resistenza delle cellule probiotiche durante la SD.
Nel presente protocollo, sono stati valutati gli effetti dei sistemi protettivi (una miscela di inulina:maltodestrina e latte scremato simulato) e la temperatura di essiccazione a spruzzo sulla vitalità e le proprietà del probiotico essiccato, nonché le prestazioni SD.
La scelta del latte scremato simulato si è basata sul lavoro di Písecký22. Il fruttooligosaccaride inulina e il lattosio sono stati aggiunti come carboidrati (invece del solo lattosio) e il biossido di silicio è stato aggiunto come cenere. La scelta dell'inulina si è basata sulla letteratura, dove è stato descritto come un agente prebiotico in grado di migliorare i benefici dei probiotici nell'intestino32,33. Il confronto degli effetti protettivi di questi coadiuvanti essiccanti sulla vitalità dei probiotici dopo SD è stato condotto a 80 °C. I risultati hanno mostrato che il latte scremato simulato ha promosso una maggiore vitalità probiotica rispetto alla combinazione inulina:maltodestrina a 80 °C. Pertanto, uno studio sugli effetti della temperatura di essiccazione (da 80 °C a 160 °C) sulla vitalità probiotica e sulla resa in polvere è stato condotto con il latte scremato simulato. Come mostrato nella Figura 1, l'aumento della temperatura di ingresso, che ha portato a una temperatura di uscita più elevata, ha ridotto la sopravvivenza dei batteri, come previsto17. Tuttavia, la resa in polvere non è cambiata a nessuna temperatura, rimanendo intorno al 50%.
Il livello di disidratazione dei probiotici è anche legato alle loro perdite di vitalità durante l'essiccazione e la conservazione del prodotto. Le reazioni di deterioramento fisico e chimico di un prodotto essiccato dipendono dal livello di acqua libera34, ma un'eccessiva disidratazione può ridurre significativamente la vitalità del probiotico essiccato. Come previsto, l'aumento della temperatura di essiccazione ha favorito una riduzione del contenuto di umidità del prodotto e dell'attività dell'acqua, che hanno raggiunto valori rispettivamente del 3,01% ± 0,30% (p/p) e dello 0,201 ± 0,006 a 160 °C. I valori di Aw al di sotto del contenuto di umidità monostrato (~ 0,40) sono solitamente associati a una maggiore durata di conservazione a causa della riduzione dell'acqua libera disponibile per le reazioni biochimiche e la crescita microbica34. Tuttavia, a attività idriche molto basse (<0,20), le reazioni di perossidazione lipidica aumentano in modo significativo, il che può essere dannoso per la vitalità del prodotto durante lo stoccaggio. In termini di contenuto di umidità, è preferibile che i valori rimangano nell'intervallo dal 2,8% al 5,6% per garantire la conservazione dei probiotici e ridurre le reazioni biochimiche deteriorative a lungo termine35,36.
La figura 2 mostra che sono necessarie temperature di essiccazione a spruzzo superiori a 120 °C per produrre un prodotto con l'Aw raccomandato. A questa temperatura, il probiotico essiccato ha mostrato una vitalità di circa il 90%, un contenuto di umidità del 4,6% p/p e un Aw di 0,26, che sono risultati eccellenti. Martins et al.37, in uno studio di ottimizzazione dell'essiccazione a spruzzo delle cellule di Lactococcus lattis , hanno raccomandato un valore Aw di 0,198 e una temperatura di essiccazione a spruzzo in ingresso di 126 °C per ridurre al minimo le perdite di vitalità dei microrganismi, che sono in stretto accordo con i valori di questo protocollo.
Altre metodologie di caratterizzazione delle polveri potrebbero essere eseguite, come ad esempio esaminare le caratteristiche morfologiche, la viscosità36, la fluidità e la comprimibilità38.
In questo contesto, sono necessarie temperature di essiccazione a spruzzo superiori a 120 °C per garantire la vitalità e la durata di conservazione delle cellule microbiche in una preparazione in polvere e la loro sopravvivenza durante la lavorazione e la conservazione degli alimenti. In termini industriali, questo è un risultato eccellente, in quanto la tecnologia di spray drying è a basso costo rispetto alla liofilizzazione, riducendo così il prezzo del prodotto. Inoltre, la sopravvivenza superiore al 50% sembra essere un intervallo robusto che garantisce la funzionalità della polvere probiotica28, il che significa che la sopravvivenza è un buon indicatore per riprodurre questo protocollo su scala industriale. Tuttavia, il ridimensionamento fino alle condizioni industriali deve essere testato per garantire che il prodotto abbia le stesse caratteristiche della polvere ottenuta in questo protocollo.
I metodi descritti in questo protocollo miravano a chiarire l'importanza della corretta selezione della composizione e dell'elaborazione delle variabili durante l'essiccazione a spruzzo dei batteri probiotici per garantire la vitalità e la stabilità della polvere.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è stato in parte finanziato dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Codice finanziario 001. Questo studio è stato anche sostenuto in parte da FAPESP - São Paulo Research Foundation. E.C.P.D.M. è grato per una borsa di ricerca dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) 306330/2019-9.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Lab 4TEV | Decagon Devices | - | Water activity meter |
| Centrifuge (mod. 5430 R ) | Eppendorf | - | Centrifuge |
| Colloidal SiO2 (Aerosil 200) | Evokik | 7631-86-9 | drying aid |
| Fructooligosaccharides from chicory | Sigma-Aldrich | 9005-80-5 | drying aid |
| GraphPad Prism (version 8.0) software | GraphPad Software | - | San Diego, California, USA |
| Karl Fischer 870 Titrino Plus | Metrohm | - | Moisture content |
| Lactose | Milkaut | 63-42-3 | drying aid |
| Maltodextrin | Ingredion | 9050-36-6 | drying aid |
| Milli-Q | Merk | - | Ultrapure water system |
| MRS Agar | Oxoid | - | Culture medium |
| MRS Broth | Oxoid | - | Culture medium |
| OriginPro (version 9.0) software | OriginLab | - | Northampton, Massachusetts, USA |
| Spray dryer SD-05 | Lab-Plant Ltd | - | Spray dryer |
| Whey protein | Arla Foods Ingredients S.A. | 91082-88-1 | drying aid |
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