Summary
Ce protocole détaille les étapes de la production et de la caractérisation physico-chimique d’un produit probiotique séché par atomisation.
Abstract
Les probiotiques et les prébiotiques sont d’un grand intérêt pour les industries alimentaire et pharmaceutique en raison de leurs bienfaits pour la santé. Les probiotiques sont des bactéries vivantes qui peuvent conférer des effets bénéfiques sur le bien-être humain et animal, tandis que les prébiotiques sont des types de nutriments qui nourrissent les bactéries intestinales bénéfiques. Les probiotiques en poudre ont gagné en popularité en raison de la facilité et de la praticité de leur ingestion et de leur incorporation dans l’alimentation en tant que complément alimentaire. Cependant, le processus de séchage interfère avec la viabilité cellulaire puisque les températures élevées inactivent les bactéries probiotiques. Dans ce contexte, cette étude visait à présenter toutes les étapes de la production et de la caractérisation physico-chimique d’un probiotique séché par atomisation et à évaluer l’influence des protecteurs (association lait écrémé simulé et inuline:maltodextrine) et des températures de séchage dans l’augmentation du rendement en poudre et de la viabilité cellulaire. Les résultats ont montré que le lait écrémé simulé favorisait une viabilité probiotique plus élevée à 80 ° C. Avec ce protecteur, la viabilité des probiotiques, la teneur en humidité et l’activité de l’eau (Aw) diminuent tant que la température d’entrée augmente. La viabilité des probiotiques diminue à l’inverse avec la température de séchage. À des températures proches de 120 °C, le probiotique séché a montré une viabilité d’environ 90%, une teneur en humidité de 4,6% p/p et un Aw de 0,26; valeurs adéquates pour garantir la stabilité du produit. Dans ce contexte, des températures de séchage par atomisation supérieures à 120 °C sont nécessaires pour assurer la viabilité et la durée de conservation des cellules microbiennes dans la préparation en poudre et leur survie pendant la transformation et le stockage des aliments.
Introduction
Pour être définis comme des probiotiques, les micro-organismes ajoutés aux aliments (ou suppléments) doivent être consommés vivants, être capables de survivre pendant le passage dans le tractus gastro-intestinal de l’hôte et atteindre le site d’action en quantités suffisantes pour exercer des effets bénéfiques 1,2,7.
L’intérêt croissant pour les probiotiques est dû aux nombreux avantages pour la santé humaine qu’ils confèrent, tels que la stimulation du système immunitaire, la réduction du taux de cholestérol sérique et l’amélioration de la fonction de barrière intestinale en agissant contre les microbes nocifs, ainsi que leurs effets bénéfiques dans le traitement du syndrome du côlon irritable, entre autres 2,3. En outre, plusieurs études ont démontré que les probiotiques peuvent affecter positivement d’autres parties du corps humain où des communautés microbiennes déséquilibrées peuvent causer des maladies infectieuses 3,4,5.
Pour que les probiotiques soient efficaces sur le plan thérapeutique, le produit doit contenir entre 10 6et 107 UFC/g de bactéries au moment de la consommation6. D’autre part, le ministère italien de la Santé et Santé Canada ont établi que le niveau minimum de probiotiques dans les aliments devrait être de 109 UFC / g de cellules viables par jour ou par portion, respectivement7. Étant donné que des charges élevées de probiotiques sont nécessaires pour garantir qu’ils auront des effets bénéfiques, il est essentiel de garantir leur survie pendant le traitement, le stockage en rayon et le passage dans le tractus gastro-intestinal (GI). Plusieurs études ont démontré que la microencapsulation est une méthode efficace pour améliorer la viabilité globale des probiotiques 8,9,10,11.
Dans ce contexte, plusieurs méthodes ont été développées pour la microencapsulation des probiotiques, telles que le séchage par atomisation, la lyophilisation, la pulvérisation, l’émulsion, l’extrusion, la coacervation et, plus récemment, les lits fluidisés11,12,13,14. La microencapsulation par séchage par atomisation (SD) est largement utilisée dans l’industrie alimentaire car il s’agit d’un procédé simple, rapide et reproductible. Il est facile à mettre à l’échelle et a un rendement de production élevé à faible consommation d’énergie11,12,13,14. Néanmoins, l’exposition à des températures élevées et à une faible teneur en humidité peut affecter la survie et la viabilité des cellules probiotiques15. Les deux paramètres peuvent être améliorés pour une souche donnée en déterminant les effets de l’âge et des conditions de culture pour pré-adapter la culture et optimiser les conditions de séchage par atomisation (températures d’entrée et de sortie, processus d’atomisation) et la composition d’encapsulation 8,14,16,17,18.
La composition de la solution d’encapsulation est également un facteur important lors de l’OD car elle peut définir le niveau de protection contre les conditions environnementales défavorables. L’inuline, la gomme arabique, les maltodextrines et le lait écrémé sont largement utilisés comme agents d’encapsulation pour le séchage des probiotiques 5,17,18,19. L’inuline est un fructooligosaccharide qui présente une forte activité prébiotique et favorise la santé intestinale19. Le lait écrémé est très efficace pour maintenir la viabilité des cellules bactériennes séchées et génère une poudre avec de bonnes propriétés de reconstitution17.
Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 est une bactérie lactique qui produit de la bactériocine et présente une activité antilistérielle, en plus des caractères probiotiques20,21. Il s’agit d’une bactérie Gram positif hétérofermentative facultative en forme de bâtonnet qui se développe de 15 °C à 37 °C20 et qui est compatible avec la température corporelle homéostatique. Cette étude avait pour but de présenter toutes les étapes de la production et de la caractérisation physico-chimique d’un probiotique séché par atomisation (L. paraplantarum FT-259) et d’évaluer l’influence des protecteurs et des températures de séchage.
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Protocol
1. Production des cellules probiotiques
- Préparez le bouillon De Man Rogosa et Sharpe (MRS).
- Réactiver 1% (v/v) de la culture d’intérêt dans le bouillon MRS (ici, Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 a été utilisé).
- Incuber pendant 24 h à une température adéquate (nous avons utilisé 37 °C).
2. Séparer les bactéries de la culture
- Centrifuger la culture bactérienne à 7 197 x g pendant 5 min à 4 °C à l’aide de tubes coniques de 50 mL. Il est important que le poids des tubes soit équilibré avant la procédure.
- À l’aide d’une pipette, retirer le surnageant et le jeter dans un récipient approprié. Laver les granulés avec un tampon phosphate (pH 7) et homogénéiser la solution.
- Répétez le processus de centrifugation comme mentionné précédemment.
- Pour obtenir la pastille, utilisez une pipette pour retirer et jeter le surnageant dans un contenant approprié.
3. Ajout d’auxiliaires de séchage
- Sélectionnez la combinaison de deux compositions d’agent de séchage (protecteurs) : mélange inuline:maltodextrine et lait écrémé simulé (tableau 1)22,23.
- Peser 5 g d’inuline et 5 g de maltodextrine pour obtenir la première association de protecteurs.
- Peser 3 g d’inuline, 3 g de lactose, 0,4 g deSiO2 colloïdal et 3,6 g de protéines de lactosérum pour obtenir la deuxième combinaison de protecteurs.
- Ajouter chacun des auxiliaires de séchage à de l’eau ultrapure (1:10) et soumettre à l’agitation magnétique jusqu’à solubilisation.
- Assurez-vous que les protecteurs et l’eau sont homogènes, puis ajoutez les granulés de probiotiques au mélange, et remuez modérément pendant 20 min.
| Auxiliaires de séchage | Inuline et maltodextrine | Lait écrémé simulé |
| Maltodextrine | 5% | - |
| Protéine de lactosérum | - | 3.60% |
| Lactose | - | 3% |
| Inuline | 5% | 3% |
| SiOcolloïdal 2 | - | 0.40% |
Tableau 1 : Composition des auxiliaires de séchage.
4. Séchage par atomisation
- Allumez le sécheur-atomiseur (SD) et réglez le débit de gaz de séchage, la température de séchage à l’entrée, ainsi que le débit et la pression du gaz de l’atomiseur comme suit :
Température d’entrée: 80 °C
Débit d’air : 60 m³/h
Vitesse d’avance: 4 g / min
Débit d’atomisation : 17 L/min
Pression d’atomisation : 1,5 kgf/cm²
Diamètre de la buse de l’atomiseur: 1 mm - Préparer la composition des protecteurs et ajouter les granulés probiotiques concentrés.
- Commencez l’alimentation de la composition probiotique (cellules plus protecteurs) à l’aide d’une pompe péristaltique.
- Démarrez la minuterie et placez le récipient collecteur de produit lorsque la solution pénètre dans l’atomiseur.
- Enregistrez la température de sortie toutes les 5 minutes pour suivre les instabilités de température possibles.
- Arrêtez la minuterie lorsque toute la composition probiotique a été introduite dans le SD.
- Peser le récipient de collecte des produits pour déterminer la quantité de composition introduite dans le système et la quantité de produit sec collectée, pour calculer le rendement de séchage (produit récupéré) grâce à un bilan massique dans le séchoir.
- Utilisez du lait écrémé simulé pour évaluer l’effet de la température sur la viabilité des cellules probiotiques, en établissant cinq températures différentes de séchage par atomisation (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C et 160 °C par rapport à des températures de sortie de 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C et 108 °C).
5. Caractérisation des poudres
- Teneur en humidité du produit
- Pesez précisément 100 mg du produit séché et placez-le dans le récipient de titrage de l’équipement Karl-Fischer.
- Appuyez sur le bouton d’initiation pour lancer le titrage biampérométrique de l’eau présente dans l’échantillon.
- Activité aquatique
- Peser 0,6 g du produit séché dans le compartiment échantillon de l’hygromètre à 25 °C.
- Fermez le capot de l’équipement.
REMARQUE: Le test démarre automatiquement et s’arrête lorsque l’échantillon atteint la pression de vapeur d’équilibre dans le compartiment de l’échantillon.
6. Viabilité des probiotiques
- Diluer les suspensions bactériennes préalablement préparées dans 9 mL d’eau peptone (0,1 %, v/v).
- Vortex jusqu’à dispersion complète.
- Effectuer des dilutions décimales en série (1:10) dans 9 mL de solution saline (NaCl à 0,9 %).
- Ensemencer les dilutions sur des plaques de gélose MRS et incuber à 37 °C pendant 24-48 h.
- Comptez les unités formant colonies (UFC/g) à l’aide d’un compteur de colonies avec loupe.
- Calculer la viabilité probiotique dans le produit séché selon l’équation suivante :
EE (%) = (N∕N o) × 100
où, N est le nombre de cellules viables après séchage par atomisation, et No est le nombre de cellules bactériennes avant séchage par atomisation. - Exprimer le nombre de cellules viables en UFC/g de dispersion du produit.
7. Analyse des données
- Tabulez les données obtenues dans un logiciel statistique et effectuez l’analyse à l’aide d’un test de comparaison multiple (ANOVA).
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Representative Results
Dans cette étude, L. paraplantarum a été encapsulé par SD à l’aide d’agents d’encapsulation de qualité alimentaire (inuline:maltodextrine et poudre de lait simulé), montrant une qualité et une efficacité élevées du produit dans la préservation de la viabilité cellulaire bactérienne17,19.
Les résultats de l’écart-type des probiotiques à 80 °C ont montré que les systèmes protecteurs distincts (inuline:maltodextrine et lait écrémé simulé) favorisaient une protection efficace des cellules probiotiques, avec des viabilités de 95,1% et 97,0%, respectivement. Le rendement du produit était proche de 50 % p/p pour les deux systèmes de protection et était légèrement supérieur pour le lait écrémé simulé, ce qui a généré un produit avec une meilleure apparence et fluidité. Ensuite, la composition probiotique combinée au lait écrémé simulé a été soumise à un séchage par atomisation à des températures plus élevées de 80 °C à 160 °C (Figure 1).
Comme prévu, l’augmentation de la température SD a eu tendance à diminuer la viabilité des probiotiques, qui a atteint près de 80% à 160 ° C. On peut également voir à la figure 1 que l’effet de la température de séchage sur le rendement du produit était négligeable, avec une valeur moyenne de 50,7 % ± 2,4 % p/p; Ces valeurs sont couramment observées pour les sécheurs-atomiseurs à l’échelle du laboratoire. Ces résultats indiquent que le lait écrémé simulé est un bon système protecteur pour le séchage probiotique, car il génère un produit de haute qualité avec de bonnes performances du système (rendement du produit).
La teneur en humidité et l’activité de l’eau des poudres ont diminué à l’inverse avec la température de séchage par atomisation, comme prévu (Figure 2).
Figure 1 : Rendement en poudre (%) et viabilité des probiotiques (%) en fonction de la température SD (°C), avec du lait écrémé simulé comme agent de séchage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Teneur en humidité et activité de l’eau des échantillons de probiotiques séchés en fonction de la température SD (°C), avec du lait écrémé simulé comme système protecteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L. paraplantarum FT-259 est une bactérie Gram-positive, en forme de bâtonnet, est un producteur de bactériocines à activité antilistérielle et a un potentiel probiotique élevé20. Son et coll.24 ont déjà démontré la capacité immunostimulante et antioxydante des souches de L. paraplantarum. En outre, ils ont un grand potentiel probiotique, avec des propriétés telles que la stabilité dans des conditions gastriques et biliaires artificielles, la sensibilité aux antibiotiques et la liaison aux cellules intestinales. De plus, ils ne produisent pas de métabolites pouvant affecter négativement le tractus gastro-intestinal. En outre, Choi et Chang25 ont étudié le L. plantarum EM et ont rapporté son potentiel de réduction du cholestérol basé sur son activité d’hydrolase des sels biliaires et sa capacité de liaison à la surface cellulaire. En plus de présenter une tolérance aux stress acides et biliaires, L. plantarum EM a également montré une activité antimicrobienne contre les agents pathogènes et la résistance aux antibiotiques, validant son potentiel en tant que probiotique.
Cependant, la production de probiotiques séchés pour la commercialisation est difficile, car les micro-organismes sont exposés à divers facteurs de stress, tels que les stress thermiques, mécaniques, osmotiques et oxydatifs. Les températures élevées impliquées dans le processus peuvent favoriser la dénaturation des enzymes et des protéines impliquées dans le métabolisme de la cellule, entraînant des pertes de viabilité microbienne. L’élimination de l’eau pendant le séchage est également un facteur critique puisqu’une teneur minimale en eau est nécessaire pour maintenir l’activité métabolique essentielle26. Les forces de cisaillement élevées causées par le passage du mélange probiotique à travers l’atomiseur pendant l’écart-type peuvent également endommager la structure de la cellule probiotique, contribuant aux pertes de viabilité27,28. Par conséquent, la sélection correcte des conditions de fonctionnement SD (par exemple, les températures de séchage à l’entrée et à la sortie, le débit de gaz de séchage, le débit d’alimentation de la composition probiotique, la pression d’atomisation et le débit de gaz) est essentielle pour minimiser les pertes de viabilité des cellules pendant le séchage par atomisation, améliorer la qualité du produit et, par conséquent, obtenir des performances de séchage acceptables.
La composition des constituants chargés avec les probiotiques est également un facteur pertinent puisque les formulations mal conçues ne protègent pas les probiotiques pendant le séchage et le stockage, ce qui entraîne des pertes de viabilité importantes. Les propriétés de la composition sont améliorées par l’ajout de ce que l’on appelle des agents séchants (ou agents protecteurs), qui peuvent fournir une certaine protection aux cellules de micro-organismes pendant le SD et le stockage26,29. Les glucides (par exemple, les monosaccharides, les disaccharides, les polysaccharides, les oligosaccharides, etc.), les protéines et le lait écrémé reconstitué sont généralement ajoutés à la composition probiotique pour protéger les cellules des micro-organismes pendant l’auto-développement. Bien que peu clair, l’effet protecteur du lait écrémé est associé à sa composition complexe, car il contient du lactose, des matières grasses, de la caséine, des protéines de lactosérum et des cations Ca2+; certains auteurs ont fait valoir que les protéines de lactosérum et Ca2+ ont un effet plus important que le lactose30,31. Selon Fu et al.17, l’utilisation de lait écrémé additionné de lactosérum confère une protection thermique élevée aux probiotiques en raison des interactions hydrophobes entre les protéines laitières et les cellules bactériennes 17.
Les effets protecteurs des auxiliaires desséchants sur la viabilité des probiotiques s’expliquent par trois hypothèses utilisées pour justifier le maintien de la conformation des protéines et des activités enzymatiques au cours de l’autodestruction, à savoir la théorie de la vitrification, l’hypothèse du remplacement de l’eau et l’hypothèse des forces d’hydratation, qui ont été pleinement discutées par Broeckx et coll.30.
Stresser les probiotiques pendant la culture est une autre méthode qui peut être utilisée pour améliorer la résistance des cellules probiotiques pendant la SD.
Dans le présent protocole, les effets des systèmes protecteurs (un mélange d’inuline:maltodextrine et de lait écrémé simulé) et la température de séchage par atomisation sur la viabilité et les propriétés du probiotique séché, ainsi que sur la performance du SD ont été évalués.
Le choix du lait écrémé simulé a été basé sur les travaux de Písecký22. Le fructooligosaccharide inuline et le lactose ont été ajoutés comme glucides (au lieu de seulement lactose), et le dioxyde de silicium a été ajouté comme cendre. Le choix de l’inuline était basé sur la littérature, où il a été décrit comme un agent prébiotique qui peut améliorer les avantages des probiotiques dans l’intestin32,33. La comparaison des effets protecteurs de ces aides au séchage sur la viabilité des probiotiques après SD a été effectuée à 80 ° C. Les résultats ont montré que le lait écrémé simulé favorisait une viabilité probiotique plus élevée que la combinaison inuline/maltodextrine à 80 °C. Ainsi, une étude des effets de la température de séchage (80 °C à 160 °C) sur la viabilité des probiotiques et le rendement en poudre a été réalisée avec le lait écrémé simulé. Comme le montre la figure 1, l’augmentation de la température d’entrée, qui a entraîné une augmentation de la température de sortie, a réduit la survie de la bactérie, comme prévu17. Cependant, le rendement en poudre n’a changé à aucune température, restant autour de 50%.
Le niveau de déshydratation des probiotiques est également lié à leurs pertes de viabilité pendant le séchage et le stockage du produit. Les réactions physiques et chimiques détérioratives d’un produit séché dépendent du niveau d’eau libre34, mais une déshydratation excessive peut réduire considérablement la viabilité du probiotique séché. Comme prévu, l’augmentation de la température de séchage a favorisé une réduction de la teneur en humidité du produit et de l’activité de l’eau, qui ont atteint des valeurs de 3,01% ± 0,30% (p/p) et 0,201 ± 0,006 à 160 °C, respectivement. Les valeurs d’Aw inférieures à la teneur en humidité de la monocouche (~0,40) sont généralement associées à une durée de conservation plus longue en raison de la réduction de l’eau libre disponible pour les réactions biochimiques et la croissance microbienne34. Cependant, à très faible niveau d’eau (<0,20), les réactions de peroxydation lipidique augmentent considérablement, ce qui peut nuire à la viabilité du produit pendant le stockage. Au niveau de la teneur en humidité, il est préférable que les valeurs restent dans la plage de 2,8% à 5,6% pour garantir la conservation des probiotiques et réduire les réactions biochimiques détérioratives à long terme35,36.
La figure 2 montre que des températures de séchage par atomisation supérieures à 120 °C sont nécessaires pour obtenir un produit avec l’Aw recommandé. À cette température, le probiotique séché a montré une viabilité d’environ 90%, une teneur en humidité de 4,6% p/p et un Aw de 0,26, ce qui sont d’excellents résultats. Martins et coll.37, dans une étude d’optimisation du séchage par atomisation des cellules de Lactococcus lactis , ont recommandé une valeur Aw de 0,198 et une température de séchage par pulvérisation à l’entrée de 126 °C pour minimiser les pertes de viabilité des microorganismes, qui sont en accord étroit avec les valeurs de ce protocole.
D’autres méthodes de caractérisation des poudres pourraient être effectuées, par exemple pour examiner les caractéristiques morphologiques, l’adhérence36, la fluidité et la compressibilité38.
Dans ce contexte, des températures de séchage par atomisation supérieures à 120 °C sont nécessaires pour garantir la viabilité et la durée de conservation des cellules microbiennes dans une préparation en poudre et leur survie pendant la transformation et le stockage des aliments. En termes industriels, c’est un excellent résultat, car la technologie de séchage par atomisation est peu coûteuse par rapport à la lyophilisation, réduisant ainsi le prix du produit. De plus, la survie supérieure à 50% semble être une plage robuste qui garantit la fonctionnalité de la poudre probiotique28, ce qui signifie que la survie est un bon indicateur pour reproduire ce protocole à l’échelle industrielle. Cependant, la mise à l’échelle aux conditions industrielles doit être testée pour s’assurer que le produit a les mêmes caractéristiques que la poudre obtenue dans ce protocole.
Les méthodes décrites dans ce protocole visaient à clarifier l’importance d’une sélection correcte de la composition et du traitement des variables lors du séchage par atomisation des bactéries probiotiques afin d’assurer la viabilité et la stabilité de la poudre.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Code financier 001. Cette étude a également été financée en partie par FAPESP - São Paulo Research Foundation. E.C.P.D.M. est reconnaissant pour une bourse de chercheur du Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) 306330/2019-9.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Lab 4TEV | Decagon Devices | - | Water activity meter |
| Centrifuge (mod. 5430 R ) | Eppendorf | - | Centrifuge |
| Colloidal SiO2 (Aerosil 200) | Evokik | 7631-86-9 | drying aid |
| Fructooligosaccharides from chicory | Sigma-Aldrich | 9005-80-5 | drying aid |
| GraphPad Prism (version 8.0) software | GraphPad Software | - | San Diego, California, USA |
| Karl Fischer 870 Titrino Plus | Metrohm | - | Moisture content |
| Lactose | Milkaut | 63-42-3 | drying aid |
| Maltodextrin | Ingredion | 9050-36-6 | drying aid |
| Milli-Q | Merk | - | Ultrapure water system |
| MRS Agar | Oxoid | - | Culture medium |
| MRS Broth | Oxoid | - | Culture medium |
| OriginPro (version 9.0) software | OriginLab | - | Northampton, Massachusetts, USA |
| Spray dryer SD-05 | Lab-Plant Ltd | - | Spray dryer |
| Whey protein | Arla Foods Ingredients S.A. | 91082-88-1 | drying aid |
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