Summary
このプロトコルは、噴霧乾燥プロバイオティクス製品の製造および物理化学的特性評価に関連するステップを詳述しています。
Abstract
プロバイオティクスとプレバイオティクスは、その健康上の利点のために、食品および製薬業界にとって非常に興味深いものです。プロバイオティクスは人間と動物の健康に有益な効果をもたらすことができる生きたバクテリアであり、プレバイオティクスは有益な腸内細菌を養う栄養素の一種です。粉末プロバイオティクスは、摂取の容易さと実用性、および栄養補助食品としての食事への組み込みのために人気を博しています。ただし、高温はプロバイオティクス細菌を不活性化するため、乾燥プロセスは細胞の生存率を妨げます。これに関連して、この研究は、噴霧乾燥プロバイオティクスの製造と物理化学的特性評価に関連するすべてのステップを提示し、保護剤の影響を評価することを目的としていました(模擬スキムミルクとイヌリン:マルトデキストリン関連)粉末収量と細胞生存率の増加における乾燥温度。結果は、シミュレートされたスキムミルクが80°Cでより高いプロバイオティクス生存率を促進することを示しました。 この保護剤を使用すると、入口温度が上昇する限り、プロバイオティクスの生存率、水分含有量、および水分活性(Aw)が低下します。プロバイオティクスの生存率は、乾燥温度によって逆に低下します。120°Cに近い温度で、乾燥したプロバイオティクスは約90%の生存率、4.6%w / wの水分含有量、および0.26のAwを示しました。製品の安定性を保証するのに十分な値。これに関連して、粉末調製物における微生物細胞の生存率と貯蔵寿命、および食品加工および保管中の生存を確保するために、120°Cを超える噴霧乾燥温度が必要です。
Introduction
プロバイオティクスとして定義されるためには、食品(またはサプリメント)に添加された微生物は生きたまま消費され、宿主の胃腸管での通過中に生存し、有益な効果を発揮するのに十分な量の作用部位に到達できなければならない1,2,7。
プロバイオティクスへの関心の高まりは、免疫系の刺激、血清コレステロール値の低下、有害な微生物に対する作用による腸のバリア機能の強化など、プロバイオティクスが人間の健康に与えるいくつかの利点、および過敏性腸症候群の治療におけるそれらの有益な効果によるものです。 とりわけ2,3。さらに、いくつかの研究は、プロバイオティクスが、不均衡な微生物群集が感染症を引き起こす可能性のある人体の他の部分にプラスの影響を与える可能性があることを実証しています3,4,5。
プロバイオティクスが治療的に効果的であるためには、製品には消費時に106-10 7 CFU / gの細菌が含まれている必要があります6。一方、イタリア保健省カナダは、食品中のプロバイオティクスの最小レベルは、それぞれ1日あたりまたは1食あたり109 CFU / gの生細胞でなければならないことを確立しました7。有益な効果を保証するために大量のプロバイオティクスが必要であることを考えると、加工、貯蔵貯蔵、および胃腸(GI)管を通過する際の生存を保証することが不可欠です。いくつかの研究は、マイクロカプセル化がプロバイオティクスの全体的な生存率を改善するための効果的な方法であることを示しています8、9、10、11。
これに関連して、プロバイオティクスのマイクロカプセル化のために、噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧冷却、エマルジョン、押出、コアセルベーション、および最近では流動床11、12、13、14などのいくつかの方法が開発されてきた。噴霧乾燥(SD)によるマイクロカプセル化は、シンプルで高速で再現性のあるプロセスであるため、食品業界で広く使用されています。スケールアップが容易で、低エネルギー要件11,12,13,14で高い生産歩留まりが得られます。それにもかかわらず、高温および低含水量への曝露は、プロバイオティクス細胞の生存および生存率に影響を及ぼし得る15。両方のパラメータは、培養を事前に適応させ、噴霧乾燥条件(入口および出口温度、微粒化プロセス)および封入組成物を最適化するための培養年齢および条件の影響を決定することによって、所与の菌株について改善することができる8、14、16、17、18。
カプセル化溶液の組成も、悪環境条件に対する保護のレベルを定義できるため、SD中の重要な要素です。イヌリン、アラビアガム、マルトデキストリン、およびスキムミルクは、プロバイオティクス乾燥のためのカプセル化剤として広く使用されています5,17,18,19。イヌリンは、強力なプレバイオティクス活性を示し、腸の健康を促進するフラクトオリゴ糖です19。スキムミルクは、乾燥した細菌細胞の生存率を維持するのに非常に効果的であり、良好な再構成特性を有する粉末を生成する17。
ラクチプランティバチルス・パラプランタルムFT-259は、プロバイオティクス形質20,21に加えて、バクテリオシンを生成し、抗リステリスター活性を示す乳酸菌です。15°Cから37°C20まで増殖し、恒常性体温に適合する通性ヘテロ発酵棒状グラム陽性菌です。この研究は、噴霧乾燥プロバイオティクス(L. paraplantarum FT-259)の製造と物理化学的特性評価に関与するすべてのステップを提示し、保護剤と乾燥温度の影響を評価することを目的としています。
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Protocol
1.プロバイオティクス細胞の生産
- デマンロゴサとシャープ(MRS)ブロスを準備します。
- MRSブロスで目的の培養物の1%(v / v)を再活性化します(ここでは、 ラクチプランティバチルスパラプランタルム FT-259を使用しました)。
- 適切な温度で24時間インキュベートします(37°Cを使用しました)。
2.細菌を培養物から分離します
- 50 mLコニカルチューブを使用して、細菌培養物を7,197 x g で4°Cで5分間遠心分離します。手順の前にチューブの重量のバランスをとることが重要です。
- ピペットを使用して、上清を取り除き、適切な容器に捨てます。ペレットをリン酸緩衝液(pH 7)で洗浄し、溶液を均質化する。
- 前述のように遠心分離プロセスを繰り返します。
- ペレットを得るには、ピペットを使用して上清を除去し、適切な容器に廃棄します。
3.乾燥助剤の添加
- イヌリン:マルトデキストリン混合物と模擬スキムミルクの2つの乾燥助剤組成物(保護剤)の組み合わせを選択します(表1)22,23。
- 5 gのイヌリンと5 gのマルトデキストリンを量って、保護剤の最初の組み合わせを得ます。
- 3 gのイヌリン、3 gのラクトース、0.4 gのコロイド状SiO 2、および3.6 gのホエイタンパク質を量って、保護剤の2番目の組み合わせを得ます。
- 各乾燥助剤を超純水(1:10)に加え、可溶化されるまで磁気攪拌を行います。
- 保護剤と水が均一であることを確認してから、プロバイオティクスペレットを混合物に加え、20分間適度に攪拌します。
| 乾燥助剤 | イヌリンとマルトデキストリン | 模擬スキムミルク |
| マルトデキストリン | 5% | - |
| ホエイプロテイン | - | 3.60% |
| 乳糖 | - | 3% |
| イヌリン | 5% | 3% |
| コロイド状SiO2 | - | 0.40% |
表1:乾燥助剤の組成。
4.噴霧乾燥
- スプレードライヤー(SD)の電源を入れ、乾燥ガス流量、入口乾燥温度、アトマイザーガス流量と圧力を次のように設定します。
入口温度:80°C
空気流量:60 m³/h
送り速度:4グラム/分
霧化流量:17リットル/分
霧化圧力:1.5キログラム/cm²
アトマイザーノズルの直径:1 mm - 保護剤組成物を調製し、濃縮プロバイオティクスペレットを添加する。
- 蠕動ポンプを通してプロバイオティクス組成物(細胞と保護剤)の供給を開始します。
- タイマーを開始し、溶液がアトマイザーに入ったら製品収集容器を置きます。
- 5分ごとに出口温度を登録して、起こりうる温度不安定性を追跡します。
- すべてのプロバイオティクス組成物がSDに供給されたら、タイマーを停止します。
- 生成物回収容器を秤量して、システムに供給される組成物の量および回収された乾燥生成物の量を決定し、乾燥機内の質量バランスを通じて乾燥収率(生成物回収)を計算する。
- 模擬スキムミルクを使用して、5つの異なる噴霧乾燥温度(80°C、100°C、120°C、140°C、および160°C対出口温度59°C、70°C、83°C、96°C、および108°C)を設定することにより、プロバイオティクス細胞の生存率に対する温度の影響を評価します。
5. 粉末の特性評価
- 製品の含水率
- 乾燥製品100 mgを正確に計量し、カールフィッシャー装置の滴定容器に入れます。
- 開始ボタンを押して、サンプル中に存在する水のバイアンペロメトリック滴定を開始します。
- 水分活性
- 乾燥製品0.6gを湿度計のサンプルコンパートメントに25°Cで計量します。
- 機器カバーを閉じます。
注意: テストは自動的に開始され、サンプルがサンプルコンパートメント内の平衡蒸気圧に達すると停止します。
6.プロバイオティクスの生存率
- 事前に調製した細菌懸濁液を9 mLのペプトン水(0.1%、v / v)で希釈します。
- 完全に分散するまで渦。
- 9 mLの生理食塩水(0.9%NaCl)で連続10進希釈(1:10)を実行します。
- 希釈液をMRS寒天プレートに播種し、37°Cで24〜48時間インキュベートします。
- 拡大レンズ付きのコロニーカウンターを使用してコロニー形成単位(CFU / g)をカウントします。
- 次の式に従って、乾燥製品のプロバイオティクス生存率を計算します。
EE (%) = (N∕No) × 100
ここで、 N は噴霧乾燥後の生細胞数であり、 Noは 噴霧乾燥前の細菌細胞数である。 - 生細胞数を製品分散液のCFU/gで表します。
7.データ分析
- 得られたデータを統計ソフトで集計し、多重比較検定(ANOVA)を用いて分析を行います。
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Representative Results
この研究では、L. paraplantarumは、食品グレードのカプセル化剤(イヌリン:マルトデキストリンおよび模擬粉乳)を使用してSDによってカプセル化され、細菌細胞の生存率を維持する上で高い製品品質と有効性を示しました17,19。
80°CでのプロバイオティクスのSDの結果は、異なる保護剤システム(イヌリン:マルトデキストリンおよび模擬スキムミルク)がプロバイオティクス細胞の効率的な保護を促進し、生存率がそれぞれ95.1%および97.0%であることを示しました。生成物収率は、両方の保護剤システムで50%w/w近くであり、模擬スキムミルクではわずかに優れており、外観と流動性に優れた製品を生成しました。次に、模擬スキムミルクと組み合わせたプロバイオティクス組成物を、80°Cから160°Cの高温での噴霧乾燥にかけました(図1)。
予想通り、SD温度の上昇はプロバイオティクスの生存率を低下させる傾向があり、160°Cで80%近くに達しました。 また、 図1 では、乾燥温度が製品の歩留まりに与える影響はごくわずかであり、平均値は50.7%±2.4%w / wであることがわかります。これらの値は、ラボスケールの噴霧乾燥機で一般的に観察されます。これらの結果は、模擬スキムミルクは、優れたシステム性能(製品収率)を備えた高品質の製品を生成するため、プロバイオティクス乾燥のための優れた保護システムであることを示しています。
粉末の含水率と水分活性は、予想通り噴霧乾燥温度とともに逆に減少しました(図2)。
図1:乾燥助剤としてシミュレートされたスキムミルクを使用した、SD温度(°C)に応じた粉末収率(%)とプロバイオティクス生存率(%)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:保護剤システムとしてシミュレートされたスキムミルクを使用した、SD温度(°C)による乾燥プロバイオティクスサンプルの水分含有量と水分活性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
L.パラプランタルム FT-259はグラム陽性の棒状細菌であり、抗リステリア活性を有するバクテリオシンの生産者であり、高いプロバイオティクスポテンシャルを有する20。Son et al.24 は以前、 L. paraplantarum 株の免疫賦活剤および抗酸化能力を実証した。さらに、それらは、人工胃および胆汁条件下での安定性、抗生物質に対する感受性、腸細胞への結合などの特性を備えた、大きなプロバイオティクスの可能性を秘めています。さらに、それらは胃腸管に悪影響を及ぼす可能性がある代謝産物を産生しない。さらに、ChoiとChang25は、 L. plantarum EMを研究し、その胆汁酸塩加水分解酵素活性と細胞表面結合能力に基づいてコレステロール低下の可能性を報告しました。 L. plantarum EMは、酸ストレスや胆汁ストレスに対する耐性に加えて、病原体に対する抗菌活性や抗生物質耐性も示し、プロバイオティクスとしての可能性を検証しました。
しかし、微生物は熱的、機械的、浸透圧的、酸化的ストレスなどのさまざまなストレス要因にさらされるため、商業化のための乾燥プロバイオティクスの製造は困難です。プロセスに関与する高温は、細胞の代謝に関与する酵素およびタンパク質の変性を促進し、微生物の生存率の損失を引き起こす可能性があります。本質的な代謝活性を維持するためには最小限の水分含有量が必要であるため、乾燥中の水分除去も重要な要素です26。SD中にプロバイオティクス混合物がアトマイザーを通過することによって引き起こされる高いせん断力も、プロバイオティクス細胞の構造を損傷し、生存率の損失に寄与する可能性があります27,28。したがって、SD動作条件(入口および出口乾燥温度、乾燥ガス流量、プロバイオティクス組成物の供給流量、噴霧圧力、ガス流量など)を正しく選択することは、噴霧乾燥中の細胞生存率の損失を最小限に抑え、製品の品質を向上させ、したがって許容可能な乾燥機性能を得るために不可欠です。
プロバイオティクスを充填した成分の組成も、設計が不十分な製剤は乾燥および保管中にプロバイオティクスを保護せず、重大な生存率の損失を引き起こすため、関連する要因です。組成物特性は、SDおよび貯蔵中に微生物細胞に一定の保護を提供することができる、いわゆる乾燥助剤(または保護剤)の添加によって改善される26、29。炭水化物(例えば、単糖類、二糖類、多糖類、オリゴ糖など)、タンパク質、および再構成脱脂乳は、通常、SD中に微生物細胞を保護するためにプロバイオティクス組成物に添加される。不明ですが、スキムミルクの保護効果は、乳糖、脂肪、カゼイン、ホエイプロテイン、およびCa2+カチオンが含まれているため、その複雑な組成に関連しています。一部の著者は、乳清タンパク質とCa2+が乳糖30,31よりも顕著な効果があると主張しています。Fu et al.17によれば、乳清を添加したスキムミルクの使用は、乳タンパク質と細菌細胞との間の疎水性相互作用により、プロバイオティクスに高い熱保護を与える17。
プロバイオティクスの生存率に対する乾燥助剤の保護効果は、SD中のタンパク質立体構造と酵素活性の維持を正当化するために使用される3つの仮説、すなわちガラス化理論、水置換仮説、および水和力仮説によって説明され、Broeckxらによって完全に議論されています30。
培養中にプロバイオティクスを強調することは、SD中のプロバイオティクス細胞抵抗性を増強するために使用できる別の方法です。
本プロトコルでは、保護剤システム(イヌリン:マルトデキストリンと模擬スキムミルクの混合物)、および乾燥プロバイオティクスの生存率と特性、およびSD性能に対する噴霧乾燥温度の影響を評価しました。
模擬スキムミルクの選択は、Písecký22の研究に基づいていました。フラクトオリゴ糖イヌリンとラクトースを炭水化物として添加し(ラクトースだけでなく)、灰分として二酸化ケイ素を添加した。イヌリンの選択は文献に基づいており、腸内のプロバイオティクスの利点を改善することができるプレバイオティクス剤として説明されています32,33。SD後のプロバイオティクス生存率に対するこれらの乾燥助剤の保護効果の比較は、80°Cで行った。 結果は、シミュレートされたスキムミルクが80°Cでイヌリン:マルトデキストリンの組み合わせよりも高いプロバイオティクス生存率を促進することを示しました。 したがって、乾燥温度(80°C〜160°C)がプロバイオティクスの生存率と粉末収量に及ぼす影響の研究が、シミュレートされたスキムミルクで実施されました。図1に示すように、入口温度の上昇により出口温度が上昇し、予想通り細菌の生存率が低下しました17。しかし、粉末収率はどの温度でも変化せず、約50%にとどまった。
プロバイオティクスの脱水レベルは、乾燥および製品保管中の生存率の損失にも関連しています。乾燥製品の物理的および化学的劣化反応は自由水位34に依存しますが、過度の脱水は乾燥プロバイオティクスの生存率を著しく低下させる可能性があります。予想通り、乾燥温度の上昇は製品含水率と水分活性の低下を促進し、160°Cでそれぞれ3.01%±0.30%(w/w)および0.201±0.006の値に達しました。単層含水率(~0.40)を下回るAwの値は、通常、生化学反応と微生物の増殖に利用できる自由水の減少により、貯蔵寿命が長くなります34。しかしながら、非常に低い水分活性(<0.20)では、脂質過酸化反応が著しく増加し、これは貯蔵中の生成物生存率に有害であり得る。含水率に関しては、プロバイオティクスの保存を保証し、長期的に劣化する生化学反応を減らすために、値が2.8%から5.6%の範囲にとどまることが好ましい35,36。
図2 は、推奨Awの製品を製造するには、120°Cを超える噴霧乾燥温度が必要であることを示しています。この温度では、乾燥プロバイオティクスは約90%の生存率、4.6%の含水率w / w、および0.26のAwを示し、優れた結果です。Martinsら37は、 ラクトコッカスラクチス 細胞の噴霧乾燥の最適化研究において、微生物の生存率の損失を最小限に抑えるために、Aw値を0.198、入口噴霧乾燥温度を126°Cにすることを推奨しており、これはこのプロトコルの値と密接に一致しています。
形態学的特性、粘着性36、流動性、および圧縮性38を調べるなど、他の粉末特性評価方法論を実行することができます。
これに関連して、粉末製剤中の微生物細胞の生存率および貯蔵寿命ならびに食品加工および貯蔵中のそれらの生存を保証するために、120°Cを超える噴霧乾燥温度が必要である。工業的には、噴霧乾燥技術は凍結乾燥に比べて低コストであり、製品価格を下げるため、これは優れた結果です。さらに、50%を超える生存率は、プロバイオティクス粉末の機能を保証する堅牢な範囲であるように思われ28、生存率はこのプロトコルを工業規模で再現するための優れた指標であることを意味します。ただし、工業的条件へのスケールアップは、製品がこのプロトコルで得られた粉末と同じ特性を持っていることを確認するためにテストする必要があります。
このプロトコルに記載されている方法は、粉末の生存率と安定性を確保するために、プロバイオティクス細菌の噴霧乾燥中に組成物を正しく選択し、変数を処理することの重要性を明らかにすることを目的としていました。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究の一部は、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001によって資金提供された。この研究は、FAPESP(サンパウロ研究財団)によっても部分的に支援されました。E.C.P.D.M.は、国立科学技術開発評議会(CNPq)306330 / 2019-9からの研究者フェローシップに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Lab 4TEV | Decagon Devices | - | Water activity meter |
| Centrifuge (mod. 5430 R ) | Eppendorf | - | Centrifuge |
| Colloidal SiO2 (Aerosil 200) | Evokik | 7631-86-9 | drying aid |
| Fructooligosaccharides from chicory | Sigma-Aldrich | 9005-80-5 | drying aid |
| GraphPad Prism (version 8.0) software | GraphPad Software | - | San Diego, California, USA |
| Karl Fischer 870 Titrino Plus | Metrohm | - | Moisture content |
| Lactose | Milkaut | 63-42-3 | drying aid |
| Maltodextrin | Ingredion | 9050-36-6 | drying aid |
| Milli-Q | Merk | - | Ultrapure water system |
| MRS Agar | Oxoid | - | Culture medium |
| MRS Broth | Oxoid | - | Culture medium |
| OriginPro (version 9.0) software | OriginLab | - | Northampton, Massachusetts, USA |
| Spray dryer SD-05 | Lab-Plant Ltd | - | Spray dryer |
| Whey protein | Arla Foods Ingredients S.A. | 91082-88-1 | drying aid |
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