Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Magnetisk fluorescerende perlebasert dual-reporter strømningsanalyse av PDL1-vaxx peptidvaksineindusert antistoffblokade av PD-1 / PD-L1-interaksjonen

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65467
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Sjekkpunkthemmere er viktige mål for å utvikle terapier for kampen mot kreft. Denne rapporten introduserer en ny PDL1-peptidbasert kreftvaksine, PDL1-Vaxx, som induserer nøytraliserende polyklonal antistoffproduksjon som blokkerer PD-1 / PDL1-kompleksdannelse. Dette arbeidet beskriver også utvikling og testing av en fluorescerende perlebasert analyse for å analysere denne aktiviteten.

Abstract

Inhiberingen av sjekkpunktreseptorer (PD-1, PD-L1 og CTLA-4) med monoklonale antistoffer har vist stor nytte i kliniske studier for behandling av kreftpasienter og har blitt en bærebjelke tilnærming i moderne kreftimmunterapi. Imidlertid er det bare en undergruppe av pasienter som responderer på immunterapi med sjekkpunktmonoklonale antistoffer. Derfor er det presserende å utvikle nye terapeutiske strategier mot kreft. En ny B-celle peptidepitop PDL1 (programmert dødsligand 1) kreftvaksine er utviklet, med aminosyrer 130-147 knyttet til MVF-peptidet ("promiskuøs" T-celle meslinger virus fusjonsprotein) via en GPSL-linker. Preklinisk testing har indikert at denne PDL1-vaksinen (PDL1-Vaxx) effektivt stimulerer svært immunogene antistoffer hos dyr. Dyr immunisert med PDL1-Vaxx viser redusert tumorbelastning og utvidet overlevelse i ulike dyrekreftmodeller. Virkningsmekanismene indikerer at vaksinefremkalte antistoffer hemmer tumorcelleproliferasjon, induserer apoptose og blokkerer PD-1 / PD-L1-interaksjonen. Dette manuskriptet introduserer en magnetisk perlebasert analyse som bruker et dual-reporter-strømningsanalysesystem for å evaluere PD-1 / PD-L1-interaksjonen og dens blokkering av anti-PDL1-antistoffene hevet mot PDL1-Vaxx.

Introduction

I immunsystemets T-celler, B-celler og intracellulære sjekkpunkter regulerer signalveier immunaktiviteter. Noen kreftceller beskytter seg mot immunangrep ved å stimulere sjekkpunktmål, som hemmer immunfunksjonen og fremmer neoplastisk overlevelse og spredning. Onkologisk immunterapi ved kontrollpunkthemming bruker antistoffer til å målrette og blokkere signalkontrollpunktene og dermed gjenopprette immunsystemets anti-neoplastiske funksjoner 1,2,3. Svært effektive kreftbehandlinger inkluderer for tiden de monoklonale antistoffene nivolumab, som retter seg mot programmert dødsprotein 1 (PD-1)4, og atezolizumab, som retter seg mot programmert dødsligand 1 (PD-L1)5. Denne tilnærmingen har vist stor klinisk suksess i behandling av kreftpasienter. Den kliniske nytten av gjeldende kontrollpunkthemmingsstrategier reduseres imidlertid av bivirkninger og behandlingsresistens, spesielt ved behandling med enkeltmiddel6. En kombinasjon av immunterapi og mer effektive terapeutiske strategier med lavere toksisitet er presserende nødvendig i kreftbehandling 1,3,6.

I løpet av de siste 30 årene har Dr. Kaumayas laboratorium utviklet peptidkreftvaksiner og peptidetterligningsrelaterte midler for kreftbehandling, hvorav noen er i pågående kliniske studier 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . For eksempel har B-Vaxx med HER-2 kombinasjonsimmunterapi vist pasientfordeler mot metastatiske og/eller tilbakevendende solide tumorer i kliniske studier12. Laboratoriets nyeste kreftvaksiner er PD1-Vaxx 2,13 og PDL1-Vaxx14, som har vist store fordeler i prekliniske studier, spesielt i kombinasjonsbehandling. PD1-Vaxx har fullført kliniske dose-eskaleringsstudier i USA og Australia. PD1-Vaxx vil bli kombinert med atezolizumab i fase 1b-studien som starter i mai 2023. Denne rapporten fokuserer på å evaluere evnen til PDL1-Vaxx-induserte antistoffer til å blokkere PD-1 / PD-L1-interaksjonen.

PDL1-Vaxx kreftvaksine er en ny B-celle peptidepitopvaksine med PD-L1 aminosyrer 130-147 knyttet til det promiskuøse T-celle meslinger virus fusjon (MVF) peptid via en GPSL peptid linker. Prekliniske studier har vist at PDL1-Vaxx er svært immunogen i å stimulere antistoffproduksjon mot kreft i ulike dyremodeller, forlenger overlevelsen og reduserer tumorbelastningen14. Disse antistoffene generert mot PD-L1-peptidet kan med hell blokkere PD1 / PD-L1-interaksjonen, og dermed resultere i anti-neoplastisk aktivitet. Denne rapporten introduserer en analyse som analyserer blokaden av PD1 / PD-L1-kompleksdannelse av PDL1-Vaxx-induserte antistoffer ved bruk av et magnetisk perlebasert format med en dual-reporter-avlesning på et flowcytometriinstrument.

Protocol

1. Eksperimentell forberedelse

MERK: Detaljene for alle reagensene/utstyret som er nevnt i dette trinnet, er oppført i materialfortegnelsen.

  1. Oppnå rekombinant human PD-1 (rhPD-1; polyhistidin-merket). Rekonstituer lyofilisert rhPD1 med sterilfiltrert fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, før bruk.
  2. Oppnå biotinylert rekombinant human PD-L1 (rhPD-L1). Rekonstituer lyofilisert rhPD-L1 med sterilt avionisert vann før bruk.
  3. Få streptapavidin-konjugert R-phycoerythrin detection reagent (SAPE). Oppbevar alle SAPE-oppløsninger beskyttet mot lys ved kjøleskapstemperaturer (dvs. 2-8 °C).
  4. Oppnå fluorescerende fargede magnetiske mikrosfærer (6,5 μm diameter, polystyren med innebygd magnetitt) og perlekoblingssettet15 (hvis brukt, se materialtabellen). Kovalent kobling til mikrosfærene krever sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimid) og EDC (N-[3-dimetylaminopropyl]-N′-etylkarbodiimidhydroklorid).
    MERK: Magnetiske perlesett er tilgjengelige med noen av 500 unike fluorescerende koder, noe som gjør det mulig å identifisere og differensiere fra forskjellige perlesett16. Perler tilbys i lagerkonsentrasjoner på 2,5 × 106 perler / ml og 12,5 × 106 perler / ml. Oppbevar perlene beskyttet mot lys ved kjøleskapstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Ikke frys perleopphengene.
  5. Få positive og negative kontrollantistoffer og Brilliant Violet 421 (BV421)-merkede sekundære deteksjonsantistoffer. Oppbevar alle fluorescerende konjugerte molekyler beskyttet mot lys.
  6. Utfør alle koblingsreaksjonene i lavproteinbindingsrør og alle analysereaksjonene i lavproteinbindende, rundbunns, 96-brønns mikrotiterplater. Forsegl platene med engangs klebende folie eller plast 96-brønns mikroplatedeksler for analysens inkubasjonstrinn. Bruk en magnetplateseparator til å immobilisere perlene under analysevasktrinnene.
    MERK: Strømningsanalysesystemet med dobbel reporter har tre lasere: (1) en som identifiserer og kvantifiserer dråpesettspesifikk fluorescens (klassifiseringskanal); (2) en som oppdager og kvantifiserer den målspesifikke phycoerythrin (PE) fluorescensen (Reporter Channel 1; 532 nm eksitasjon, "oransje" 565-585 nm utslipp); og (3) en som oppdager og kvantifiserer den målspesifikke BV421-fluorescensen til en andre målanalytt (Reporter Channel 2; 405 nm eksitasjon, "blå" 421-441 nm utslipp).

2. Kobling av rhPD-1 til magnetiske perler

MERK: Proteinet som skal kobles må være fri for bovint serumalbumin (BSA), natriumazid, glycin, glyserol, tris (hydroksymetyl)aminometan (Tris) eller aminholdige tilsetningsstoffer og bør suspenderes i PBS ved pH 7,4. Et kommersielt koblingssett er tilgjengelig som inkluderer alle nødvendige reagenser og buffere beskrevet her (se materialfortegnelsen).

  1. Fjern alle koblingsreagensene fra kjøleskapet, og la dem likevekte til romtemperatur (RT, 18-22 °C) i 20-30 minutter.
  2. Resuspender stammikrosfærene ved kort virvel, sonikering eller rotering (15 minutter ved 15-30 o / min), i henhold til produktinformasjonsbladet.
  3. Overfør 1 × 106 magnetiske perler til et 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding (se materialtabellen).
  4. Vaskeperler med 100 μL aktiveringsbuffer15: 0,1 M NaH2PO4 (monobasisk), pH 6,2.
    MERK: Kobling kan også utføres ved hjelp av et forhåndskonfigurert koblingssett, som inkluderer 0,1 M 2-morfolinetansulfonsyre (MES), pH 6,0, som en alternativ aktiverings- og koblingsbuffer (se materialtabellen).
    1. Plasser røret som inneholder perlene i en magnetisk separator i 1-2 min.
      MERK: Alternativt kan kulene separeres ved mikrosentrifugering ved ≥8000 × g i 1-2 min.
    2. Aspirer supernatanten med en pipette fra magnetimmobiliserte eller pelleterte perler med røret fortsatt plassert i magnetseparatoren.
    3. Fjern mikrosentrifugerøret fra magneten, og tilsett 80 μL koblingsbuffer (se materialtabellen).
    4. Vortex reaksjonsrøret forsiktig, og sonicate i 20 s for å spre perlene.
  5. Aktiver perlene med sulfo-NHS og EDC.
    MERK: Stamløsningen av sulfo-NHS er 50 mg / ml oppløst i aktiveringsbuffer. Stamløsningen av EDC er også 50 mg / ml oppløst i aktiveringsbuffer. Både aktiveringsbufferen og fuktigheten i atmosfæren forårsaker EDC-nedbrytning. Det anbefales ikke å bruke lagret EDC-løsning. Lag akkurat nok fersk EDC-løsning før trinnet, og bruk den umiddelbart når løsningen er klar. Kast overflødig EDC-oppløsning.
    FORSIKTIG: EDC forårsaker alvorlig øyeirritasjon og er luftveiene og hudirriterende.
    1. Tilsett 10 μL sulfo-NHS til mikrofugerøret som inneholder de vasket og aktiverte perlene.
    2. Tilsett 10 μL EDC-stamløsning til mikrofugerøret som inneholder perlene og sulfo-NHS.
    3. Beskytt de lysfølsomme mikrosfærene mot lys, og roter på rotatoren i 20 minutter ved 15-30 o / min, ved RT (18-22 ° C). Alternativt kan røret forbli stasjonært under aktiveringstrinnet hvis det er forsiktig virvelløst for å omfordele perlene med 10 minutters intervaller.
  6. Vask overflødige koblingsreagenser av perlene.
    1. Plasser røret som inneholder de aktiverte perlene i en magnetisk separator i 1-2 minutter.
    2. Aspirer supernatanten med en pipette fra magnetimmobiliserte eller pelleterte perler med røret fortsatt plassert i magnetseparatoren.
    3. Fjern mikrosentrifugerøret fra magneten, og tilsett 100 μL aktiveringsbuffer.
    4. Virv reaksjonsrøret forsiktig for å spre perlene.
    5. Gjenta trinn 2.6.1-2.6.4 to ganger til for totalt tre vask. Ved slutten av vasken vil perlene bli suspendert i 100 μL aktiveringsbuffer ved en omtrentlig konsentrasjon på 10 × 106 perler / ml.
  7. Koble rhPD-1-peptidet til de aktiverte perlene.
    1. Tilsett 390 mikrol aktiveringsbuffer til røret som inneholder de aktiverte kulene for å bringe det totale dråpesuspensjonsvolumet opp til 490 μL.
    2. Tilsett 1 μg PD-1-peptid til den aktiverte dråpesuspensjonen ved å tilsette 10 μL PD-1 peptidoppløsning (1 mg/ml oppløst i PBS) til røret som inneholder de aktiverte kulene.
    3. Virvel kort mikrosentrifugerøret for jevnt å fordele PD-1 og aktiverte perler.
    4. Inkuber kulene med PD-1 i 2 timer i mørket ved RT (18-22 °C) med rotasjon (15-30 o / min).
  8. Vask kulene to ganger (2x) med Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).
    1. Plasser røret som inneholder de aktiverte perlene i en magnetisk separator i 1-2 minutter.
    2. Aspirer supernatanten med en pipette fra magnetimmobiliserte eller pelleterte perler med røret fortsatt plassert i magnetseparatoren.
    3. Fjern mikrosentrifugerøret fra magneten, og tilsett 100 μL aktiveringsbuffer.
    4. Virv reaksjonsrøret forsiktig for å spre perlene.
    5. Gjenta trinn 2.8.1-2.8.4 en ekstra gang for totalt to vasker. Ved slutten av vasken vil perlene bli suspendert i 100 μL aktiveringsbuffer i en konsentrasjon på 10 × 106 perler / ml.
      MERK: Assay/Wash-bufferen kan lages uten natriumazid (konserveringsmiddel) hvis bufferen ikke også brukes som lagringsmedium.
    6. Oppbevar de rhPD-1-koblede perlene i mørket i kjøleskapet ved 2-8 °C hvis de ikke brukes umiddelbart. Proteinkoblede perler er stabile i opptil 18 måneder.

3. Evaluering av vellykket rhPD-1-kobling til perlene

MERK: De rhPD-1-koblede mikrosfærene reageres med biotinylert rhPD-L1, hvorav sistnevnte detekteres ved inkubasjon med SAPE etterfulgt av en vurdering på strømningscytometeret. Dette verifiserer både vellykket PD-1-kobling til magnetkulene og også funksjonell interaksjon mellom rhPD-1- og rhPD-L1-proteinene.

  1. Lag en todelt seriell fortynningsserie av biotinylert rhPD-L1 i PBS-TBN (stamløsningen rhPD-L1 er 1 mg/ml). Det endelige rhPD-L1-konsentrasjonsområdet som skal testes er en 8 μg / ml løsning ned til en 313 pg / ml løsning. Lag 150 μL volum av hver rhPD-L1-fortynning: 50 μL for hver reaksjon og to reaksjoner per tilstand, pluss tilstrekkelig overskudd til å imøtekomme pipetteringstap.
    1. Merk rhPD-L1 fortynningsmikrofugerør som 8 μg / ml, 4 μg / ml, 2 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,25 μg / ml, 0,125 μg / ml, 0,063 μg / ml og 0,031 μg / ml. Et 0 μg / ml rør (kun PBS-TBN) fungerer som no-PD-L1-kontroll.
    2. Forspenning 150 μL PBS-TBN til alle merkede rhPD-L1 fortynningsrør.
      MERK: Den høyeste endelige rhPD-L1-konsentrasjonen som skal testes er 8 μg / ml, og rhPD-L1 vil bli fortynnet 1: 1 ved tilsetning til reaksjonsblandingen, slik at fortynningsrøret merket "8 μg / ml" refererer til den endelige konsentrasjonen og inneholder faktisk 16 μg / ml rhPD-L1. Etikettene på alle fortynningsrørene indikerer den endelige rhPD-L1-konsentrasjonen etter tilsetning til reaksjonen.
    3. Lag den høyeste konsentrasjonen rhPD-L1 fortynning (16 μg / ml faktisk). Dette er en to-trinns, 62,5 ganger fortynning av 1 mg/ml rhPD-L1 stamløsning (1000 μg/16 μg = 62,5).
      1. Kombiner 84 μL PBS-TBN med 16 μL rhPD-L1 stamløsning (1 mg/ml, dvs. 1000 μL) i et mikrosentrifugerør. Dette er en 6,25 ganger fortynning, og den resulterende konsentrasjonen er 160 μg / ml rhPD-L1.
      2. I røret merket "8 μg / ml" kombinerer du 270 μl PBS-TBN med 30 μL av rhPD-L1-fortynningen opprettet i forrige trinn (160 μg / ml). Dette er en 10 ganger fortynning, og den resulterende konsentrasjonen er faktisk 16 μg / ml. "8 μg / ml" røretiketten refererer til den endelige konsentrasjonen etter tilsetning til reaksjonen.
    4. Overfør 150 mikroliter av rhPD-L1-fortynningen opprettet i trinn 3.1.3 ("8 μg/ml") til "4 μg/ml"-røret, lukk mikrosentrifugerørhetten og virvel kort for å blande oppløsningen.
    5. Gjenta trinn 3.1.4 sekvensielt til rhPD-L1-fortynningsserien er fullført. Etter opprettelse skal alle rørene mellom "8 μg / ml" til "0,063 μg / ml", samt 0 μg / ml-kontrollen, inneholde 150 μL løsning, og det siste røret, "0,031 μg / ml", skal inneholde 300 μL oppløsning. Dette skaper et tilstrekkelig volum av hver fortynning til å teste 50 μL av hver biotinylert rhPD-L1-fortynning i dupliserte reaksjoner, med tilstrekkelig overskudd igjen til å imøtekomme pipetteringstap.
  2. Telle rhPD-1-koblede perler ved hjelp av et hemocytometer17.
  3. Fortynn lageret rhPD-1-koblede perler til 5 × 104 perler / ml, med et volum tilstrekkelig for 2,500 perler / 50 μL / reaksjon.
  4. Vortex 5 × 104 perler / ml rhPD-1-koblet perlesuspensjon og pipette 50 μL av suspensjonen i hver merket / kartlagt brønn på en 96-brønns rundbunns mikrotiterplate slik at det opprettes dupliserte brønner for hver rhPD-L1-fortynning som testes.
  5. Tilsett 50 μL av hvert biotinylerte rhPD-L1 fortynningsrør opprettet i trinn 3.1 til de aktuelle brønnene på mikrotiterplaten.
  6. Dekk mikrotiterplaten med en engangsfolie eller plastplateforsegler, og inkuber platen i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker (600 o / min).
  7. Vask overflødig biotinylert rhPD-L1 fra perlene.
    1. Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    2. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene i en vask eller beholder for biologisk farlig flytende avfall, etter behov. Bank forsiktig men raskt den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne den gjenværende supernatanten.
    3. Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren, og pipett 150 μL PBS-TBN inn i hver brønn.
    4. Plasser den uforseglede platen på magnetseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    5. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene i en vask eller beholder for biologisk farlig flytende avfall, etter behov. Bank forsiktig men raskt den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne den gjenværende supernatanten.
  8. Gjenta platevasketrinnene 3.7.3-3.7.5 to ganger for totalt tre vasker med 150 μL PBS-TBN hver. Forsikre deg om at det ikke er noen supernatant igjen i brønnene på slutten av det siste vasketrinnet. Arbeid jevnt for å forhindre tørking av de immobiliserte perlene på brønnbunnene.
  9. Legg til SAPE-deteksjonsreagens.
    1. Fortynn SAPE-stamløsningen i PBS-TBN til en arbeidskonsentrasjon på 6 μg/ml. Forbered et tilstrekkelig volum for SAPE-arbeidsløsningen slik at alle reaksjonsbrønnene kan motta 100 μL/brønn, med tilstrekkelig ekstra til å imøtekomme pipetteringstap.
    2. Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren.
    3. Tilsett 100 μL SAPE-arbeidsløsning i hver reaksjonsbrønn, og resuspender de vaskede perlene ved pipettering.
    4. Forsegle den 96-brønns mikrotiterplaten med en folie eller plastplateforsegler, og inkuber i 1 time i mørket ved RT (18-22 ° C) på en orbital shaker ved 600 o / min.
    5. Fjern mikrotiterplaten fra inkubatoren, overfør den til magnetplateseparatoren for å immobilisere perlene, fjern limplateforsegleren og vask perlene tre ganger med 150 μL PBS-TBN, som beskrevet i trinn 3.7.3-3.7.5.
    6. Etter å ha fjernet den endelige vasken, fjern platen fra magnetplateseparatoren, og resuspender perlene i 100 μL PBS-TBN per brønn.
  10. Analyser resultatene.
    1. Les platen på strømningsanalyseinstrumentet (se materialtabellen) for å bestemme median fluorescensintensitet (MFI) for hver reaksjon ved hjelp av følgende instrumentinnstillinger: aspirasjonsvolum = 50 μL; minimum antall perler = 100 perler; tidsavbruddsinnstilling = 40 s; gating = 7.000-17.000; driftsmodus = Single Reporter. Dupliserte brønner kjøres for hver tilstand, og de to MFI-utgangsverdiene for hver tilstand gjennomsnittes før ytterligere databeregning og grafisk fremstilling utføres.
      MERK: MFI-verdien for hver fortynning skal vise konsentrasjonsavhengig binding, noe som indikerer akseptabel rhPD-1-koblingseffektivitet til perlene og bekrefter god interaksjon mellom de rekombinante PD-1 / PD-L1-proteinene.

4. PD-L1 magnetisk perlebasert PD-1 / PD-L1 blokkeringsanalyse

MERK: Denne analysen vurderer blokkeringsaktiviteten til løselige mediatorer (f.eks. anti-PDL1-peptidantistoffer) på rekombinante PD1 / PD-L1-interaksjoner. Kort fortalt er biotinylert rhPD-L1 preinkubert med antistoffer generert hos kaniner etter forskjellige PDL1-Vaxx peptidinokulasjoner. RhPD-L1 + anti-PDL1-antistoffblandingen fanges deretter ved bruk av rhPD-1-koblede magnetiske perler, og rhPD-L1-bindingen til rhPD-1-koblede perler kvantifiseres ved tilsetning av streptapavidin-PE. PE-fluorescenssignalet korrelerer omvendt med blokkeringsaktiviteten til de testede anti-PDL1-antistoffene / hemmerne. Anti-PDL1-peptidantistoffbinding vurderes samtidig ved binding av en BV421-koblet antikanin (for anti-PDL1-peptidantistoffer) eller anti-humant (for kontrollantistoffer) sekundært antistoff og ved å evaluere BV421-fluorescensen i instrumentets andre kanal. Analysetrinnene er billedlig detaljerte i figur 1.

  1. Klargjør en todelt seriell fortynningsserie av testantistoffene, inkludert PDL1-Vaxx-induserte polyklonale antistoffkandidater, et negativt kontrollantistoff (trastuzumab, Herceptin, humanisert anti-HER2 monoklonalt antistoff) og et positivt kontrollantistoff (atezolizumab; humanisert anti-PDL1 IgG1 monoklonalt antistoff). Hver reaksjon vil bruke 25 μL av den tildelte antistofffortynningen, slik at volumene som vises er tilstrekkelige til å utføre hver reaksjon i dupliserte brønner per tilstand (dvs. 50 μL per tilstand), med noe overskudd igjen for å imøtekomme pipetteringstap.
    1. For hvert vaksineindusert anti-PDL1-peptidantistoff og kontrollantistoff, sørg for at området for de endelige antistoffkonsentrasjonene som testes er fra 1000 μg / ml ned til 8 μg / ml. Klargjør stamløsninger av alle antistoffene ved 2000 μg/ml.
    2. For hvert antistoff, merk fortynningsrørene som 1000 μg / ml, 500 μg / ml, 250 μg / ml, 125 μg / ml, 63 μg / ml, 31 μg / ml, 16 μg / ml og 8 μg / ml, og inkluder antistoffnavnet. For hvert antistoff, legg også til et "0 μg / ml" -rør, som vil være kjøretøy-bare (PBS-TBN) -kontroll.
      MERK: Når det tilsettes reaksjonsblandingen, vil antistoffkonsentrasjonen bli fortynnet 1:1. Antistofffortynningsrørene er merket som den endelige antistoffkonsentrasjonen etter tilsetning til reaksjonen og inneholder faktisk dobbelt så mye antistoff enn merket.
    3. Tilsett 75 μL PBS-TBN til alle antistofffortynningsrørene merket "500 μg / ml" og under, inkludert "0 μg / ml" kjøretøykontrollrør.
    4. For hvert antistoff, pipett 150 μL av 2000 mikrogram / ml stamoppløsning i det respektive røret merket "1000 mikrogram / ml". Dette vil bli brukt til å gjøre alle påfølgende fortynninger for hvert antistoff.
    5. For hvert antistoff lager du en komplett fortynningsserie ved å overføre 75 μl fra "1000 μg/ml"-røret til slangen med neste nedre fortynning i serien (dvs. "500 μg/ml"). Lukk det nylig ferdigstilte fortynningsrøret, virv det kort, og fortsett konstruksjonen av fortynningsserien ved å overføre 75 μL fra "500 μg/ml"-røret til "250 μg/ml"-røret. Gjenta dette mønsteret til den siste fortynningen, "8 μg/ml", er gjort for alle antistoffene.
      MERK: I den ferdige fortynningsserien for hvert antistoff skal det være et volum på 75 μL for alle tubene unntatt den laveste fortynningen, 8 μg/ml, som skal inneholde et volum på 150 μL. Hver reaksjon vil bruke 25 μL antistofffortynning, så disse volumene er tilstrekkelige til å utføre hver reaksjon i dupliserte brønner per tilstand (dvs. 50 μL per tilstand), med ekstra for å imøtekomme pipetteringstap.
  2. Plasser 25 μL av de fortynnede antistoffene i de angitte brønnene til en 96-brønns mikrotiterplate.
  3. Fortynn biotinylert rhPD-L1 til en arbeidskonsentrasjon på 4 μg / ml i PBS-TBN i et volum tilstrekkelig til å inkludere 25 μL i dupliserte brønner per tilstand (dvs. 50 μL per tilstand), med ekstra for å imøtekomme pipetteringstap.
    MERK: I dette arbeidet resulterte biotinylert rhPD-L1 ved 4 μg / ml i omtrent 50% av det maksimale MFI-signalet målt i den tidligere koblingsevalueringen og ble brukt til PD-1 / PD-L1-blokkadeanalysen.
  4. Tilsett 25 μL biotinylert rhPD-L1 (4 μg / ml) til hver reaksjonsbrønn, dekk mikrotiterplaten med en folie eller plastlimforsegling, og inkuber ved RT (18-22 ° C) i 1 time med risting på en orbital platerister ved 600 o / min.
  5. Fortynn de rhPD-1-koblede perlene til 50 000 perler/ml, med et tilstrekkelig volum for 50 μL/brønn (2 500 perler/brønn) pluss ekstra for å imøtekomme pipetteringstap.
  6. Fjern den 96-brønns mikrotiterreaksjonsplaten fra shakeren, og fjern den selvklebende plateforseglingen.
  7. Tilsett 50 μL av rhPD-1-koblet perleblanding til hver brønn.
  8. Forsegle platen, og rug i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker ved 600 o / min.
  9. Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
  10. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant.
  11. Vask overflødig reaksjonsreagenser fra perlene.
    1. Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren, og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Plasser mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    3. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant.
  12. Gjenta platevasketrinnene 4.11.1-4.11.3 to ganger, for totalt tre vasker med PBS-TBN. Forsikre deg om at SAPE-reagenset er tilberedt (nedenfor) før du fjerner den endelige (tredje) vaskeoppløsningen.
  13. Legg til SAPE-deteksjonsreagenset.
    1. Fortynn stamløsningens SAPE-lager til en arbeidskonsentrasjon på 6 μg/ml i PBS-TBN; lage et tilstrekkelig volum for 100 μL/brønn, pluss ekstra for å imøtekomme pipetteringstap.
    2. Tilsett 100 μL / brønn av SAPE-arbeidsløsning i hver reaksjonsbrønn, og resuspender perlene ved pipettering.
    3. Forsegle platen, og rug i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker ved 600 o / min.
  14. Dekanter overflødig SAPE fra reaksjonen.
    1. Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    2. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne supernatanten som inneholder overflødig SAPE.
  15. Vask overflødig SAPE av perlene.
    1. Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateholderen.
    2. Tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn for å resuspendere perlene.
    3. Plasser mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    4. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant.
  16. Utfør ytterligere to vasketrinn med PBS-TBN for totalt tre vasker ved å gjenta trinn 4.15.1-4.15.4. Få BV421-congugated sekundær deteksjonsantistoffer forberedt (neste trinn) før du fjerner den endelige (tredje) vaskeoppløsningen.
  17. Legg til BV421-congugated sekundære antistoffer.
    1. Fortynnet BV421-congugated anti-human IgG (for påvisning av humaniserte kontrollantistoffer) og BV421-congugated anti-rabbit IgG (for påvisning av PDL1-Vaxx-induserte polyklonale antistoffer) (se materialtabellen) 1:400 i vaske-/analysebuffer ved volumer som er tilstrekkelig til å bruke 100 μL/brønn av hver, med ekstra for å imøtekomme pipetteringstap.
    2. Tilsett 100 μL fortynnet BV421-konjugert anti-human IgG eller BV421-konjugert antikanin IgG til passende brønner.
    3. Forsegle platen, og rug i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker ved 600 o / min.
  18. Dekanter de overskytende BV421-konjugerte sekundære antistoffene fra perlene.
    1. Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    2. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne supernatanten som inneholder overflødige BV421-konjugerte sekundære antistoffer.
  19. Vask overflødig BV421-konjugerte sekundære antistoffer fra perlene.
    1. Tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn for å resuspendere perlene.
    2. Plasser mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene.
    3. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant.
  20. Utfør ytterligere tre vasketrinn med PBS-TBN for totalt fire vasker ved å gjenta trinn 4.19.1-4.19.3.
  21. Etter å ha fjernet den siste (fjerde) vaskebufferen, fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren, og resuspender perler i 100 μL PBS-TBN / brønn med en pipettor.
  22. Analyser resultatene.
    1. Les platen på dual-reporter-strømningsanalysesystemet for å bestemme MFI for hver reaksjon ved hjelp av følgende instrumentinnstillinger: aspirasjonsvolum = 50 μL; minimum antall perler = 100 perler; tidsavbruddsinnstilling = 40 s; gating: 7.000-17.000; driftsmodus = Dual Reporter.
    2. Med dual-reporter-systemet, sørg for at Reporter Channel 1 måler den oransje PE-fluorescensen (mengde rhPD-L1 festet til rhPD-1-konjugerte perler) og Reporter Channel 2 måler den blå BV421-fluorescensen (mengde festet blokkerende antistoff bundet til rhPD-L1).
    3. Kjør dupliserte brønner for hver tilstand, og beregn gjennomsnittet av de to MFI-utgangsverdiene for hver tilstand før du utfører ytterligere databeregning og grafisk fremstilling.
    4. Standardiser MFI-verdien for hver prøve til den negative kontrollen, og beregne prosentandelen av hemming for hver prøve:
      Inhibisjon% = (100 × [Negativ kontroll MFI - Sample MFI]) / negativ kontroll MFI
      MERK: De negative kontroll-MFI-verdiene (ingen hemming) er de høyeste verdiene; det bundne PD-L1-signalet MFI er 100%, og inhiberingen av rhPD-L1-binding til rhPD-1 er definert som 0%.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av blokadeanalysen med dobbel reporter PD-1/PD-L1. Biotinylert rekombinant humant PD-L1 (rhPD-L1) pre-inkuberes med utvalgte PDL1-Vaxx-induserte anti-PDL1-antistoffer før de kombineres med rhPD-1-koblede magnetiske perler for å tillate dannelse av PD-1/PD-L1-kontrollpunktkompleks. Kompleks rhPD-L1 oppdages deretter og markeres ved tilsetning av streptapavidinkoblet phycoerythrin (SAPE, oransje fluorofor). Antistoffer mot PDL1-Vaxx-epitoper retter seg mot rhPD-L1 som har kompleksert til rhPD-1 forhåndskoblet til magnetkulene, og de belyses ved hjelp av et strålende fiolett 421-konjugert sekundært antistoff (BV421, blå fluorofor). Både biotinylert rhPD-L1 som er kompleksert til PD-1 (PE-signal) og anti-PDL1-antistoffer som gjenkjenner og binder rhPD-L1 (BV421-signalet) analyseres samtidig ved hjelp av et cytometrisk instrument med dobbel reporterflyt som undersøker prøver for begge fluoroforene i to separate reporterkanaler. Utgangsverdiene for hver prøve er median fluorescensintensitet for hver fluorofor. Inhiberingen av PD1/PD-L1-kompleksdannelse ved forskjellige PDL1-Vaxx-induserte antistoffer ekstrapoleres deretter ved å sammenligne de eksperimentelle signalene med de som genereres ved hjelp av et negativt monoklonalt antistoff som ikke binder rhPD-L1 (0% inhibering). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Analysen var i stand til nøyaktig å kvantifisere inhiberingen av PD-1 / PD-L1-interaksjonen av fire unike polyklonale antistoffer, generert mot rhPD-L1-vaksinepeptidene, som blir undersøkt som potensielle kreftterapeutiske midler. Skjemaet for denne analysen er gitt i figur 1. Mengden biotinylert rhPD-L1 som bundet til rhPD-1-konjugerte perler og hemming av denne bindingen av de fire PLD1-Vaxx-induserte antistoffkandidatene ble målt i Reporter Channel 1 ved hjelp av et streptapavidin-PE-deteksjonsreagens som direkte bandt rhPD-L1 (figur 2).

Alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer blokkerte rhPD-L1-interaksjonen med PD-1 som hadde blitt immobilisert på mikrosfærer i varierende grad. Prosentandelen av hemming av de forskjellige anti-PDL1-peptidantistoffene varierte fra 48 % til 74 % ved den maksimalt testede konsentrasjonen på 1000 μg/ml. Det positive kontrollmonoklonale antistoffet atezolizumab oppnådde 92 % blokade av PD-1/PD-L1-interaksjonen ved maksimal testet konsentrasjon14 på 4 μg/ml (figur 2). Alle de eksperimentelle PDL1-Vaxx-antistoffene viste konsentrasjonsavhengig hemming av rhPD-L1-binding til rhPD-1-konjugerte perler sammenlignet med trastuzumab, det negative kontrollantistoffet som ikke var forventet å interagere med PD-1/PD-L1-systemet.

Figure 2
Figur 2: Blokade av rhPD-L1-interaksjon med rhPD-1 koblet til magnetiske perler med anti-PDL1-peptidantistoffer, som vist ved en ny fluorescerende perlebasert immunoassay. Rekombinant human PD-1 ble koblet til magnetiske mikrosfærer, og kulene ble deretter inkubert med biotinylert rhPD-L1 som hadde blitt pre-inkubert med forskjellige anti-PDL1-peptidantistoffer. Et streptavidin-phycoerythrin-deteksjonsreagens ble brukt til å binde biotinet og dermed vurdere den relative mengden rhPD-L1 som var tilgjengelig for binding til PD-1. Polyklonale antistoffer hevet hos kaniner mot PDL1 peptidvaksiner (anti-PDL1 [36], anti-PDL1 [50], anti-PDL1 [95] og anti-PDL1 [130]) ble testet for hemmende aktivitet og viste 48% -74% blokkering av rekombinante PD-1 / PD-L1 interaksjoner ved den høyeste konsentrasjonen testet. Atezolizumab (et annet anti-PDL1 monoklonalt antistoff) ble brukt som positiv kontroll. Det ikke-relaterte kommersielle monoklonale antistoffet trastuzumab (anti-HER2) ble brukt som negativ kontroll. Denne figuren er tilpasset fra Guo et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenlignende binding av forskjellige PDL1-Vaxx-induserte antistoffer mot rhPD-L1 kompleksert til rhPD1-belagte magnetiske perler. Brilliant violet 421-konjugert sekundærdeteksjonsantistoff ble brukt til å sammenligne bindingen av forskjellige kaninpolyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer til rhPD-L1 via rhPD-1-belagte perler. BV421 blått fluorescenssignal ble tatt opp i Reporter Channel 2 av dual-reporter-instrumentet; Dette signalet korrelerer med den relative bindingseffektiviteten til de eksperimentelle anti-PDL1-peptidantistoffene. Trastezumab (anti-HER2), et monoklonalt antistoff som retter seg mot et annet sjekkpunkt enn PD-1/PD-L1, ble brukt som negativ kontroll. MFI representerer gjennomsnittlig dråpemedian fluorescensintensitet, som ble målt i dupliserte reaksjonsbrønner per tilstand. Denne figuren er tilpasset fra Guo et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De relative evnene til de fire eksperimentelle PDL1-Vaxx-induserte kandidatantistoffene til å binde rhPD-L1 ble sammenlignet ved hjelp av et separat deteksjonssystem (BV421-konjugert antikanin IgG) som ble evaluert på instrumentets andre reporterkanal. Disse resultatene indikerte at alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer bundet til rhPD-L1 på en konsentrasjonsavhengig måte14 (figur 3). Anti-PDL1 (130) antistoffet viste det høyeste rhPDL1-bindingssignalet til de fire PDL1-Vaxx-induserte antistoffkandidatene.

Discussion

Hensikten med sjekkpunktrelatert kreftimmunterapi er å forstyrre samspillet mellom sjekkpunktproteiner og deres viktige ligander i tumoroverlevelse og progresjon2. Denne forskningsgruppen utvikler aktivt nye PD-1- og PD-L1-vaksiner som fremkaller en antistoffrespons som retter seg mot og avbryter PD-1/PD-L1-kontrollpunktet 3,8,13,14. Tidligere ble to variasjoner av enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA) utført for å evaluere effekten av anti-PDL1-peptidantistoffer på hemming av den rekombinante PD1 / PD-L1-interaksjonen14. (1) I den første varianten ble rhPD-L1 belagt på en mikrotiterplate, og deretter ble platen inkubert med fortynnede anti-PDL1-vaksinekandidatinduserte antistoffer. Inhiberingen av den rekombinante PD-1 / PD-L1-interaksjonen av antistoffene ble deretter evaluert ved å tilsette biotinylert rhPD-1 og kvantifisere bindingen til det immobiliserte rhPD-L1 ved bruk av et streptapavidin-pepperrotperoksidasekonjugat og et kolorimetrisk substrat. Vi definerte dette som den direkte blokadeanalysen. (2) I den andre varianten ble PD-1 belagt på mikrotiterplaten. Biotinylert rhPD-L1 ble pre-inkubert med hvert av de anti-PLD1 kandidatinduserte polyklonale antistoffene i separate reaksjonsrør. RhPDL1 / anti-PDL1-blandingene ble deretter tilsatt til platebrønnene som inneholdt immobilisert rhPD-1 og fikk lov til å reagere. Enhver rhPDL1 som reagerte med den immobiliserte rhPD-1 i nærvær av de potensielt blokkerende PDL1-Vaxx-induserte antistoffene ble detektert med påfølgende streptapavidin-HRP og kolorimetrisk substratinkubasjon. Vi definerte dette som omvendt blokadeanalyse.

Den omvendte blokaden av den rekombinante PD-1/PD-L1-interaksjonen med anti-PDL1-peptidantistoffer viste hemming av signalet (dvs. PD-1/PD-L1-blokade) på en antistoffkonsentrasjonsavhengig måte14, mens den direkte blokadetilnærmingen ikke ga konsistente resultater (ikke vist). Den perlebaserte dual-reporter-blokadeanalysen ble utviklet for å verifisere ELISA-resultatene og for å undersøke blokaden av PD-1 / PD-L1-interaksjonen i en væskefase, noe som eliminerer potensielle steriske hindringer / bindende epitoptilgjengelighetsproblemer forbundet med immobilisering av rekombinante proteiner på brønnbunner. Mikrosfæreanalysen var direkte korrelert med ELISA-blokkeringsresultatene ved bruk av omvendt blokadeanalyse (figur 2). I tillegg kan fluorescensbaserte immunoassays gi forbedret analysefølsomhet og et utvidet dynamisk område sammenlignet med kolorimetriske ELISAs18, og videre tillater den multipleksede perlebaserte analysen samtidig ytelse av to uavhengige immunoassays i en enkelt reaksjon. Sulfo-NHS og EDC brukt for kovalent kobling av mikrosfærene til rhPD-1 kan ha ført til ytelsesforskjellene sett mellom direkte blokade og reverserte blokadeanalyser og de observerte forskjellene i følsomhet mellom ELISA og Luminex perlebaserte rekombinante PD-1 / PD-L1 interaksjonsanalyser. Videre kjemisk og molekylær undersøkelse er berettiget til å studere mulige mekanismer som er ansvarlige for disse forskjellene.

Både ELISA14 og de perlebaserte analysene viser at PDL1-Vaxx-induserte anti-PDL1-antistoffer kan hemme PD1/PD-L1 sjekkpunktkompleksdannelse. Den peptidbaserte PDL1-Vaxx induserer vellykket anti-PDL1-antistoffer som kan blokkere PD-1 / PD-L1-interaksjonen. Denne tilnærmingen kan tjene som en ny terapeutisk strategi for behandling av kreft, som støttet av prekliniske dyreforsøk 3,13,14. Planlagte kliniske studier vil bestemme effekten av PDL1-Vaxx for sjekkpunktimmunterapi og sykdomskontroll hos kreftpasienter.

Disclosures

Pravin T.P. Kaumaya er konsulent for Imugene, Ltd.

Acknowledgments

Forfatterne takker Sherry Dunbar PhD, MBA of Luminex Corporation (Austin, TX) for forskningsstøtte og Matthew Silverman PhD of Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for vitenskapelig og skriftlig assistanse. Dette arbeidet ble støttet av priser til Pravin T. P. Kaumaya fra National Institutes of Health (R21 CA13508 og R01 CA84356) og Imugene Ltd, Sydney, Australia (OSU 900600, GR110567 og GR124326).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 Millipore/Sigma S3139
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 MilliporeSigma  M2933
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 77149
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: Luminex Corp.  (Austin, TX) 40-50016
EDC, 10 mg 
sNHS solution, 250 µL
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) Luminex Corp.  (Austin, TX) INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Low protein-binding round bottom 96-well plate ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 07-200-761
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)  Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0269-01
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0288-01
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp.  (Austin, TX) MC-1**** (varies by bead label)
Protein LoBind microcentrifuge tubes ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 022431081
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)
Biotinylated recombinant human PDL1  Sino Biological (Wayne, PA) 10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 709-675-149
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 711-675-152
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) Acro Biosystems (Newark, DE) PD1-H5256 
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) Agilent (Santa Clara, CA) PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
  2. Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).
  3. Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).
  4. Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
  5. Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
  6. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  7. Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
  8. Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
  9. Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
  10. Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
  11. Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
  12. Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
  13. Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).
  14. Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  18. Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019).

Tags

Magnetisk fluorescerende perle Dual-Reporter Flow Analysis PDL1-Vaxx peptidvaksine antistoffblokade PD-1 / PD-L1 interaksjon sjekkpunktreseptorer monoklonale antistoffer kliniske studier kreftpasienter kreftimmunterapi terapeutiske strategier B-celle peptidepitop PDL1 kreftvaksine preklinisk testing immunogene antistoffer tumorbelastning overlevelsesrater virkningsmekanismer magnetisk perlebasert analyse
Magnetisk fluorescerende perlebasert dual-reporter strømningsanalyse av PDL1-vaxx peptidvaksineindusert antistoffblokade av PD-1 / PD-L1-interaksjonen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. … More

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. T. P. Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction. J. Vis. Exp. (197), e65467, doi:10.3791/65467 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter