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Cancer Research

PDL1/PD-L1 इंटरैक्शन के PDL1-Vaxx पेप्टाइड वैक्सीन-प्रेरित एंटीबॉडी नाकाबंदी का चुंबकीय फ्लोरोसेंट मनका-आधारित दोहरी-रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65467
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

चेकपॉइंट इनहिबिटर कैंसर के खिलाफ लड़ाई के लिए उपचार विकसित करने में महत्वपूर्ण लक्ष्य हैं। यह रिपोर्ट एक उपन्यास PDL1 पेप्टाइड-आधारित कैंसर वैक्सीन, PDL1-Vaxx का परिचय देती है, जो पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी उत्पादन को बेअसर करने के लिए प्रेरित करती है जो PD-1/PDL1 जटिल गठन को अवरुद्ध करती है। यह काम भी इस गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट मनका आधारित परख के विकास और परीक्षण का विवरण.

Abstract

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ चेकपॉइंट रिसेप्टर्स (पीडी -1, पीडी-एल 1, और सीटीएलए -4) के निषेध ने कैंसर रोगियों के इलाज के लिए नैदानिक परीक्षणों में बहुत लाभ दिखाया है और आधुनिक कैंसर इम्यूनोथेरेपी में एक मुख्य आधार दृष्टिकोण बन गया है। हालांकि, रोगियों का केवल एक सबसेट चेकपॉइंट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इम्यूनोथेरेपी का जवाब देता है। इसलिए, कैंसर के खिलाफ नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करना जरूरी है। एक उपन्यास बी-सेल पेप्टाइड एपिटोप पीडीएल 1 (क्रमादेशित मौत लिगैंड 1) कैंसर वैक्सीन विकसित की गई है, जिसमें जीपीएसएल लिंकर के माध्यम से एमवीएफ पेप्टाइड ("होनहार" टी-सेल खसरा वायरस संलयन प्रोटीन) से जुड़े अमीनो एसिड 130-147 हैं। प्रीक्लिनिकल परीक्षण ने संकेत दिया है कि यह PDL1 वैक्सीन (PDL1-Vaxx) प्रभावी रूप से जानवरों में अत्यधिक इम्युनोजेनिक एंटीबॉडी को उत्तेजित करता है। PDL1-Vaxx के साथ प्रतिरक्षित पशु विभिन्न पशु कैंसर मॉडल में ट्यूमर के बोझ को कम करते हैं और जीवित रहने की दर बढ़ाते हैं। कार्रवाई के तंत्र से संकेत मिलता है कि वैक्सीन-प्राप्त एंटीबॉडी ट्यूमर सेल प्रसार को रोकते हैं, एपोप्टोसिस को प्रेरित करते हैं, और पीडी -1 / पीडी-एल 1 इंटरैक्शन को अवरुद्ध करते हैं। यह पांडुलिपि एक चुंबकीय मनका-आधारित परख पेश करती है जो PDL1/PD-L1 इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक दोहरी-रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करती है और PDL1-Vaxx के खिलाफ उठाए गए एंटी-PDL1 एंटीबॉडी द्वारा इसकी नाकाबंदी करती है।

Introduction

प्रतिरक्षा प्रणाली की टी-कोशिकाओं, बी-कोशिकाओं और इंट्रासेल्युलर चौकियों में, सिग्नलिंग मार्ग प्रतिरक्षा गतिविधियों को नियंत्रित करते हैं। कुछ कैंसर कोशिकाएं चेकपॉइंट लक्ष्यों को उत्तेजित करके प्रतिरक्षा हमले से खुद को बचाती हैं, जो प्रतिरक्षा समारोह को रोकती हैं और नियोप्लास्टिक अस्तित्व और प्रसार को बढ़ावा देती हैं। चेकपॉइंट निषेध द्वारा ऑन्कोलॉजिक इम्यूनोथेरेपी सिग्नलिंग चौकियों को लक्षित करने और अवरुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करता है और इस प्रकार, प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2,3 के एंटी-नियोप्लास्टिक कार्यों को बहाल करता है। अत्यधिक प्रभावी कैंसर विरोधी उपचारों में वर्तमान में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी निवोलुमाब शामिल हैं, जो प्रोग्राम्ड डेथ प्रोटीन 1 (पीडी-1)4 को लक्षित करता है, और एटेज़ोलिज़ुमाब, जो प्रोग्राम्ड डेथ लिगैंड 1 (पीडी-एल 1)5 को लक्षित करता है। इस दृष्टिकोण ने कैंसर रोगियों के इलाज में बड़ी नैदानिक सफलता दिखाई है। हालांकि, वर्तमान चेकपॉइंट निषेध रणनीतियों की नैदानिक उपयोगिता प्रतिकूल घटनाओं और उपचार प्रतिरोध द्वारा कम की जाती है, विशेष रूप से एकल-एजेंट थेरेपी6 में। इम्यूनोथेरेपी और कम विषाक्तता के साथ अधिक प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों का एक संयोजन कैंसर उपचार 1,3,6 में तत्काल आवश्यक है.

पिछले 30 वर्षों में, डॉ. कौमाया की प्रयोगशाला ने कैंसर चिकित्सा के लिए पेप्टाइड कैंसर के टीके और पेप्टाइड मिमिक-संबंधित एजेंट विकसित किए हैं, जिनमें से कुछ चल रहे नैदानिक परीक्षणों में हैं 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . उदाहरण के लिए, एचईआर -2 संयोजन इम्यूनोथेरेपी के साथ बी-वैक्सक्स ने नैदानिक परीक्षणों12 में मेटास्टैटिक और / या आवर्तक ठोस ट्यूमर के खिलाफ रोगी लाभ दिखाया है। प्रयोगशाला के नवीनतम कैंसर टीके PD1-Vaxx 2,13 और PDL1-Vaxx14 हैं, जिन्होंने प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में विशेष रूप से संयोजन उपचार में बहुत लाभ दिखाया है। PD1-Vaxx ने अमेरिका और ऑस्ट्रेलिया में खुराक-वृद्धि नैदानिक परीक्षण पूरा कर लिया है। पीडी1-वैक्सएक्स को मई, 2023 में शुरू होने वाले चरण 1बी परीक्षण में एटेज़ोलिज़ुमाब के साथ जोड़ा जाएगा। यह रिपोर्ट PD-1/PD-L1 इंटरैक्शन को ब्लॉक करने के लिए PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी की क्षमता के मूल्यांकन पर केंद्रित है।

PDL1-Vaxx कैंसर वैक्सीन PD-L1 अमीनो एसिड 130-147 के साथ एक उपन्यास बी-सेल पेप्टाइड एपिटोप वैक्सीन है जो GPSL पेप्टाइड लिंकर के माध्यम से होनहार टी-सेल खसरा वायरस फ्यूजन (MVF) पेप्टाइड से जुड़ा हुआ है। प्रीक्लिनिकल अध्ययनों से पता चला है कि PDL1-Vaxx विभिन्न पशु मॉडल में एंटी-कैंसर एंटीबॉडी उत्पादन को उत्तेजित करने में अत्यधिक इम्युनोजेनिक है, अस्तित्व को बढ़ाता है, और ट्यूमर के बोझको कम करता है 14. PD-L1 पेप्टाइड के खिलाफ उत्पन्न ये एंटीबॉडी PD1/PD-L1 इंटरैक्शन को सफलतापूर्वक ब्लॉक कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एंटी-नियोप्लास्टिक गतिविधि होती है। यह रिपोर्ट एक परख का परिचय देती है जो PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी द्वारा PD1/PD-L1 जटिल गठन की नाकाबंदी का विश्लेषण करती है, जिसमें एक प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण पर दोहरी-रिपोर्टर रीडआउट के साथ चुंबकीय मनका-आधारित प्रारूप का उपयोग किया जाता है।

Protocol

1. प्रायोगिक तैयारी

नोट: इस चरण में उल्लिखित सभी अभिकर्मकों/उपकरणों का विवरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है।

  1. पुनः संयोजक मानव पीडी -1 (आरएचपीडी -1; पॉलीहिस्टिडाइन-टैग किए गए) प्राप्त करें। उपयोग करने से पहले बाँझ-फ़िल्टर्ड फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.4 के साथ lyophilized rhPD1 का पुनर्गठन करें।
  2. बायोटिनिलेटेड पुनः संयोजक मानव पीडी-एल 1 (आरएचपीडी-एल 1) प्राप्त करें। उपयोग करने से पहले बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ lyophilized rhPD-L1 का पुनर्गठन करें।
  3. स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित आर-फाइकोएरिथ्रिन डिटेक्शन रिएजेंट (एसएपीई) प्राप्त करें। रेफ्रिजरेटर तापमान (यानी, 2-8 डिग्री सेल्सियस) पर प्रकाश से सुरक्षित सभी एसएपीई समाधानों को स्टोर करें।
  4. फ्लोरोसेंटली रंगे चुंबकीय microspheres (6.5 माइक्रोन व्यास, एम्बेडेड मैग्नेटाइट के साथ polystyrene) और मनका युग्मन किट15 (यदि इस्तेमाल किया, सामग्री की तालिका) प्राप्त करें. माइक्रोसेफर्स के लिए सहसंयोजक युग्मन के लिए सल्फो-एनएचएस (सल्फो-एन-हाइड्रोसुकिनिमाइड) और ईडीसी (एन- [3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल] -एन-एथिलकार्बोडाइमाइड हाइड्रोक्लोराइड) की आवश्यकता होती है।
    नोट: चुंबकीय मनका सेट 500 अद्वितीय फ्लोरोसेंट टैग में से किसी के साथ उपलब्ध हैं, जो पहचान और विभिन्न मनका सेट16 से भेदभाव के लिए अनुमति देता है. मोतियों को 2.5 × 106 मोती/एमएल और 12.5 × 106 मनके/एमएल के स्टॉक सांद्रता पर पेश किया जाता है। रेफ्रिजरेटर तापमान (यानी, 2-8 डिग्री सेल्सियस) पर प्रकाश से सुरक्षित मोतियों की दुकान. मनका निलंबन फ्रीज न करें।
  5. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी और ब्रिलियंट वायलेट 421 (BV421) -लेबल माध्यमिक पहचान एंटीबॉडी प्राप्त करें। प्रकाश से संरक्षित सभी फ्लोरोसेंट-संयुग्मित अणुओं को स्टोर करें।
  6. कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूबों में सभी युग्मन प्रतिक्रियाओं और कम प्रोटीन बाध्यकारी, दौर नीचे, 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों में सभी परख प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन. परख इनक्यूबेशन चरणों के लिए डिस्पोजेबल चिपकने वाला पन्नी या प्लास्टिक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट कवर के साथ प्लेटों को सील करें। परख धोने के चरणों के दौरान मोतियों को स्थिर करने के लिए एक चुंबकीय प्लेट विभाजक का उपयोग करें।
    नोट: दोहरे रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण प्रणाली में तीन लेजर हैं: (1) एक जो मनका सेट-विशिष्ट प्रतिदीप्ति (वर्गीकरण चैनल) की पहचान करता है और मात्रा निर्धारित करता है; (2) एक जो लक्ष्य-विशिष्ट फ़ाइकोएरिथ्रिन (पीई) प्रतिदीप्ति (रिपोर्टर चैनल 1; 532 एनएम उत्तेजना, "नारंगी" 565-585 एनएम उत्सर्जन) का पता लगाता है और मात्रा निर्धारित करता है; और (3) एक जो दूसरे लक्ष्य विश्लेषण (रिपोर्टर चैनल 2; 405 एनएम उत्तेजना, "नीला" 421-441 एनएम उत्सर्जन) के लक्ष्य-विशिष्ट बीवी 421 प्रतिदीप्ति का पता लगाता है और मात्रा निर्धारित करता है।

2. चुंबकीय मोतियों के लिए rhPD-1 युग्मन

नोट: युग्मित होने वाला प्रोटीन गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), सोडियम एज़ाइड, ग्लाइसिन, ग्लिसरॉल, ट्रिस (हाइड्रॉक्सी-मिथाइल) एमिनोमेथेन (ट्रिस), या अमाइन युक्त योजक से मुक्त होना चाहिए और पीएच 7.4 पर पीबीएस में निलंबित होना चाहिए। एक वाणिज्यिक युग्मन किट उपलब्ध है जिसमें यहां वर्णित सभी आवश्यक अभिकर्मक और बफ़र्स शामिल हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. रेफ्रिजरेटर से सभी युग्मन अभिकर्मकों निकालें, और उन्हें 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी, 18-22 डिग्री सेल्सियस) को संतुलित करने की अनुमति दें।
  2. उत्पाद सूचना पत्र के अनुसार, संक्षेप में भंवर, sonicating, या घूर्णन (15-30 rpm पर 15 मिनट) द्वारा शेयर microspheres resuspension.
  3. 1 × 106 चुंबकीय मोतियों को 1.5 एमएल कम-प्रोटीन बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  4. सक्रियण बफर15 के 100 माइक्रोन के साथ मोती धोएं: 0.1 एम एनएएच2पीओ4 (मोनोबैसिक), पीएच 6.2।
    नोट: युग्मन को पूर्व-कॉन्फ़िगर युग्मन किट का उपयोग करके भी किया जा सकता है, जिसमें वैकल्पिक सक्रियण और युग्मन बफर के रूप में 0.1 एम 2-मॉर्फोलिनोएथेनेसल्फोनिक एसिड (एमईएस), पीएच 6.0 शामिल है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. 1-2 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक में मोती युक्त ट्यूब रखें.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, मोती को 1-2 मिनट के लिए ≥8,000 × ग्राम पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जा सकता है।
    2. चुंबक-स्थिर या पेलेट मोतियों से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट ट्यूब अभी भी चुंबकीय विभाजक में तैनात है।
    3. चुंबक से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब निकालें, और युग्मन बफर के 80 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    4. भंवर धीरे प्रतिक्रिया ट्यूब, और मोतियों तितर-बितर करने के लिए 20 एस के लिए sonicate.
  5. सल्फो-एनएचएस और ईडीसी के साथ मोतियों को सक्रिय करें।
    नोट: सल्फो-एनएचएस का स्टॉक समाधान सक्रियण बफर में भंग 50 मिलीग्राम / EDC का स्टॉक समाधान भी सक्रियण बफर में भंग 50 mg/mL है। सक्रियण बफर और वातावरण में नमी दोनों ईडीसी क्षरण का कारण बनते हैं। संग्रहीत ईडीसी समाधान का उपयोग करना उचित नहीं है। चरण से पहले पर्याप्त ताजा ईडीसी समाधान बनाएं, और समाधान तैयार होने पर तुरंत इसका उपयोग करें। अतिरिक्त EDC समाधान त्यागें।
    सावधानी: ईडीसी गंभीर आंखों की जलन का कारण बनता है और एक श्वसन पथ और त्वचा में जलन होती है।
    1. धोया और सक्रिय मोती युक्त microfuge ट्यूब के लिए सल्फो-एनएचएस के 10 माइक्रोन जोड़ें.
    2. मोतियों और सल्फो-एनएचएस युक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ईडीसी स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    3. प्रकाश संवेदनशील microspheres प्रकाश से सुरक्षित रखें, और आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर 15-30 rpm पर 20 मिनट के लिए रोटेटर पर बारी बारी से. वैकल्पिक रूप से, ट्यूब सक्रियण कदम के दौरान स्थिर रह सकते हैं अगर यह धीरे 10 मिनट के अंतराल पर मोतियों को पुनर्वितरित करने के लिए भंवर है.
  6. मोतियों से अतिरिक्त युग्मन अभिकर्मकों धो लें।
    1. 1-2 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक में सक्रिय मोती युक्त ट्यूब रखें.
    2. चुंबक-स्थिर या गोली मोतियों से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट ट्यूब अभी भी चुंबकीय विभाजक में तैनात है।
    3. चुंबक से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब निकालें, और सक्रियण बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    4. भंवर प्रतिक्रिया ट्यूब धीरे मोती तितर-बितर करने के लिए.
    5. दोहराएँ कदम 2.6.1-2.6.4 तीन washes की कुल के लिए दो अतिरिक्त बार. धोने के अंत में, मोती 10 × 106 मोती/एमएल की अनुमानित एकाग्रता पर सक्रियण बफर के 100 माइक्रोन में निलंबित कर दिया जाएगा।
  7. सक्रिय मोतियों के लिए rhPD-1 पेप्टाइड जोड़ो।
    1. सक्रियण बफर के 390 माइक्रोन को सक्रिय मोतियों वाले ट्यूब में जोड़ें ताकि कुल मनका निलंबन मात्रा 490 माइक्रोन तक आ सके।
    2. सक्रिय मोतियों वाले ट्यूब में पीडी-1 पेप्टाइड समाधान (पीबीएस में भंग 1 मिलीग्राम/एमएल) के 10 माइक्रोन जोड़कर सक्रिय मनका निलंबन में पीडी-1 पेप्टाइड का 1 माइक्रोग्राम जोड़ें।
    3. संक्षेप में पीडी -1 और सक्रिय मोतियों को समान रूप से वितरित करने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब भंवर।
    4. रोटेशन (15-30 आरपीएम) के साथ आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 2 घंटे के लिए पीडी -1 के साथ मोती सेते हैं।
  8. परख/वॉश बफर (पीबीएस-टीबीएन: 1x पीबीएस, पीएच 7.4 + 0.1% बीएसए + 0.05% ट्वीन-20 + 0.05% एनएएन315) का उपयोग करके मोतियों को दो बार (2x) धोएं।
    1. 1-2 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक में सक्रिय मोती युक्त ट्यूब रखें.
    2. चुंबक-स्थिर या पेलेट मोतियों से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट ट्यूब अभी भी चुंबकीय विभाजक में तैनात है।
    3. चुंबक से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब निकालें, और सक्रियण बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    4. भंवर प्रतिक्रिया ट्यूब धीरे मोती तितर-बितर करने के लिए.
    5. चरण 2.8.1-2.8.4 को कुल दो धुलाई के लिए एक अतिरिक्त समय दोहराएं। धोने के अंत में, मोतियों को 10 × 106 मोती/एमएल की एकाग्रता पर सक्रियण बफर के 100 माइक्रोन में निलंबित कर दिया जाएगा।
      नोट: परख/वॉश बफर सोडियम एज़ाइड (संरक्षक) के बिना बनाया जा सकता है यदि बफर का उपयोग भंडारण माध्यम के रूप में भी नहीं किया जाता है।
    6. RHPD-1-युग्मित मोतियों को अंधेरे में रेफ्रिजरेटर में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है। प्रोटीन-युग्मित मोती 18 महीने तक स्थिर रहते हैं।

3. मोतियों के लिए सफल rhPD-1 युग्मन का मूल्यांकन

नोट: rhPD-1-युग्मित microspheres biotinylated rhPD-L1, जिनमें से उत्तरार्द्ध प्रवाह साइटोमीटर पर एक आकलन के बाद SAPE के साथ इनक्यूबेशन द्वारा पता लगाया जाता है के साथ प्रतिक्रिया कर रहे हैं. यह चुंबकीय मोतियों के लिए सफल पीडी -1 युग्मन और आरएचडी-1 और आरएचडी-एल 1 प्रोटीन के बीच कार्यात्मक बातचीत दोनों की पुष्टि करता है।

  1. पीबीएस-टीबीएन में बायोटिनिलेटेड आरएचडी-एल 1 की दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला बनाएं (स्टॉक आरएचपीडी-एल 1 समाधान 1 मिलीग्राम / एमएल है)। परीक्षण की जाने वाली अंतिम rhPD-L1 एकाग्रता सीमा एक 8 μg/mL समाधान है जो 313 pg/mL समाधान तक नीचे है। प्रत्येक rhPD-L1 कमजोर पड़ने के 150 माइक्रोन वॉल्यूम बनाएं: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 50 माइक्रोन और प्रति स्थिति दो प्रतिक्रियाएं, साथ ही पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त।
    1. rhPD-L1 कमजोर पड़ने वाले माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.125 μg/mL, 0.063 μg/mL, और 0.031 μg/mL के रूप में लेबल करें। एक 0 μg/mL ट्यूब (केवल PBS-TBN) नो-PD-L1 नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
    2. सभी लेबल rhPD-L1 कमजोर पड़ने ट्यूबों के लिए पीबीएस-टीबीएन के प्री-लोड 150 माइक्रोन।
      नोट: परीक्षण की जाने वाली उच्चतम अंतिम rhPD-L1 सांद्रता 8 μg/mL है, और rhPD-L1 को प्रतिक्रिया मिश्रण के अतिरिक्त 1:1 पतला किया जाएगा, इसलिए "8 μg/mL" लेबल वाली कमजोर पड़ने वाली ट्यूब अंतिम एकाग्रता को संदर्भित करती है और वास्तव में इसमें 16 μg/mL rhPD-L1 होता है। सभी कमजोर पड़ने ट्यूबों पर लेबल प्रतिक्रिया के अलावा अंतिम rhPD-L1 एकाग्रता का संकेत मिलता है.
    3. उच्चतम एकाग्रता rhPD-L1 कमजोर पड़ने (16 μg/mL वास्तविक) बनाएँ. यह 1 mg/mL rhPD-L1 स्टॉक समाधान (1,000 μg/16 μg = 62.5) का दो-चरण, 62.5-गुना कमजोर पड़ने वाला है।
      1. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में आरएचडी-एल 1 स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल, यानी, 1,000 माइक्रोन) के 16 माइक्रोन के साथ पीबीएस-टीबीएन के 84 माइक्रोन को मिलाएं। यह 6.25 गुना कमजोर पड़ने वाला है, और परिणामी एकाग्रता 160 μg/mL rhPD-L1 है।
      2. "8 μg/mL" लेबल वाली ट्यूब में, पिछले चरण (160 μg/mL) में बनाए गए rhPD-L1 कमजोर पड़ने के 30 माइक्रोन के साथ PBS-TBN के 270 μL को मिलाएं। यह 10 गुना कमजोर पड़ने वाला है, और परिणामी एकाग्रता वास्तव में 16 माइक्रोग्राम / "8 μg/mL" ट्यूब लेबल प्रतिक्रिया के अलावा अपनी अंतिम एकाग्रता को संदर्भित करता है.
    4. चरण 3.1.3 ("8 माइक्रोग्राम/एमएल") में बनाए गए rhPD-L1 कमजोर पड़ने के 150 माइक्रोन को "4 μg/mL" ट्यूब में स्थानांतरित करें, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप को बंद करें, और समाधान को मिश्रण करने के लिए संक्षेप में भंवर।
    5. दोहराएँ चरण 3.1.4 क्रमिक रूप से जब तक rhPD-L1 कमजोर पड़ने श्रृंखला पूरा हो गया है. निर्माण के बाद, "8 μg/mL" से "0.063 μg/mL" के साथ-साथ 0 μg/mL नियंत्रण के बीच सभी ट्यूबों में 150 μL घोल होना चाहिए, और अंतिम ट्यूब, "0.031 μg/mL", में 300 μL समाधान होना चाहिए। यह डुप्लिकेट प्रतिक्रियाओं में प्रत्येक बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोन का परीक्षण करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने की पर्याप्त मात्रा बनाता है, जिसमें पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त शेष है।
  2. एक hemocytometer17 का उपयोग rhPD-1 युग्मित मोती गिनती.
  3. स्टॉक rhPD-1-युग्मित मोतियों को 5 × 104 मोती/एमएल तक पतला करें, जिसमें 2,500 मोती/50 माइक्रोन/प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त मात्रा हो।
  4. भंवर 5 × 104 मोती/एमएल rhPD-1-युग्मित मनका निलंबन, और पिपेट 50 μL निलंबन के प्रत्येक लेबल / मैप किए गए 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे माइक्रोटिटर प्लेट के अच्छी तरह से मैप किया गया ताकि प्रत्येक rhPD-L1 कमजोर पड़ने के लिए बनाए गए डुप्लिकेट कुएं हों जिनका परीक्षण किया जा रहा है।
  5. माइक्रोटिटर प्लेट पर उपयुक्त कुओं के लिए चरण 3.1 में बनाई गई प्रत्येक बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 कमजोर पड़ने वाली ट्यूब के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  6. एक डिस्पोजेबल पन्नी या प्लास्टिक चिपकने वाला प्लेट मुहर के साथ माइक्रोटिटर प्लेट को कवर करें, और एक कक्षीय प्रकार के बरतन (600 आरपीएम) पर आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  7. मोतियों से अतिरिक्त biotinylated rhPD-L1 धो लें.
    1. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिन के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन से चुंबकीय प्लेट विभाजक के लिए सील प्लेट स्थानांतरण.
    2. चिपकने वाली प्लेट सीलर को सावधानी से हटा दें, पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सुपरनेटेंट को सिंक या बायोहाज़र्ड तरल अपशिष्ट कंटेनर में डंप करें, जैसा उपयुक्त हो। धीरे लेकिन तेज शेष सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए शोषक कागज ऊतक के एक कुशन पर उल्टे प्लेट नल.
    3. चुंबकीय प्लेट विभाजक से माइक्रोटिटर प्लेट निकालें, और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-टीबीएन के पिपेट 150 माइक्रोन निकालें।
    4. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर बिना बंद प्लेट रखें।
    5. पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सुपरनेटेंट को सिंक या बायोहाज़र्ड तरल अपशिष्ट कंटेनर में डंप करें, जैसा उपयुक्त हो। धीरे लेकिन तेज शेष सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए शोषक कागज ऊतक के एक कुशन पर उल्टे प्लेट नल.
  8. पीबीएस-टीबीएन के 150 माइक्रोन के साथ कुल तीन वॉश के लिए प्लेट धोने के चरणों को 3.7.3-3.7.5 दो बार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि कोई सतह पर तैरनेवाला अंतिम धोने कदम के अंत में कुओं में रहता है. अच्छी तरह से बोतलों पर स्थिर मोतियों के सूखने को रोकने के लिए लगातार काम करें।
  9. SAPE डिटेक्शन अभिकर्मक जोड़ें।
    1. पीबीएस-टीबीएन में एसएपीई स्टॉक समाधान को 6 माइक्रोग्राम/एमएल की कार्यशील एकाग्रता में पतला करें। एक पर्याप्त SAPE काम कर समाधान मात्रा तैयार इतना है कि सभी प्रतिक्रिया कुओं 100 μL/अच्छी तरह से प्राप्त कर सकते हैं, पर्याप्त अतिरिक्त pipetting नुकसान को समायोजित करने के साथ.
    2. चुंबकीय प्लेट विभाजक से microtiter प्लेट निकालें.
    3. प्रत्येक प्रतिक्रिया में अच्छी तरह से SAPE काम समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें, और pipetting द्वारा धोया मोती resuspension.
    4. एक पन्नी या प्लास्टिक चिपकने वाला प्लेट मुहर के साथ 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट सील, और 600 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    5. इनक्यूबेटर से माइक्रोटिटर प्लेट निकालें, मोतियों को स्थिर करने के लिए इसे चुंबकीय प्लेट विभाजक में स्थानांतरित करें, चिपकने वाली प्लेट सीलर को हटा दें, और 150 μL पीबीएस-टीबीएन के साथ मोतियों को तीन बार धोएं, जैसा कि चरणों में वर्णित है 3.7.3-3.7.5.
    6. अंतिम धोने को हटाने के बाद, चुंबकीय प्लेट विभाजक से प्लेट को हटा दें, और अच्छी तरह से पीबीएस-टीबीएन के 100 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  10. परिणामों का विश्लेषण करें।
    1. निम्नलिखित साधन सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक प्रतिक्रिया की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करने के लिए प्रवाह विश्लेषण उपकरण ( सामग्री की तालिकादेखें) पर प्लेट पढ़ें: आकांक्षा मात्रा = 50 माइक्रोन; न्यूनतम मनका गिनती = 100 मोती; टाइमआउट सेटिंग = 40 सेकंड; गेटिंग = 7,000-17,000; ऑपरेटिंग मोड = सिंगल रिपोर्टर। डुप्लिकेट कुओं प्रत्येक हालत के लिए चलाए जाते हैं, और प्रत्येक हालत के लिए दो उत्पादन MFI मूल्यों आगे डेटा गणना और रेखांकन प्रदर्शन करने से पहले औसत रहे हैं.
      नोट: प्रत्येक कमजोर पड़ने के एमएफआई मूल्य को एकाग्रता-निर्भर बाध्यकारी दिखाना चाहिए, जो मोतियों को स्वीकार्य rhPD-1 युग्मन दक्षता का संकेत देता है और पुनः संयोजक PD-1/PD-L1 प्रोटीन की अच्छी बातचीत की पुष्टि करता है।

4. PD-L1 चुंबकीय मनका-आधारित PD-1/PD-L1 अवरुद्ध परख

नोट: यह परख पुनः संयोजक PD1/PD-L1 इंटरैक्शन पर घुलनशील मध्यस्थों (जैसे, एंटी-PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी) की अवरुद्ध गतिविधि का आकलन करता है। संक्षेप में, बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 को विभिन्न PDL1-Vaxx पेप्टाइड इनोक्यूलेशन के बाद खरगोशों में उत्पन्न एंटीबॉडी के साथ प्रीइनक्यूबेट किया जाता है। rhPD-L1 + एंटी-PDL1 एंटीबॉडी मिश्रण को तब rhPD-1-युग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके कैप्चर किया जाता है, और rhPD-1-युग्मित मोतियों के लिए RHPD-L1 बाध्यकारी स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के अतिरिक्त द्वारा मात्रा निर्धारित की जाती है। पीई प्रतिदीप्ति संकेत परीक्षण एंटी-पीडीएल 1 एंटीबॉडी / अवरोधकों की अवरुद्ध गतिविधि के साथ विपरीत रूप से संबंधित है। एंटी-PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी बाइंडिंग का मूल्यांकन एक साथ BV421-युग्मित एंटी-खरगोश (एंटी-PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी के लिए) या एंटी-ह्यूमन (कंट्रोल एंटीबॉडी के लिए) सेकेंडरी एंटीबॉडी के बंधन और BV421 प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन करके किया जाता है। परख कदम चित्रा 1 में चित्रात्मक रूप से विस्तृत हैं।

  1. परीक्षण एंटीबॉडी की दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें, जिसमें PDL1-Vaxx-प्रेरित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी उम्मीदवार, एक नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी (trastuzumab, Herceptin, मानवकृत एंटी-HER2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी), और एक सकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी (atezolizumab; मानवकृत एंटी-PDL1 IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी)। प्रत्येक प्रतिक्रिया निर्दिष्ट एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 25 माइक्रोन का उपयोग करेगी, इसलिए दिखाए गए वॉल्यूम प्रति स्थिति (यानी, 50 माइक्रोन प्रति स्थिति) डुप्लिकेट कुओं में प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए पर्याप्त हैं, जिसमें पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए कुछ अतिरिक्त शेष हैं।
    1. प्रत्येक वैक्सीन-प्रेरित एंटी-PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी और नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए, सुनिश्चित करें कि परीक्षण किए गए अंतिम एंटीबॉडी सांद्रता की सीमा 1,000 μg/mL से 8 μg/mL तक है। 2,000 μg/mL पर सभी एंटीबॉडी के स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, कमजोर पड़ने वाली ट्यूबों को 1,000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 63 μg/mL, 31 μg/mL, 16 μg/mL, और 8 μg/mL के रूप में लेबल करें, और एंटीबॉडी नाम शामिल करें। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, एक "0 μg/mL" ट्यूब भी जोड़ें, जो वाहन-केवल (PBS-TBN) नियंत्रण होगा।
      नोट: जब प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है, तो एंटीबॉडी एकाग्रता 1: 1 पतला हो जाएगा। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने ट्यूबों को प्रतिक्रिया के अलावा अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता के रूप में लेबल किया जाता है और वास्तव में लेबल की तुलना में एंटीबॉडी की मात्रा दोगुनी होती है।
    3. "500 माइक्रोग्राम/एमएल" लेबल वाले सभी एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले ट्यूबों में पीबीएस-टीबीएन के 75 माइक्रोन जोड़ें और नीचे, "0 माइक्रोग्राम/एमएल" वाहन-केवल नियंत्रण ट्यूबों सहित।
    4. प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, 2,000 μg/mL स्टॉक समाधान के पिपेट 150 μL को संबंधित ट्यूब में "1,000 μg/mL" लेबल किया जाता है। इसका उपयोग प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए बाद के सभी कमजोर पड़ने के लिए किया जाएगा।
    5. प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, श्रृंखला में अगले निचले कमजोर पड़ने (यानी, "500 माइक्रोग्राम/एमएल") के साथ ट्यूब में "1,000 माइक्रोग्राम/एमएल" ट्यूब से 75 माइक्रोन को पिपेट-स्थानांतरित करके एक पूर्ण कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला बनाएं। नई पूरी हुई कमजोर पड़ने वाली ट्यूब को बंद करें, इसे संक्षेप में भंवर दें, और "500 माइक्रोग्राम/एमएल" ट्यूब से "250 माइक्रोग्राम/एमएल" ट्यूब में 75 माइक्रोन स्थानांतरित करके कमजोर पड़ने की श्रृंखला का निर्माण जारी रखें। अंतिम कमजोर पड़ने तक इस पैटर्न को दोहराएं, "8 माइक्रोग्राम / एमएल", सभी एंटीबॉडी के लिए बनाया गया है।
      नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए पूर्ण कमजोर पड़ने की श्रृंखला में, सबसे कम कमजोर पड़ने, 8 माइक्रोन / एमएल को छोड़कर सभी ट्यूबों के लिए 75 माइक्रोन वॉल्यूम होना चाहिए, जिसमें 150 माइक्रोन की मात्रा होनी चाहिए। प्रत्येक प्रतिक्रिया एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 25 माइक्रोन का उपयोग करेगी, इसलिए ये वॉल्यूम प्रति स्थिति (यानी, 50 माइक्रोन प्रति स्थिति) डुप्लिकेट कुओं में प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए पर्याप्त हैं, अतिरिक्त पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए।
  2. पतला एंटीबॉडी के 25 माइक्रोन को 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के नामित कुओं में रखें।
  3. पीबीएस-टीबीएन में 4 माइक्रोग्राम/एमएल की कार्यशील एकाग्रता के लिए बायोटिनिलेटेड आरएचपीडी-एल 1 को पतला करें, जिसमें प्रति स्थिति डुप्लिकेट कुओं में 25 माइक्रोन शामिल करने के लिए पर्याप्त मात्रा में (यानी, 50 माइक्रोन प्रति स्थिति), पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त के साथ।
    नोट: इस काम में, 4 μg/mL पर बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 के परिणामस्वरूप पहले युग्मन मूल्यांकन में मापा गया अधिकतम MFI सिग्नल का लगभग 50% था और इसका उपयोग PD-1/PD-L1 नाकाबंदी विश्लेषण के लिए किया गया था।
  4. प्रत्येक प्रतिक्रिया में बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 (4 μg/mL) के 25 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें, माइक्रोटिटर प्लेट को पन्नी या प्लास्टिक चिपकने वाली सील के साथ कवर करें, और 600 आरपीएम पर एक कक्षीय प्लेट शेकर पर झटकों के साथ 1 घंटे के लिए आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट करें।
  5. rhPD-1-युग्मित मोतियों को 50,000 मोती/एमएल तक पतला करें, जिसमें 50 μL/अच्छी तरह से (2,500 मनके/कुएं) के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ और पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त हो।
  6. शेकर से 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर रिएक्शन प्लेट निकालें, और चिपकने वाली प्लेट सील को हटा दें।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए rhPD-1 युग्मित मनका मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें.
  8. प्लेट को सील करें, और 600 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिन के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन से चुंबकीय प्लेट विभाजक के लिए सील प्लेट स्थानांतरण.
  10. चिपकने वाली प्लेट सीलर को सावधानी से हटा दें, पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सुपरनेटेंट को डंप करें। धीरे अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए शोषक कागज ऊतक के एक कुशन पर उल्टे प्लेट नल.
  11. मोतियों से अतिरिक्त प्रतिक्रिया अभिकर्मकों धो लें.
    1. चुंबकीय प्लेट विभाजक से माइक्रोटिटर प्लेट निकालें, और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-टीबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें।
    2. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर माइक्रोटिटर प्लेट रखें।
    3. पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सुपरनेटेंट को डंप करें। धीरे अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए शोषक कागज ऊतक के एक कुशन पर उल्टे प्लेट नल.
  12. पीबीएस-टीबीएन के साथ कुल तीन वॉश के लिए प्लेट धोने के चरणों 4.11.1-4.11.3 को दो बार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि अंतिम (तीसरे) धोने के समाधान को हटाने से पहले SAPE अभिकर्मक (नीचे) तैयार किया गया है।
  13. SAPE डिटेक्शन अभिकर्मक जोड़ें।
    1. स्टॉक SAPE स्टॉक समाधान को PBS-TBN में 6 μg/mL कार्यशील एकाग्रता में पतला करें; 100 μL/कुएं के लिए पर्याप्त मात्रा बनाएं, साथ ही पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया में अच्छी तरह से एसएपीई काम समाधान के 100 माइक्रोन / अच्छी तरह से जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    3. प्लेट को सील करें, और 600 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  14. प्रतिक्रिया से अतिरिक्त SAPE को छानना।
    1. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिन के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन से चुंबकीय प्लेट विभाजक के लिए सील प्लेट स्थानांतरण.
    2. चिपकने वाली प्लेट सीलर को सावधानी से हटा दें, पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सतह पर तैरनेवाला डंप करें। धीरे शोषक कागज ऊतक की एक तकिया पर उलटा थाली नल अतिरिक्त SAPE युक्त सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए.
  15. मोतियों से अतिरिक्त SAPE धो लें।
    1. चुंबकीय प्लेट धारक से माइक्रोटिटर प्लेट निकालें।
    2. मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-टीबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें।
    3. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर माइक्रोटिटर प्लेट रखें।
    4. पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सतह पर तैरनेवाला डंप करें। धीरे अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए शोषक कागज ऊतक के एक कुशन पर उल्टे प्लेट नल.
  16. चरण 4.15.1-4.15.4 दोहराकर कुल तीन washes के लिए PBS-TBN के साथ दो अतिरिक्त धोने कदम प्रदर्शन करें. अंतिम (तीसरे) वॉश समाधान को हटाने से पहले BV421-congugated माध्यमिक पहचान एंटीबॉडी तैयार (अगला चरण) प्राप्त करें।
  17. BV421-congugated माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें.
    1. पतला BV421-congugated एंटी-ह्यूमन IgG (मानवकृत नियंत्रण एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए) और BV421-congugated एंटी-खरगोश IgG (PDL1-Vaxx-प्रेरित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए) ( सामग्री की तालिका देखें) 1:400 वॉश/परख बफर में प्रत्येक के 100 μL/कुएं का उपयोग करने के लिए पर्याप्त मात्रा में, पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त के साथ।
    2. उपयुक्त कुओं में पतला BV421-संयुग्मित विरोधी मानव IgG या BV421-संयुग्मित विरोधी खरगोश IgG के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    3. प्लेट को सील करें, और 600 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर आरटी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  18. मोतियों से अतिरिक्त BV421-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी को छानना।
    1. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिन के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन से चुंबकीय प्लेट विभाजक के लिए सील प्लेट स्थानांतरण.
    2. चिपकने वाली प्लेट सीलर को सावधानी से हटा दें, पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सतह पर तैरनेवाला डंप करें। धीरे शोषक कागज ऊतक की एक तकिया पर उलटा थाली नल अतिरिक्त BV421 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए.
  19. मोतियों से अतिरिक्त BV421 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी धो लें.
    1. मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-टीबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें।
    2. मोतियों को स्थिर करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर माइक्रोटिटर प्लेट रखें।
    3. पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं, और प्लेट को उल्टा करें और सतह पर तैरनेवाला डंप करें। धीरे अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए शोषक कागज ऊतक के एक कुशन पर उल्टे प्लेट नल.
  20. चरण 4.19.1-4.19.3 दोहराकर कुल चार washes के लिए PBS-TBN के साथ तीन अतिरिक्त धोने कदम प्रदर्शन करें.
  21. अंतिम (चौथा) वॉश बफर को हटाने के बाद, चुंबकीय प्लेट विभाजक से माइक्रोटिटर प्लेट को हटा दें, और एक पाइपेटर के साथ 100 माइक्रोन पीबीएस-टीबीएन/अच्छी तरह से मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  22. परिणामों का विश्लेषण करें।
    1. निम्नलिखित साधन सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक प्रतिक्रिया के एमएफआई को निर्धारित करने के लिए दोहरे रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण प्रणाली पर प्लेट पढ़ें: आकांक्षा मात्रा = 50 माइक्रोन; न्यूनतम मनका गिनती = 100 मोती; टाइमआउट सेटिंग = 40 सेकंड; गेटिंग: 7,000-17,000; ऑपरेटिंग मोड = दोहरी रिपोर्टर।
    2. दोहरी रिपोर्टर प्रणाली के साथ, सुनिश्चित करें कि रिपोर्टर चैनल 1 नारंगी पीई प्रतिदीप्ति (rhPD-1-संयुग्मित मोतियों से जुड़ी rhPD-L1 की मात्रा) को मापता है और रिपोर्टर चैनल 2 नीले BV421 प्रतिदीप्ति (rhPD-L1 से बंधे संलग्न अवरुद्ध एंटीबॉडी की मात्रा) को मापता है।
    3. प्रत्येक शर्त के लिए डुप्लिकेट कुओं चलाएँ, और आगे डेटा गणना और रेखांकन प्रदर्शन करने से पहले प्रत्येक हालत के लिए दो उत्पादन MFI मूल्यों औसत.
    4. प्रत्येक नमूने के एमएफआई मूल्य को नकारात्मक नियंत्रण में मानकीकृत करें, और प्रत्येक नमूने के लिए निषेध के प्रतिशत की गणना करें:
      निषेध% = (100 × [नकारात्मक नियंत्रण एमएफआई - नमूना एमएफआई])/नकारात्मक नियंत्रण एमएफआई
      नोट: नकारात्मक नियंत्रण एमएफआई मान (कोई निषेध नहीं) उच्चतम मान हैं; बाध्य PD-L1 सिग्नल MFI 100% है, और rhPD-1 के लिए बाध्यकारी rhPD-L1 के निषेध को 0% के रूप में परिभाषित किया गया है।

Figure 1
चित्र 1: दोहरे रिपोर्टर PD-1/PD-L1 नाकाबंदी परख का योजनाबद्ध। बायोटिनिलेटेड पुनः संयोजक मानव पीडी-एल 1 (आरएचडी-एल 1) पीडी -1 / पीडी-एल 1 चेकपॉइंट जटिल गठन की अनुमति देने के लिए आरएचडी-1-युग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ संयोजन करने से पहले चयनित पीडीएल 1-वैक्सएक्स-प्रेरित एंटी-पीडीएल 1 एंटीबॉडी के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किया गया है। जटिल rhPD-L1 तो पता लगाया है और streptavidin युग्मित phycoerythrin (SAPE, नारंगी फ्लोरोफोर) के अलावा द्वारा चिह्नित. PDL1-Vaxx एपिटोप्स के खिलाफ एंटीबॉडी rhPD-L1 को लक्षित करते हैं जो चुंबकीय मोतियों के लिए पूर्व-युग्मित rhPD-1 के लिए जटिल है, और वे एक ब्रिलियंट वायलेट 421-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (BV421, ब्लू फ्लोरोफोर) का उपयोग करके प्रकाशित होते हैं। दोनों बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 जो PD-1 (PE सिग्नल) और एंटी-PDL1 एंटीबॉडी के लिए जटिल हैं जो rhPD-L1 (BV421 सिग्नल) को पहचानते हैं और बांधते हैं, एक दोहरे रिपोर्टर फ्लो साइटोमेट्रिक इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके समवर्ती विश्लेषण किया जाता है जो नमूनों से पूछताछ करता है दो अलग-अलग रिपोर्टर चैनलों में दोनों फ्लोरोफोरस। प्रत्येक नमूने के लिए आउटपुट मान प्रत्येक फ्लोरोफोर की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता हैं। विभिन्न PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी द्वारा PD1/PD-L1 जटिल गठन के निषेध को तब एक नकारात्मक नियंत्रण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके उत्पन्न प्रयोगात्मक संकेतों की तुलना करके एक्सट्रपलेशन किया जाता है जो rhPD-L1 (0% निषेध) को बांधता नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

परख चार अद्वितीय पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा पीडी-1 / पीडी-एल 1 इंटरैक्शन के निषेध को ठीक से निर्धारित करने में सक्षम था, जो आरएचपीडी-एल 1 वैक्सीन पेप्टाइड्स के खिलाफ उत्पन्न होता है, जिसे संभावित कैंसर चिकित्सीय एजेंटों के रूप में खोजा जा रहा है। इस परख का योजनाबद्ध चित्रा 1 में प्रदान की जाती है. बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 की मात्रा जो rhPD-1-संयुग्मित मोतियों से बंधी है और चार PLD1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी उम्मीदवारों द्वारा इस बंधन के निषेध को रिपोर्टर चैनल 1 में एक स्ट्रेप्टाविडिन-पीई डिटेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करके मापा गया था जो सीधे rhPD-L1 (चित्रा 2) को बाध्य करता है।

सभी चार पॉलीक्लोनल एंटी-PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी ने PD-1 के साथ rhPD-L1 इंटरैक्शन को अवरुद्ध कर दिया था जिसे माइक्रोसेफर्स पर चर विस्तार तक स्थिर किया गया था। विभिन्न एंटी-पीडीएल 1 पेप्टाइड एंटीबॉडी के निषेध का प्रतिशत 1,000 μg/mL की अधिकतम परीक्षण एकाग्रता पर 48% से 74% तक था। सकारात्मक नियंत्रण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एटेज़ोलिज़ुमाब ने पीडी-1/पीडी-एल1 इंटरैक्शन की 92% नाकाबंदी को अधिकतम परीक्षण की गई एकाग्रता14 के 4 माइक्रोग्राम/एमएल(चित्रा 2)पर हासिल किया। सभी प्रयोगात्मक PDL1-Vaxx एंटीबॉडी ने trastuzumab की तुलना में rhPD-1 संयुग्मित मोतियों के लिए RHPD-L1 बाध्यकारी की एकाग्रता-निर्भर निषेध दिखाया, नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी जिसे PD-1/PD-L1 प्रणाली के साथ बातचीत करने की उम्मीद नहीं थी।

Figure 2
चित्रा 2: एंटी-पीडीएल 1-पेप्टाइड एंटीबॉडी द्वारा चुंबकीय मोतियों के साथ युग्मित आरएचडी-1 के साथ आरएचडी-एल 1 इंटरैक्शन की नाकाबंदी, जैसा कि एक नए फ्लोरोसेंट मनका-आधारित इम्यूनोसे द्वारा दिखाया गया है। पुनः संयोजक मानव पीडी -1 को चुंबकीय माइक्रोसेफर्स के साथ जोड़ा गया था, और मोतियों को तब बायोटिनिलेटेड आरएचपीडी-एल 1 के साथ इनक्यूबेट किया गया था जिसे विभिन्न एंटी-पीडीएल 1-पेप्टाइड एंटीबॉडी के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किया गया था। बायोटिन को बांधने के लिए एक स्ट्रेप्टाविडिन-फाइकोएरिथ्रिन डिटेक्शन अभिकर्मक का उपयोग किया गया था और इस प्रकार, पीडी-1 को बांधने के लिए उपलब्ध आरएचडी-एल 1 की सापेक्ष मात्रा का आकलन किया गया था। पीडीएल 1 पेप्टाइड टीकों (एंटी-पीडीएल 1 [36], एंटी-पीडीएल 1 [50], एंटी-पीडीएल 1 [95], और एंटी-पीडीएल 1 [130]) के खिलाफ खरगोशों में उठाए गए पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का निरोधात्मक गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया था और परीक्षण की गई उच्चतम एकाग्रता पर पुनः संयोजक पीडी -1 / पीडी-एल 1 इंटरैक्शन के 48% -74% नाकाबंदी को दिखाया गया था। एटेज़ोलिज़ुमाब (एक अलग एंटी-पीडीएल 1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। असंबंधित वाणिज्यिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी trastuzumab (एंटी-HER2) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। यह आंकड़ा गुओ एट अल 14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: rhPD1-लेपित चुंबकीय मोतियों के लिए जटिल rhPD-L1 के लिए विभिन्न PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी का तुलनात्मक बंधन। शानदार वायलेट 421-संयुग्मित माध्यमिक पहचान एंटीबॉडी का उपयोग विभिन्न खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-पीडीएल 1-पेप्टाइड एंटीबॉडी के बंधन की तुलना आरएचडी-एल 1 के माध्यम से आरएचडी-एल 1 से करने के लिए किया गया था। BV421 नीले प्रतिदीप्ति संकेत दोहरे रिपोर्टर साधन के रिपोर्टर चैनल 2 में दर्ज किया गया था; यह संकेत प्रयोगात्मक एंटी-पीडीएल 1-पेप्टाइड एंटीबॉडी की सापेक्ष बाध्यकारी दक्षता से संबंधित है। Trastezumab (एंटी-HER2), एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जो PD-1/PD-L1 की तुलना में एक अलग चेकपॉइंट को लक्षित करता है, का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। एमएफआई औसत मनका औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे प्रति स्थिति डुप्लिकेट प्रतिक्रिया कुओं में मापा गया था। यह आंकड़ा गुओ एट अल 14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

rhPD-L1 को बांधने के लिए चार प्रयोगात्मक PDL1-Vaxx-प्रेरित उम्मीदवार एंटीबॉडी की सापेक्ष क्षमताओं की तुलना एक अलग पहचान प्रणाली (BV421-संयुग्मित एंटी-खरगोश IgG) का उपयोग करके की गई थी जिसका मूल्यांकन उपकरण के दूसरे रिपोर्टर चैनल पर किया गया था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सभी चार पॉलीक्लोनल एंटी-पीडीएल 1-पेप्टाइड एंटीबॉडी एकाग्रता-निर्भर तरीके से आरएचडी-एल 1 से बंधे हैं14 (चित्रा 3)। एंटी-PDL1(130) एंटीबॉडी ने चार PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी उम्मीदवारों के उच्चतम rhPDL1 बाध्यकारी संकेत दिखाए।

Discussion

चेकपॉइंट से संबंधित कैंसर इम्यूनोथेरेपी का उद्देश्य चेकपॉइंट प्रोटीन और ट्यूमर के अस्तित्व और प्रगति2 में उनके महत्वपूर्ण लिगेंड के बीच बातचीत को बाधित करना है। यह शोध समूह सक्रिय रूप से उपन्यास पीडी -1 और पीडी-एल 1 टीके विकसित कर रहा है जो एक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्राप्त करता है जो पीडी -1 / पीडी-एल 1 चेकपॉइंट 3,8,13,14 को लक्षित और बाधित करता है। इससे पहले, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के दो रूपों पुनः संयोजक PD1/PD-L1 बातचीत14 के निषेध पर विरोधी PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया. (1) पहले संस्करण में, rhPD-L1 को एक माइक्रोटिटर प्लेट पर लेपित किया गया था, और फिर प्लेट को पतला एंटी-PDL1 वैक्सीन उम्मीदवार-प्रेरित एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एंटीबॉडी द्वारा पुनः संयोजक PD-1/PD-L1 इंटरैक्शन के निषेध का मूल्यांकन तब बायोटिनिलेटेड rhPD-1 को जोड़कर और एक स्ट्रेप्टाविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज संयुग्म और एक वर्णमिति सब्सट्रेट का उपयोग करके स्थिर rhPD-L1 के लिए बाध्यकारी की मात्रा निर्धारित करके किया गया था। हमने इसे प्रत्यक्ष नाकाबंदी परख के रूप में परिभाषित किया। (2) दूसरे संस्करण में, पीडी -1 को माइक्रोटिटर प्लेट पर लेपित किया गया था। बायोटिनिलेटेड rhPD-L1 को अलग-अलग प्रतिक्रिया ट्यूबों में एंटी-PLD1 उम्मीदवार-प्रेरित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी में से प्रत्येक के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किया गया था। rhPDL1/एंटी-PDL1 मिश्रण को तब स्थिर rhPD-1 युक्त प्लेट कुओं में जोड़ा गया और प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई। संभावित रूप से अवरुद्ध PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटीबॉडी की उपस्थिति में स्थिर rhPD-1 के साथ प्रतिक्रिया करने वाले किसी भी rhPDL1 को बाद के स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी और वर्णमिति सब्सट्रेट इनक्यूबेशन के साथ पाया गया था। हमने इसे रिवर्स नाकाबंदी परख के रूप में परिभाषित किया।

एंटी-PDL1-पेप्टाइड एंटीबॉडी द्वारा पुनः संयोजक PD-1/PD-L1 इंटरैक्शन की रिवर्स नाकाबंदी ने एंटीबॉडी एकाग्रता-निर्भर तरीके सेसिग्नल (यानी, PD-1/PD-L1 नाकाबंदी) का निषेध दिखाया, जबकि प्रत्यक्ष नाकाबंदी दृष्टिकोण ने लगातार परिणाम प्रदान नहीं किए (दिखाया नहीं)। मनका आधारित दोहरे रिपोर्टर नाकाबंदी परख एलिसा परिणामों को सत्यापित करने और एक तरल चरण में पीडी -1 / पीडी-एल 1 बातचीत की नाकाबंदी की जांच करने के लिए विकसित किया गया था, जो संभावित स्टेरिक बाधा / बाध्यकारी एपिटोप उपलब्धता मुद्दों को समाप्त करता है अच्छी तरह से बोतलों पर पुनः संयोजक प्रोटीन को स्थिर करने के साथ। माइक्रोस्फीयर विश्लेषण सीधे रिवर्स नाकाबंदी परख (चित्रा 2) का उपयोग कर एलिसा अवरुद्ध परिणामों से संबंधित था। इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति आधारित immunoassays बेहतर परख संवेदनशीलता और वर्णमिति एलिसा18 की तुलना में एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान कर सकते हैं, और आगे, मल्टीप्लेक्स मनका आधारित परख एक ही प्रतिक्रिया के भीतर दो स्वतंत्र immunoassays के समवर्ती प्रदर्शन की अनुमति देता है. rhPD-1 के लिए microspheres के सहसंयोजक युग्मन के लिए इस्तेमाल किया sulfo-एनएचएस और EDC प्रत्यक्ष नाकाबंदी और उलट नाकाबंदी assays और एलिसा और Luminex मनका आधारित पुनः संयोजक PD-1/PD-L1 बातचीत assays के बीच संवेदनशीलता में मनाया मतभेद के बीच देखा प्रदर्शन मतभेद करने के लिए नेतृत्व किया हो सकता है. इन मतभेदों के लिए जिम्मेदार संभावित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए आगे रासायनिक और आणविक स्तर की जांच की आवश्यकता है।

एलिसा14 और मनका-आधारित परख दोनों प्रदर्शित करते हैं कि PDL1-Vaxx-प्रेरित एंटी-PDL1 एंटीबॉडी PD1/PD-L1 चेकपॉइंट जटिल गठन को रोक सकते हैं। पेप्टाइड-आधारित PDL1-Vaxx सफलतापूर्वक एंटी-PDL1 एंटीबॉडी को प्रेरित करता है जो PD-1/PD-L1 इंटरैक्शन को ब्लॉक कर सकता है। यह दृष्टिकोण कैंसर के इलाज के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय रणनीति के रूप में काम कर सकता है, जैसा कि प्रीक्लिनिकल पशु अध्ययन 3,13,14 द्वारा समर्थित है। नियोजित नैदानिक परीक्षण कैंसर रोगियों में चेकपॉइंट इम्यूनोथेरेपी और रोग नियंत्रण के लिए PDL1-Vaxx की प्रभावकारिता का निर्धारण करेंगे।

Disclosures

प्रवीण टीपी कौमाया Imugene, लिमिटेड के सलाहकार हैं।

Acknowledgments

लेखक शेरी डनबर पीएचडी, अनुसंधान सहायता के लिए ल्यूमिनेक्स कॉर्पोरेशन (ऑस्टिन, TX) के एमबीए और वैज्ञानिक और लेखन सहायता के लिए बायोमेडिकल पब्लिशिंग सॉल्यूशंस (पनामा सिटी, FL; mattsilver@yahoo.com) के मैथ्यू सिल्वरमैन पीएचडी का धन्यवाद करते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21 CA13508 और R01 CA84356) और इमुगेन लिमिटेड, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया (OSU 900600, GR110567, और GR124326) से प्रवीण टीपी कौमाया को पुरस्कारों द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 Millipore/Sigma S3139
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 MilliporeSigma  M2933
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 77149
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: Luminex Corp.  (Austin, TX) 40-50016
EDC, 10 mg 
sNHS solution, 250 µL
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) Luminex Corp.  (Austin, TX) INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Low protein-binding round bottom 96-well plate ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 07-200-761
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)  Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0269-01
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0288-01
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp.  (Austin, TX) MC-1**** (varies by bead label)
Protein LoBind microcentrifuge tubes ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 022431081
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)
Biotinylated recombinant human PDL1  Sino Biological (Wayne, PA) 10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 709-675-149
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 711-675-152
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) Acro Biosystems (Newark, DE) PD1-H5256 
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) Agilent (Santa Clara, CA) PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)

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References

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PDL1/PD-L1 इंटरैक्शन के PDL1-Vaxx पेप्टाइड वैक्सीन-प्रेरित एंटीबॉडी नाकाबंदी का चुंबकीय फ्लोरोसेंट मनका-आधारित दोहरी-रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण
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