Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Анализ магнитного флуоресцентного потока на основе магнитных флуоресцентных шариков блокады взаимодействия PD-1/PD-L1 пептидным пептидом PDL1-Vaxx

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65467
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Ингибиторы контрольных точек являются важными мишенями при разработке методов борьбы с раком. В настоящем докладе представлена новая противораковая вакцина PDL1-Vaxx на основе пептида PDL1, которая индуцирует выработку нейтрализующих поликлональных антител, блокирующих образование комплекса PD-1/PDL1. В этой работе также подробно описана разработка и тестирование флуоресцентного анализа на основе шариков для анализа этой активности.

Abstract

Ингибирование рецепторов контрольных точек (PD-1, PD-L1 и CTLA-4) моноклональными антителами показало большую пользу в клинических исследованиях для лечения онкологических больных и стало основным подходом в современной иммунотерапии рака. Тем не менее, только подгруппа пациентов реагирует на иммунотерапию моноклональными антителами в контрольных точках. Поэтому необходимо срочно разрабатывать новые терапевтические стратегии против рака. Была разработана новая противораковая вакцина PDL1 (лиганд запрограммированной смерти 1) с аминокислотами 130-147, связанными с пептидом MVF («беспорядочный» Т-клеточный белок слияния вируса кори) через GPSL-линкер. Доклинические испытания показали, что эта вакцина PDL1 (PDL1-Vaxx) эффективно стимулирует высокоиммуногенные антитела у животных. Животные, иммунизированные PDL1-Vaxx, демонстрируют снижение опухолевой нагрузки и более высокие показатели выживаемости в различных моделях рака у животных. Механизмы действия указывают на то, что антитела, вызванные вакциной, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, индуцируют апоптоз и блокируют взаимодействие PD-1/PD-L1. В данной статье представлен анализ на основе магнитных шариков, в котором используется система анализа потока с двумя репортерами для оценки взаимодействия PD-1/PD-L1 и его блокады антителами к PDL1, вырабатываемыми против PDL1-Vaxx.

Introduction

В Т-клетках, В-клетках и внутриклеточных контрольных точках иммунной системы сигнальные пути регулируют иммунную активность. Некоторые раковые клетки защищают себя от иммунной атаки, стимулируя контрольные точки-мишени, которые подавляют иммунную функцию и способствуют выживанию и пролиферации опухолей. Иммунотерапия онкологических заболеваний путем ингибирования контрольных точек использует антитела для нацеливания и блокировки сигнальных контрольных точек и, таким образом, восстановления противоопухолевых функций иммунной системы 1,2,3. Высокоэффективные противораковые препараты в настоящее время включают моноклональные антитела ниволумаб, которые нацелены на белок запрограммированной смерти 1 (PD-1)4, и атезолизумаб, который нацелен на лиганд запрограммированной смерти 1 (PD-L1)5. Такой подход показал большой клинический успех в лечении онкологических больных. Тем не менее, клиническая полезность существующих стратегий ингибирования контрольных точек смягчается нежелательными явлениями и резистентностью к лечению, особенно при терапии одним препаратом6. При лечении рака срочно требуется сочетание иммунотерапии и более эффективных терапевтических стратегий с меньшей токсичностью 1,3,6.

За последние 30 лет лаборатория доктора Каумайя разработала пептидные противораковые вакцины и связанные с пептидами агенты для терапии рака, некоторые из которых находятся в стадии клинических испытаний 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Например, в клинических испытаниях B-Vaxx в сочетании с комбинированной иммунотерапией HER-2 показала преимущества для пациентов в отношении метастатических и/или рецидивирующих солидных опухолей12. Новейшими противораковыми вакцинами лаборатории являются PD1-Vaxx 2,13 и PDL1-Vaxx14, которые показали большие преимущества в доклинических исследованиях, особенно при комбинированном лечении. Вакцина PD1-Vaxx завершила клинические испытания с повышением дозы в США и Австралии. PD1-Vaxx будет сочетаться с атезолизумабом в исследовании фазы 1b, которое начнется в мае 2023 года. Этот отчет посвящен оценке способности антител, индуцированных PDL1-Vaxx, блокировать взаимодействие PD-1/PD-L1.

Противораковая вакцина PDL1-Vaxx представляет собой новую эпитопную вакцину на основе В-клеточного пептида с аминокислотами PD-L1 130-147, связанными с неразборчивым пептидом слияния Т-клеточного вируса кори (MVF) через пептидный линкер GPSL. Доклинические исследования показали, что PDL1-Vaxx обладает высокой иммуногенностью, стимулируя выработку противораковых антител на различных животных моделях, продлевает выживаемость и снижает опухолевую нагрузку14. Эти антитела, вырабатываемые против пептида PD-L1, могут успешно блокировать взаимодействие PD1/PD-L1, что приводит к противоопухолевой активности. В этом отчете представлен анализ, который анализирует блокаду образования комплекса PD1/PD-L1 антителами, индуцированными PDL1-Vaxx, с использованием формата на основе магнитных шариков с двойным репортерным считыванием на приборе для проточной цитометрии.

Protocol

1. Подготовка эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех реагентах/оборудовании, упомянутых на этом этапе, приведена в таблице материалов.

  1. Получить рекомбинантный человеческий PD-1 (rhPD-1; полигистидин-меченый). Перед использованием восстановите лиофилизированный rhPD1 стерильно-фильтрованным фосфатно-солевым буфером (PBS), pH 7,4.
  2. Получить биотинилированный рекомбинантный человеческий PD-L1 (rhPD-L1). Перед использованием восстановите лиофилизированный rhPD-L1 стерильной деионизированной водой.
  3. Получить реагент для детекции R-фикоэритрина, конъюгированный стрептавидин-конъюгированным (SAPE). Храните все растворы SAPE в защищенном от света месте при температуре холодильника (т.е. 2-8 °C).
  4. Получите флуоресцентно окрашенные магнитные микросферы (диаметр 6,5 мкм, полистирол с вложенным магнетитом) и набор для соединения шариков15 (если используется, см. таблицу материалов). Ковалентное связывание с микросферами требует сульфо-NHS (сульфо-N-гидросукцинимида) и EDC (N-[3-диметиламинопропил]-N′-этилкарбодиимида гидрохлорида).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы магнитных шариков поставляются с любой из 500 уникальных флуоресцентных меток, что позволяет идентифицировать и дифференцировать их от различных наборов шариков16. Гранулы предлагаются в концентрациях 2,5 × 106 шариков/мл и 12,5 × 106 шариков/мл. Храните шарики в защищенном от света месте при температуре холодильника (т.е. 2-8 °C). Не замораживайте суспензии бортиков.
  5. Получение положительных и отрицательных контрольных антител и антител вторичного обнаружения, меченных Brilliant Violet 421 (BV421). Храните все флуоресцентно-сопряженные молекулы в защищенном от света месте.
  6. Выполняйте все реакции связывания в пробирках с низким содержанием белка и все реакции анализа в 96-луночных микротитровальных планшетах с низким содержанием белка с круглым дном. Запечатайте планшеты одноразовой клейкой пленкой или пластиковыми крышками для 96-луночных микропланшетов для этапов инкубации анализа. Используйте магнитный пластинчатый сепаратор для иммобилизации шариков на этапах промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система анализа потока с двумя репортерами имеет три лазера: (1) один, который идентифицирует и количественно определяет флуоресценцию, специфичную для набора шариков (канал классификации); (2) тот, который обнаруживает и количественно определяет флуоресценцию специфичного для мишени фикоэритрина (ПЭ) (Reporter Channel 1; возбуждение 532 нм, «оранжевое» излучение 565-585 нм); и (3) тот, который обнаруживает и количественно определяет специфичную для мишени флуоресценцию BV421 второго целевого аналита (Reporter Channel 2; возбуждение 405 нм, «синий» излучение 421-441 нм).

2. Соединение rhPD-1 с магнитными шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Соединяемый белок не должен содержать бычьего сывороточного альбумина (BSA), азида натрия, глицина, глицерина, трис(гидрокси-метил)аминометана (Tris) или аминосодержащих добавок и должен быть суспендирован в PBS при pH 7,4. Доступен коммерческий комплект муфт, который включает в себя все необходимые реагенты и буферы, описанные в настоящем документе (см. таблицу материалов).

  1. Выньте все связующие реагенты из холодильника и дайте им уравновеситься до комнатной температуры (RT, 18-22 °C) в течение 20-30 минут.
  2. Ресуспендируйте исходные микросферы путем кратковременного вихряния, ультразвуковой обработки или вращения (15 минут при 15-30 об/мин), согласно информационному листу продукта.
  3. Переложите 1 × 106 магнитных шариков в пробирку микроцентрифуги с низким содержанием белка объемом 1,5 мл (см. таблицу материалов).
  4. Промывка шариков с 100 мкл активационного буфера15: 0,1 М2PO4 (одноосновный), pH 6,2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сопряжение также может быть выполнено с использованием предварительно сконфигурированного комплекта для сопряжения, который включает 0,1 М 2-морфолиноэтансульфоновая кислота (MES), pH 6,0, в качестве альтернативного буфера активации и связывания (см. Таблицу материалов).
    1. Поместите пробирку с шариками в магнитный сепаратор на 1-2 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы гранулы можно разделить микроцентрифугированием при ≥8 000 × г в течение 1-2 минут.
    2. Отсасывайте надосадочную жидкость пипеткой из иммобилизованных магнитом или гранулированных шариков, при этом пробирка все еще находится в магнитном сепараторе.
    3. Извлеките пробирку микроцентрифуги из магнита и добавьте 80 мкл буфера связи (см. Таблицу материалов).
    4. Осторожно встряхните реакционную трубку и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 с, чтобы диспергировать шарики.
  5. Активируйте шарики с помощью sulfo-NHS и EDC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор sulfo-NHS составляет 50 мг/мл, растворенный в активационном буфере. Исходный раствор EDC также составляет 50 мг/мл, растворенный в активационном буфере. Как активационный буфер, так и влага в атмосфере вызывают деградацию EDC. Не рекомендуется использовать хранящееся решение EDC. Приготовьте достаточное количество свежего EDC-раствора перед этапом и используйте его сразу же, когда раствор будет готов. Выбросьте излишки EDC-раствора.
    ВНИМАНИЕ: EDC вызывает сильное раздражение глаз и раздражает дыхательные пути и кожу.
    1. Добавьте 10 мкл sulfo-NHS в пробирку с микрофугой, содержащую промытые и активированные гранулы.
    2. Добавьте 10 мкл исходного раствора EDC в пробирку с микрофугой, содержащую гранулы и сульфо-NHS.
    3. Защитите светочувствительные микросферы от света и вращайте на вращателе в течение 20 минут при 15-30 об/мин, при RT (18-22 °C). В качестве альтернативы трубка может оставаться неподвижной на этапе активации, если ее осторожно вихрять для перераспределения шариков с интервалом в 10 минут.
  6. Смойте излишки реагентов сцепления с бортов.
    1. Поместите пробирку с активированными шариками в магнитный сепаратор на 1-2 минуты.
    2. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки из магнитных или гранулированных шариков, при этом пробирка все еще находится в магнитном сепараторе.
    3. Извлеките пробирку микроцентрифуги из магнита и добавьте 100 мкл активационного буфера.
    4. Осторожно встряхните реакционную трубку, чтобы рассеять шарики.
    5. Повторите шаги 2.6.1-2.6.4 еще два раза, чтобы в общей сложности выполнить три стирки. В конце промывки гранулы будут суспендированы в 100 мкл активационного буфера в приблизительной концентрации 10 × 106 шариков/мл.
  7. Соедините пептид rhPD-1 с активированными шариками.
    1. Добавьте 390 мкл активационного буфера в пробирку, содержащую активированные шарики, чтобы довести общий объем суспензии шарика до 490 мкл.
    2. Добавьте 1 мкг пептида PD-1 к активированной суспензии гранул, добавив 10 мкл раствора пептида PD-1 (1 мг/мл, растворенный в PBS) в пробирку, содержащую активированные шарики.
    3. Кратковременно встряхните пробирку микроцентрифуги, чтобы равномерно распределить PD-1 и активированные шарики.
    4. Инкубируют шарики с ПД-1 в течение 2 ч в темноте при РТ (18-22 °С) при вращении (15-30 об/мин).
  8. Промойте бусины дважды (2 раза) с использованием пробирного буфера (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).
    1. Поместите пробирку с активированными шариками в магнитный сепаратор на 1-2 минуты.
    2. Отсасывайте надосадочную жидкость пипеткой из иммобилизованных магнитом или гранулированных шариков, при этом пробирка все еще находится в магнитном сепараторе.
    3. Извлеките пробирку микроцентрифуги из магнита и добавьте 100 мкл активационного буфера.
    4. Осторожно встряхните реакционную трубку, чтобы рассеять шарики.
    5. Повторите шаги 2.8.1-2.8.4 еще один раз, чтобы выполнить в общей сложности две стирки. В конце промывки гранулы будут суспендированы в 100 мкл активационного буфера в концентрации 10 ×10 6 шариков/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для анализа/промывки может быть изготовлен без азида натрия (консерванта), если буфер также не используется в качестве среды хранения.
    6. Храните шарики, связанные rhPD-1, в темноте в холодильнике при температуре 2-8 °C, если они не используются немедленно. Гранулы, связанные с белками, стабильны до 18 месяцев.

3. Оценка успешного соединения rhPD-1 с шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы, связанные с rhPD-1, вступают в реакцию с биотинилированным rhPD-L1, последний из которых обнаруживается путем инкубации с SAPE с последующей оценкой на проточном цитометре. Это подтверждает как успешное связывание PD-1 с магнитными шариками, так и функциональное взаимодействие между белками rhPD-1 и rhPD-L1.

  1. Создать серию серийных разведений биотинилированного рПД-L1 в PBS-TBN (исходный раствор рПД-L1 составляет 1 мг/мл). Окончательный диапазон концентраций rhPD-L1, который необходимо протестировать, составляет от 8 мкг/мл до 313 пг/мл. Создайте объемы 150 мкл каждого разведения rhPD-L1: 50 мкл на каждую реакцию и две реакции на условие, а также достаточный избыток для компенсации потерь при пипетировании.
    1. Маркируйте пробирки для разведения rhPD-L1 как 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,125 мкг/мл, 0,063 мкг/мл и 0,031 мкг/мл. Пробирка 0 мкг/мл (только PBS-TBN) служит контролем no-PD-L1.
    2. Предварительно загрузите 150 мкл PBS-TBN во все маркированные пробирки для разведения rhPD-L1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая конечная концентрация rhPD-L1 для тестирования составляет 8 мкг/мл, а rhPD-L1 будет разбавлен 1:1 при добавлении в реакционную смесь, поэтому пробирка для разведения с маркировкой «8 мкг/мл» относится к конечной концентрации и фактически содержит 16 мкг/мл rhPD-L1. Этикетки на всех пробирках для разведения указывают конечную концентрацию rhPD-L1 после добавления в реакцию.
    3. Создайте разбавление rhPD-L1 с самой высокой концентрацией (16 мкг/мл). Это двухступенчатое 62,5-кратное разведение исходного раствора rhPD-L1 в дозе 1 мг/мл (1000 мкг/16 мкг = 62,5).
      1. Смешайте 84 мкл PBS-TBN с 16 мкл исходного раствора rhPD-L1 (1 мг/мл, т. е. 1 000 мкл) в пробирке для микроцентрифуги. Это 6,25-кратное разведение, а результирующая концентрация составляет 160 мкг/мл rhPD-L1.
      2. В пробирке с маркировкой «8 мкг/мл» смешайте 270 мкл PBS-TBN с 30 мкл разведения rhPD-L1, полученного на предыдущем этапе (160 мкг/мл). Это 10-кратное разведение, а результирующая концентрация фактически составляет 16 мкг/мл. Маркировка пробирки «8 мкг/мл» указывает на его конечную концентрацию после добавления в реакцию.
    4. Перелейте 150 мкл разведения rhPD-L1, созданного на этапе 3.1.3 («8 мкг/мл»), в пробирку «4 мкг/мл», закройте крышку пробирки микроцентрифуги и кратковременно перемешайте раствор.
    5. Повторяйте шаг 3.1.4 последовательно до тех пор, пока не будет завершена серия разведения rhPD-L1. После создания все пробирки от «8 мкг/мл» до «0,063 мкг/мл», а также контрольная пробирка 0 мкг/мл должны содержать 150 мкл раствора, а последняя пробирка, «0,031 мкг/мл», должна содержать 300 мкл раствора. Таким образом, создается достаточный объем каждого разведения для тестирования 50 мкл каждого биотинилированного разведения rhPD-L1 в повторяющихся реакциях, при этом остается достаточный избыток для компенсации потерь при пипетировании.
  2. Подсчитайте количество шариков, связанных с rhPD-1, с помощью гемоцитометра17.
  3. Разбавьте исходные гранулы, связанные с rhPD-1, до 5 × 104 шариков/мл, с объемом, достаточным для 2 500 шариков/50 мкл/реакция.
  4. Вмешайте 5 × 104 шариков/мл суспензии rhPD-1 и пипетку 50 мкл суспензии в каждую меченую/картированную лунку 96-луночного микротитрового планшета с круглым дном так, чтобы для каждого тестируемого разведения rhPD-L1 были созданы дублирующиеся лунки.
  5. Добавьте 50 мкл каждой биотинилированной пробирки для разведения rhPD-L1, созданной на этапе 3.1, в соответствующие лунки на планшете микротитра.
  6. Накройте планшет с микротитрами одноразовой фольгой или пластиковым клейким герметиком для пластин и инкубируйте планшет в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере (600 об/мин).
  7. Смойте излишки биотинилированного rhPD-L1 с шариков.
    1. Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    2. Осторожно снимите герметик для клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и вылейте надосадочную жидкость в раковину или контейнер для биологически опасных жидких отходов, если это необходимо. Аккуратно, но быстро постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить оставшуюся надосадочную жидкость.
    3. Извлеките микротитровую пластину из сепаратора магнитных пластин и пипеткой 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку.
    4. Поместите незапечатанную пластину на магнитный сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    5. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните планшет и вылейте надосадочную жидкость в раковину или контейнер для биологически опасных жидких отходов, если это необходимо. Аккуратно, но быстро постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить оставшуюся надосадочную жидкость.
  8. Повторите шаги промывки пластин 3.7.3-3.7.5 два раза, в общей сложности три промывки по 150 мкл PBS-TBN каждая. Убедитесь, что в конце последнего этапа промывки в лунках не осталось надосадочной жидкости. Работайте неуклонно, чтобы не допустить высыхания обездвиженных шариков на дне колодца.
  9. Добавьте реагент SAPE Detection.
    1. Разбавьте исходный раствор SAPE в PBS-TBN до рабочей концентрации 6 мкг/мл. Подготовьте достаточный объем рабочего раствора SAPE, чтобы все реакционные лунки могли принимать 100 мкл/лунку с достаточным запасом для компенсации потерь при пипетировании.
    2. Извлеките микротитровую пластину из магнитного пластинчатого сепаратора.
    3. Добавьте 100 мкл рабочего раствора SAPE в каждую реакционную лунку и повторно суспендируйте промытые шарики с помощью пипетирования.
    4. Запечатайте 96-луночный планшет с микротитром с помощью фольги или пластикового клейкого герметика для пластин и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин.
    5. Извлеките микротитровую пластину из инкубатора, перенесите ее в магнитный сепаратор пластин для иммобилизации шариков, снимите герметик для клейких пластин и трижды промойте шарики 150 мкл PBS-TBN, как описано в шагах 3.7.3-3.7.5.
    6. После удаления окончательной промывки извлеките пластину из магнитного пластинчатого сепаратора и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл PBS-TBN на лунку.
  10. Проанализируйте результаты.
    1. Прочтите табличку на приборе для анализа потока (см. Таблицу материалов), чтобы определить медианную интенсивность флуоресценции (MFI) каждой реакции, используя следующие настройки прибора: объем аспирации = 50 мкл; минимальное количество бусин = 100 бусин; настройка таймаута = 40 с; литник = 7 000-17 000; режим работы = Один репортер. Повторяющиеся скважины выполняются для каждого условия, и два выходных значения MFI для каждого условия усредняются перед выполнением дальнейших вычислений данных и построения графиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение MFI для каждого разведения должно показывать концентрационно-зависимое связывание, указывая на приемлемую эффективность связывания rhPD-1 с шариками и подтверждая хорошее взаимодействие рекомбинантных белков PD-1/PD-L1.

4. Блокирующий анализ PD-L1 на основе магнитных шариков PD-1/PD-L1

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ оценивает блокирующую активность растворимых медиаторов (например, анти-PDL1-пептидных антител) на рекомбинантные взаимодействия PD1/PD-L1. Вкратце, биотинилированный rhPD-L1 предварительно инкубируют с антителами, вырабатываемыми у кроликов после различных инокуляций пептидов PDL1-Vaxx. Затем смесь антител rhPD-L1 + анти-PDL1 захватывают с помощью магнитных шариков, связанных с rhPD-1, а связывание rhPD-L1 с шариками, связанными с rhPD-1, количественно определяют путем добавления стрептавидина-ПЭ. Сигнал флуоресценции ПЭ обратно коррелирует с блокирующей активностью исследуемых антител/ингибиторов PDL1. Связывание антител к пептиду к PDL1 оценивается одновременно путем связывания вторичного антитела к кролику (для антител к пептиду PDL1) или к человеку (для контрольных антител) и путем оценки флуоресценции BV421 во втором канале прибора. Этапы анализа наглядно представлены на рисунке 1.

  1. Подготовьте серию тестовых антител с двукратным серийным разведением, включая поликлональные антитела-кандидаты, индуцированные PDL1-Vaxx, антитела с отрицательным контролем (трастузумаб, герцептин, гуманизированное моноклональное антитело против HER2) и положительное контрольное антитело (атезолизумаб; гуманизированное моноклональное антитело против PDL1 IgG1). Для каждой реакции будет использоваться 25 мкл назначенного разведения антител, поэтому показанные объемы достаточны для выполнения каждой реакции в двух лунках для каждого условия (т. е. 50 мкл на условие), с некоторым избытком, остающимся для компенсации потерь при пипетировании.
    1. Для каждого индуцированного вакциной антитела к PDL1-пептиду и контрольного антитела убедитесь, что диапазон конечных концентраций антител составляет от 1000 мкг/мл до 8 мкг/мл. Приготовьте исходные растворы всех антител в концентрации 2000 мкг/мл.
    2. Для каждого антитела пометьте пробирки для разведения как 1 000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 63 мкг/мл, 31 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 мкг/мл и укажите название антитела. Для каждого антитела также добавьте пробирку «0 мкг/мл», которая будет использоваться только в транспортном средстве (PBS-TBN).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении в реакционную смесь концентрация антител будет разбавлена 1:1. Пробирки для разведения антител помечены как конечная концентрация антител после добавления в реакцию и фактически содержат в два раза больше антител, чем на этикетке.
    3. Добавьте 75 мкл PBS-TBN во все пробирки для разведения антител с маркировкой «500 мкг/мл» и ниже, включая контрольные пробирки «0 мкг/мл», предназначенные только для транспортных средств.
    4. Для каждого антитела пипетку 150 мкл из 2 000 мкг/мл исходного раствора в соответствующую пробирку с маркировкой «1 000 мкг/мл». Это будет использоваться для всех последующих разведений для каждого антитела.
    5. Для каждого антитела создайте полную серию разведений, перенося пипеткой 75 мкл из пробирки «1000 мкг/мл» в пробирку со следующим меньшим разведением в серии (т.е. «500 мкг/мл»). Закройте только что готовую пробирку для разведения, кратковременно встряхните ее и продолжайте построение серии разведения, перенося 75 мкл из пробирки «500 мкг/мл» в пробирку «250 мкг/мл». Повторяйте эту схему до тех пор, пока не будет произведено последнее разведение «8 мкг/мл» для всех антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В завершенной серии разведения для каждого антитела должен быть объем 75 мкл для всех пробирок, кроме самого низкого разведения, 8 мкг/мл, который должен содержать объем 150 мкл. Для каждой реакции будет использоваться 25 мкл разведения антител, поэтому этих объемов достаточно для выполнения каждой реакции в дублирующих лунках для каждого условия (т. е. 50 мкл на каждое состояние), с дополнительным для компенсации потерь при пипетировании.
  2. Поместите 25 мкл разбавленных антител в специально отведенные лунки 96-луночного микротитрового планшета.
  3. Разбавляют биотинилированный rhPD-L1 до рабочей концентрации 4 мкг/мл в PBS-TBN в объеме, достаточном для включения 25 мкл в дублирующиеся лунки на условие (т. е. 50 мкл на состояние) с дополнительным количеством для компенсации потерь при пипетировании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе биотинилированный rhPD-L1 в концентрации 4 мкг/мл привел к получению примерно 50% максимального сигнала MFI, измеренного при более ранней оценке сопряжения, и был использован для анализа блокады PD-1/PD-L1.
  4. Добавьте 25 мкл биотинилированного rhPD-L1 (4 мкг/мл) в каждую реакционную лунку, накройте микротитровую пластину фольгой или пластиковой клейкой пломбой и инкубируйте при RT (18-22 °C) в течение 1 ч при встряхивании на орбитальной пластинчатой шейкере при 600 об/мин.
  5. Разбавьте гранулы, связанные rhPD-1, до 50 000 шариков/мл с достаточным объемом для 50 мкл/лунка (2 500 шариков на лунку) плюс дополнительно для компенсации потерь при пипетировании.
  6. Извлеките 96-луночную реакционную пластину микротитра из шейкера и снимите клейкое уплотнение.
  7. Добавьте 50 мкл смеси гранул rhPD-1 в каждую лунку.
  8. Запечатайте планшет и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин.
  9. Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
  10. Осторожно снимите герметик для клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости.
  11. Смойте излишки реагентов с шариков.
    1. Извлеките микротитровую пластину из магнитного пластинчатого сепаратора и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку.
    2. Поместите микротитровую пластину на магнитный пластинчатый сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    3. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните планшет и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости.
  12. Повторите шаги промывки пластин 4.11.1-4.11.3 два раза, в общей сложности три промывки PBS-TBN. Убедитесь, что реагент SAPE приготовлен (см. ниже) перед удалением окончательного (третьего) промывочного раствора.
  13. Добавьте реагент для обнаружения SAPE.
    1. Разбавляют исходный раствор SAPE до рабочей концентрации 6 мкг/мл в PBS-TBN; сделать достаточный объем для 100 мкл/лунку, плюс дополнительно для компенсации потерь при пипетировании.
    2. Добавьте 100 мкл/лунку рабочего раствора SAPE в каждую реакционную лунку и ресуспендируйте гранулы путем пипетирования.
    3. Запечатайте планшет и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин.
  14. Сцедите излишки SAPE из реакции.
    1. Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    2. Осторожно снимите герметик клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить надосадочную жидкость, содержащую излишки SAPE.
  15. Смойте излишки SAPE с бусин.
    1. Извлеките микротитровую пластину из держателя магнитной пластины.
    2. Добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку, чтобы повторно суспендировать шарики.
    3. Поместите микротитровую пластину на магнитный пластинчатый сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    4. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно прилегают друг к другу, переверните планшет и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости.
  16. Выполните два дополнительных этапа промывки с PBS-TBN, чтобы в общей сложности получить три стирки, повторив шаги 4.15.1–4.15.4. Перед удалением последнего (третьего) промывочного раствора подготовьте конгугированные BV421 вторичные антитела к обнаружению (следующий этап).
  17. Добавьте вторичные антитела, конгугированные BV421.
    1. Разбавьте BV421-конгугированный античеловеческий IgG (для обнаружения гуманизированных контрольных антител) и BV421-конгугированный антикроличий IgG (для обнаружения поликлональных антител, индуцированных PDL1-Vaxx) (см. таблицу материалов) в соотношении 1:400 в буфере для промывки/анализа в объемах, достаточных для использования 100 мкл/лунка каждого из них, с дополнительными для компенсации потерь при пипетировании.
    2. Добавьте 100 мкл разбавленного BV421-конъюгированного античеловеческого IgG или BV421-конъюгированного антикроличьего IgG в соответствующие лунки.
    3. Запечатайте планшет и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин.
  18. Сцеживание избыточных вторичных антител, конъюгированных с BV421, из шариков.
    1. Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    2. Осторожно снимите герметик клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить надосадочную жидкость, содержащую избыток вторичных антител, конъюгированных с BV421.
  19. Смойте излишки конъюгированных BV421 вторичных антител из шариков.
    1. Добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку, чтобы повторно суспендировать шарики.
    2. Поместите микротитровую пластину на магнитный пластинчатый сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики.
    3. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно прилегают друг к другу, переверните планшет и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости.
  20. Выполните три дополнительных этапа стирки с PBS-TBN, чтобы в общей сложности выполнить четыре стирки, повторив шаги 4.19.1–4.19.3.
  21. После удаления последнего (четвертого) промывочного буфера извлеките микротитровую пластину из магнитного планшетного сепаратора и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл PBS-TBN/лунку с помощью пипеттора.
  22. Проанализируйте результаты.
    1. Считайте показания таблички на двухрепортерной системе анализа потока, чтобы определить MFI каждой реакции, используя следующие настройки прибора: объем аспирации = 50 мкл; минимальное количество бусин = 100 бусин; настройка таймаута = 40 с; стробирование: 7,000-17,000; режим работы = Dual Reporter.
    2. При использовании системы с двумя репортерами убедитесь, что Reporter Channel 1 измеряет флуоресценцию оранжевого PE (количество rhPD-L1, прикрепленных к конъюгированным шарикам rhPD-1), а Reporter Channel 2 измеряет флуоресценцию синего BV421 (количество прикрепленных блокирующих антител, связанных с rhPD-L1).
    3. Запустите дублирующиеся скважины для каждого условия и усредните два выходных значения MFI для каждого условия, прежде чем выполнять дальнейшие вычисления данных и построение графиков.
    4. Стандартизируйте значение MFI для каждого образца до отрицательного контроля и рассчитайте процент ингибирования для каждого образца:
      Ингибирование % = (100 × [МФО отрицательного контроля − МФО выборки])/МФО с отрицательным контролем
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные контрольные значения MFI (без ингибирования) являются самыми высокими значениями; связанный сигнал PD-L1 MFI равен 100%, а ингибирование связывания rhPD-L1 с rhPD-1 определено как 0%.

Figure 1
Рисунок 1: Схема двухрепортерного блокадного анализа PD-1/PD-L1. Биотинилированный рекомбинантный человеческий PD-L1 (rhPD-L1) предварительно инкубируют с выбранными антителами PDL1-Vaxx, индуцированными анти-PDL1, а затем соединяют с магнитными шариками, связанными с rhPD-1, чтобы обеспечить образование комплекса контрольных точек PD-1/PD-L1. Затем обнаруживается и маркируется комплексированный rhPD-L1 с добавлением стрептавидин-связанного фикоэритрина (SAPE, оранжевый флуорофор). Антитела против эпитопов PDL1-Vaxx нацелены на rhPD-L1, который интегрировался в rhPD-1, предварительно связанный с магнитными шариками, и они подсвечиваются с помощью вторичного антитела, конъюгированного Brilliant Violet 421 (BV421, синий флуорофор). Как биотинилированные rhPD-L1, которые комплексируются с PD-1 (сигнал PE), так и антитела против PDL1, которые распознают и связывают rhPD-L1 (сигнал BV421), анализируются одновременно с помощью двухрепортерного проточного цитометрического прибора, который опрашивает образцы на наличие обоих флуорофоров в двух отдельных репортерных каналах. Выходные значения для каждого образца представляют собой медианную интенсивность флуоресценции каждого флуорофора. Ингибирование образования комплекса PD1/PD-L1 различными антителами, индуцированными PDL1-Vaxx, затем экстраполируют путем сравнения экспериментальных сигналов с сигналами, полученными с помощью моноклонального антитела с отрицательным контролем, которое не связывается с rhPD-L1 (ингибирование 0%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

Анализ позволил точно количественно оценить ингибирование взаимодействия PD-1/PD-L1 четырьмя уникальными поликлональными антителами, вырабатываемыми против пептидов вакцины rhPD-L1, которые изучаются в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения рака. Схема этого анализа представлена на рисунке 1. Количество биотинилированного рПД-L1, которое связывалось с рПД-1-конъюгированными шариками, и ингибирование этого связывания четырьмя кандидатами в антитела, индуцированные PLD1-Vaxx, измеряли в канале Reporter Channel 1 с использованием реагента для обнаружения стрептавидина-ПЭ, который непосредственно связывал рПД-L1 (рис. 2).

Все четыре поликлональных анти-PDL1-пептидных антитела блокировали взаимодействие rhPD-L1 с PD-1, который был иммобилизован на микросферах в различной степени. Процент ингибирования различных антител к пептидам PDL1 варьировал от 48% до 74% при максимальной испытанной концентрации 1000 мкг/мл. Положительное контрольное моноклональное антитело атезолизумаб достигло 92% блокады взаимодействия PD-1/PD-L1 при максимальной испытанной концентрации14 4 мкг/мл (рис. 2). Все экспериментальные антитела к PDL1-Vaxx показали концентрационно-зависимое ингибирование связывания rhPD-L1 с конъюгированными гранулами rhPD-1 по сравнению с трастузумабом, отрицательным контрольным антителом, которое, как ожидалось, не будет взаимодействовать с системой PD-1/PD-L1.

Figure 2
Рисунок 2: Блокада взаимодействия rhPD-L1 с rhPD-1 в сочетании с магнитными шариками антителами к PDL1-пептиду, как показано в новом иммуноанализе на основе флуоресцентных шариков. Рекомбинантный человеческий PD-1 соединяли с магнитными микросферами, а затем гранулы инкубировали с биотинилированным rhPD-L1, который был предварительно инкубирован с различными антителами к PDL1-пептиду. Для связывания биотина и, таким образом, оценки относительного количества rhPD-L1, доступного для связывания с PD-1, использовали реагент для обнаружения стрептавидина-фикоэритрина. Поликлональные антитела, выращенные у кроликов против пептидных вакцин PDL1 (анти-PDL1 [36], анти-PDL1 [50], анти-PDL1 [95] и анти-PDL1 [130]) были протестированы на ингибирующую активность и показали 48%-74% блокаду рекомбинантных взаимодействий PD-1 / PD-L1 при самой высокой протестированной концентрации. В качестве положительного контроля использовали атезолизумаб (другое моноклональное антитело против PDL1). В качестве отрицательного контроля использовали неродственное коммерческое моноклональное антитело трастузумаб (анти-HER2). Эта цифра адаптирована из Guo et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнительное связывание различных PDL1-Vaxx-индуцированных антител к rhPD-L1 в комплексе с магнитными шариками с покрытием rhPD1. Блестяще-фиолетовое 421-конъюгированное вторичное антитело было использовано для сравнения связывания различных поликлональных анти-PDL1-пептидных антител кроликов к рПД-L1 через шарики, покрытые рПД-1. Синий флуоресцентный сигнал BV421 был зарегистрирован в репортерном канале 2 двухрепортерного прибора; этот сигнал коррелирует с относительной эффективностью связывания экспериментальных антител к PDL1-пептиду. Трастесумаб (анти-HER2), моноклональное антитело, которое нацелено на контрольную точку, отличную от PD-1/PD-L1, использовали в качестве отрицательного контроля. MFI представляет собой среднюю медианную интенсивность флуоресценции шарика, которая была измерена в дублирующих реакционных лунках для каждого состояния. Эта цифра адаптирована из Guo et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Относительные способности четырех экспериментальных PDL1-Vaxx-индуцированных антител-кандидатов связывать rhPD-L1 сравнивали с помощью отдельной системы детектирования (BV421-конъюгированный антикроличий IgG), которая оценивалась по второму репортерному каналу прибора. Эти результаты показали, что все четыре поликлональных антитела к пептиду PDL1 связываются с rhPD-L1 в зависимости от концентрации14 (рис. 3). Антитело к PDL1(130) показало самый высокий сигнал связывания с rhPDL1 из четырех кандидатов на антитела, индуцированные PDL1-Vaxx.

Discussion

Целью иммунотерапии рака, связанной с контрольными точками, является нарушение взаимодействия между белками контрольных точек и их важными лигандами в выживаемости и прогрессировании опухоли2. Эта исследовательская группа активно разрабатывает новые вакцины PD-1 и PD-L1, которые вызывают ответ антител, который нацелен на контрольную точку PD-1/PD-L1 3,8,13,14 и прерывает ее. Ранее были проведены две вариации иммуноферментного анализа (ИФА) для оценки влияния антител к анти-PDL1-пептиду на ингибирование рекомбинантного взаимодействия PD1/PD-L114. (1) В первом варианте rhPD-L1 наносили на микротитровую пластину, а затем инкубировали с разбавленными антителами-кандидатами против PDL1. Ингибирование рекомбинантного взаимодействия PD-1/PD-L1 антителами затем оценивали путем добавления биотинилированного rhPD-1 и количественного определения связывания с иммобилизованным rhPD-L1 с использованием конъюгата стрептавидин-хрен-пероксидазы и колориметрического субстрата. Мы определили это как анализ прямой блокады. (2) Во втором варианте PD-1 наносили на микротитровую пластину. Биотинилированный rhPD-L1 предварительно инкубировали с каждым из поликлональных антител, индуцированных анти-PLD1, в отдельных реакционных пробирках. Затем смеси rhPDL1/анти-PDL1 добавляли в пластинчатые лунки, содержащие иммобилизованный rhPD-1, и давали им вступить в реакцию. Любой рПДЛ1, который реагировал с иммобилизованным рПД-1 в присутствии потенциально блокирующих антител, индуцированных PDL1-Vaxx, выявлялся при последующей инкубации стрептавидин-ГРП и колориметрического субстрата. Мы определили это как анализ обратной блокады.

Обратная блокада рекомбинантного взаимодействия PD-1/PD-L1 антителами к пептиду PDL1 показала ингибирование сигнала (т.е. блокады PD-1/PD-L1) в зависимости от концентрации антител14, в то время как подход с прямой блокадой не дал последовательных результатов (не показан). Для верификации результатов ИФА и исследования блокады взаимодействия PD-1/PD-L1 в жидкой фазе был разработан двухрепортерный блокадный анализ на основе шариков, который устраняет потенциальные проблемы с помехой/доступностью эпитопов связывания, связанные с иммобилизацией рекомбинантных белков на забое скважин. Микросферный анализ напрямую коррелировал с результатами блокады ИФА с помощью обратного блокадного анализа (рис. 2). Кроме того, флуоресцентные иммуноанализы могут обеспечить улучшенную чувствительность анализа и расширенный динамический диапазон по сравнению с колориметрическими ИФА18, и, кроме того, мультиплексный анализ на основе шариков позволяет одновременно выполнять два независимых иммуноферментных анализа в рамках одной реакции. Сульфо-NHS и EDC, используемые для ковалентного связывания микросфер с rhPD-1, могли привести к различиям в производительности, наблюдаемым между анализами прямой и обратной блокады, а также к наблюдаемым различиям в чувствительности между анализами рекомбинантного взаимодействия PD-1/PD-L1 на основе ИФА и гранул Luminex. Необходимы дальнейшие исследования на химическом и молекулярном уровнях для изучения возможных механизмов, ответственных за эти различия.

Как ИФА14, так и анализы на основе шариков показывают, что PDL1-Vaxx-индуцированные антитела к PDL1 могут ингибировать образование комплекса контрольных точек PD1/PD-L1. PDL1-Vaxx на основе пептидов успешно индуцирует антитела к PDL1, которые могут блокировать взаимодействие PD-1/PD-L1. Этот подход может служить новой терапевтической стратегией для лечения рака, что подтверждается доклиническими исследованиями на животных 3,13,14. Запланированные клинические испытания определят эффективность PDL1-Vaxx для иммунотерапии контрольных точек и контроля заболевания у онкологических больных.

Disclosures

Правин Т.. Каумайя является консультантом ООО «Имугене».

Acknowledgments

Авторы благодарят Шерри Данбар, доктора философии, магистра делового администрирования корпорации Luminex (Остин, штат Техас) за поддержку исследований и Мэтью Сильвермана, доктора философии Biomedical Publishing Solutions (Панама-Сити, штат Флорида; mattsilver@yahoo.com) за научную и писательскую помощь. Эта работа была поддержана наградами Правину Т.. Каумайе из Национальных институтов здравоохранения (R21 CA13508 и R01 CA84356) и Imugene Ltd, Сидней, Австралия (OSU 900600, GR110567 и GR124326).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 Millipore/Sigma S3139
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 MilliporeSigma  M2933
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 77149
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: Luminex Corp.  (Austin, TX) 40-50016
EDC, 10 mg 
sNHS solution, 250 µL
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) Luminex Corp.  (Austin, TX) INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Low protein-binding round bottom 96-well plate ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 07-200-761
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)  Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0269-01
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0288-01
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp.  (Austin, TX) MC-1**** (varies by bead label)
Protein LoBind microcentrifuge tubes ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 022431081
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)
Biotinylated recombinant human PDL1  Sino Biological (Wayne, PA) 10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 709-675-149
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 711-675-152
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) Acro Biosystems (Newark, DE) PD1-H5256 
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) Agilent (Santa Clara, CA) PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
  2. Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).
  3. Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).
  4. Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
  5. Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
  6. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  7. Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
  8. Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
  9. Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
  10. Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
  11. Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
  12. Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
  13. Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).
  14. Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  18. Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019).

Tags

Магнитный флуоресцентный шарик двухрепортерный анализ потока пептидная вакцина PDL1-Vaxx блокада антител взаимодействие PD-1/PD-L1 рецепторы контрольных точек моноклональные антитела клинические испытания онкологические больные иммунотерапия рака терапевтические стратегии эпитоп В-клеточного пептида противораковая вакцина PDL1 доклинические испытания иммуногенные антитела опухолевое бремя выживаемость механизмы действия анализ на основе магнитных шариков
Анализ магнитного флуоресцентного потока на основе магнитных флуоресцентных шариков блокады взаимодействия PD-1/PD-L1 пептидным пептидом PDL1-Vaxx
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. … More

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. T. P. Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction. J. Vis. Exp. (197), e65467, doi:10.3791/65467 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter