Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Magnetisk fluorescerende perlebaseret dual-reporter flowanalyse af PDL1-vaxx peptidvaccineinduceret antistofblokade af PD-1 / PD-L1-interaktionen

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65467
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Checkpoint-hæmmere er vigtige mål i udviklingen af terapier til kampen mod kræft. Denne rapport introducerer en ny PDL1-peptidbaseret kræftvaccine, PDL1-Vaxx, som inducerer neutraliserende polyklonal antistofproduktion, der blokerer PD-1/PDL1-kompleksdannelse. Dette arbejde beskriver også udviklingen og testningen af et fluorescerende perlebaseret assay til analyse af denne aktivitet.

Abstract

Hæmningen af checkpoint-receptorer (PD-1, PD-L1 og CTLA-4) med monoklonale antistoffer har vist stor fordel i kliniske forsøg til behandling af kræftpatienter og er blevet en grundpille i moderne kræftimmunterapi. Imidlertid reagerer kun en delmængde af patienter på checkpoint monoklonal antistofimmunterapi. Derfor er det presserende at udvikle nye terapeutiske strategier mod kræft. En ny B-celle peptidepitop PDL1 (programmeret dødsligand 1) kræftvaccine er blevet udviklet, med aminosyrer 130-147 bundet til MVF-peptidet ("promiskuøs" T-celle mæslingevirus fusionsprotein) via en GPSL-linker. Prækliniske test har vist, at denne PDL1-vaccine (PDL1-Vaxx) effektivt stimulerer stærkt immunogene antistoffer hos dyr. Dyr immuniseret med PDL1-Vaxx viser reduceret tumorbyrde og udvidede overlevelsesrater i forskellige dyrecancermodeller. Virkningsmekanismerne indikerer, at vaccinefremkaldte antistoffer hæmmer tumorcelleproliferation, inducerer apoptose og blokerer PD-1 / PD-L1-interaktionen. Dette manuskript introducerer et magnetisk perlebaseret assay, der bruger et dual-reporter flowanalysesystem til at evaluere PD-1 / PD-L1-interaktionen og dens blokade af anti-PDL1-antistofferne hævet mod PDL1-Vaxx.

Introduction

I immunsystemets T-celler, B-celler og intracellulære kontrolpunkter regulerer signalveje immunaktiviteter. Nogle kræftceller beskytter sig mod immunangreb ved at stimulere checkpoint-mål, som hæmmer immunfunktionen og fremmer neoplastisk overlevelse og spredning. Onkologisk immunterapi ved checkpoint-hæmning bruger antistoffer til at målrette og blokere signalkontrolpunkterne og dermed genoprette immunsystemets anti-neoplastiske funktioner 1,2,3. Meget effektive anticancerbehandlinger omfatter i øjeblikket de monoklonale antistoffer nivolumab, som er rettet mod programmeret dødsprotein 1 (PD-1)4, og atezolizumab, som er målrettet mod programmeret dødsligand 1 (PD-L1)5. Denne tilgang har vist stor klinisk succes i behandlingen af kræftpatienter. Den kliniske anvendelighed af de nuværende checkpoint-hæmningsstrategier afbødes imidlertid af bivirkninger og behandlingsresistens, især i enkeltstofbehandling6. En kombination af immunterapi og mere effektive terapeutiske strategier med lavere toksicitet er presserende nødvendig i kræftbehandling 1,3,6.

I løbet af de sidste 30 år har Dr. Kaumaya's laboratorium udviklet peptidcancervacciner og peptidefterligningsrelaterede midler til kræftbehandling, hvoraf nogle er i igangværende kliniske forsøg 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . For eksempel har B-Vaxx med HER-2 kombinationsimmunterapi vist patientfordele mod metastatiske og / eller tilbagevendende solide tumorer i kliniske forsøg12. Laboratoriets nyeste kræftvacciner er PD1-Vaxx 2,13 og PDL1-Vaxx14, som har vist store fordele i prækliniske studier, især i kombinationsbehandling. PD1-Vaxx har gennemført kliniske forsøg med dosiseskalering i USA og Australien. PD1-Vaxx vil blive kombineret med atezolizumab i fase 1b-studiet, der starter i maj 2023. Denne rapport fokuserer på at evaluere PDL1-Vaxx-inducerede antistoffers evne til at blokere PD-1/PD-L1-interaktionen.

PDL1-Vaxx kræftvaccinen er en ny B-celle peptidepitopvaccine med PD-L1 aminosyrer 130-147 bundet til det promiskuøse T-celle mæslingevirus fusion (MVF) peptid via en GPSL peptid linker. Prækliniske undersøgelser har vist, at PDL1-Vaxx er stærkt immunogen til stimulering af anticancerantistofproduktion i forskellige dyremodeller, forlænger overlevelsen og reducerer tumorbyrden14. Disse antistoffer genereret mod PD-L1-peptidet kan med succes blokere PD1 / PD-L1-interaktionen, hvilket resulterer i anti-neoplastisk aktivitet. Denne rapport introducerer et assay, der analyserer blokaden af PD1 / PD-L1-kompleksdannelse ved PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer ved hjælp af et magnetisk perlebaseret format med en dobbeltreporteraflæsning på et flowcytometriinstrument.

Protocol

1. Eksperimentel forberedelse

BEMÆRK: Detaljerne om alle de reagenser/udstyr, der er nævnt i dette trin, er angivet i materialetabellen.

  1. Få rekombinant human PD-1 (rhPD-1; polyhistidin-mærket). Rekonstituér frysetørret rhPD1 med sterilfiltreret fosfatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, før brug.
  2. Der opnås biotinyleret rekombinant human PD-L1 (rhPD-L1). Rekonstituér frysetørret rhPD-L1 med sterilt deioniseret vand før brug.
  3. Få streptavidin-konjugeret R-phycoerythrindetektionsreagens (SAPE). Opbevar alle SAPE-opløsninger, der er beskyttet mod lys ved køleskabstemperaturer (dvs. 2-8 °C).
  4. Få fluorescerende farvede magnetiske mikrosfærer (6,5 μm diameter, polystyren med indlejret magnetit) og perlekoblingssættet15 (hvis brugt, se materialetabellen). Kovalent kobling til mikrosfærerne kræver sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimid) og EDC (N-[3-dimethylaminopropyl]-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid).
    BEMÆRK: Magnetiske perlesæt fås med et hvilket som helst af 500 unikke fluorescerende tags, hvilket giver mulighed for identifikation og differentiering fra forskellige perlesæt16. Perler tilbydes i lagerkoncentrationer på 2,5 × 106 perler/ml og 12,5 × 106 perler/ml. Opbevar perlerne beskyttet mod lys ved køleskabstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Frys ikke perleophængene.
  5. Få positive og negative kontrolantistoffer og Brilliant Violet 421 (BV421)-mærkede sekundære detektionsantistoffer. Opbevar alle fluorescerende konjugerede molekyler, der er beskyttet mod lys.
  6. Udfør alle koblingsreaktioner i lavproteinbindingsrør og alle analysereaktioner i lavproteinbindings-, rundbundede, 96-brønds mikrotiterplader. Forsegl pladerne med engangsklæbefolie eller plastdæksler med 96 brønde mikroplader til analyseinkubationstrinnene. Brug en magnetisk pladeseparator til at immobilisere perlerne under analysevasketrinnene.
    BEMÆRK: Flowanalysesystemet med dobbelt reporter har tre lasere: (1) en, der identificerer og kvantificerer den perlesætspecifikke fluorescens (klassificeringskanal); (2) en, der detekterer og kvantificerer den målspecifikke phycoerythrin (PE) fluorescens (Reporter Channel 1; 532 nm excitation, "orange" 565-585 nm emission); og (3) en, der detekterer og kvantificerer den målspecifikke BV421-fluorescens af en anden målanalysand (Reporter Channel 2; 405 nm excitation, "blå" 421-441 nm emission).

2. Kobling af rhPD-1 til magnetiske perler

BEMÆRK: Det protein, der skal kobles, skal være fri for bovin serumalbumin (BSA), natriumazid, glycin, glycerol, tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) eller aminholdige additiver og skal suspenderes i PBS ved pH 7,4. Der findes et kommercielt koblingssæt, der indeholder alle de nødvendige reagenser og buffere, der er beskrevet heri (se materialetabellen).

  1. Alle koblingsreagenserne tages ud af køleskabet, og lad dem ekvilibrere til stuetemperatur (RT, 18-22 °C) i 20-30 min.
  2. Resuspender stammikrosfærerne ved kortvarigt at hvirvelstrømme, sonicere eller rotere (15 min ved 15-30 o / min) i henhold til produktdatabladet.
  3. Overfør 1 × 106 magnetiske perler til et 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør (se materialetabellen).
  4. Vask perler med 100 μL aktiveringsbuffer15: 0,1 MNaH2PO4 (monobasisk), pH 6,2.
    BEMÆRK: Kobling kan også udføres ved hjælp af et forudkonfigureret koblingssæt, som indeholder 0,1 M 2-morpholinoethansulfonsyre (MES), pH 6,0, som en alternativ aktiverings- og koblingsbuffer (se materialetabellen).
    1. Anbring røret med perlerne i en magnetisk separator i 1-2 min.
      BEMÆRK: Alternativt kan perlerne adskilles ved mikrocentrifugering ved ≥8.000 × g i 1-2 min.
    2. Supernatanten suges til med en pipette fra de magnetimmobiliserede eller pelleterede perler, mens røret stadig er placeret i magnetseparatoren.
    3. Fjern mikrocentrifugerøret fra magneten, og tilsæt 80 μL koblingsbuffer (se materialetabellen).
    4. Vortex reaktionsrøret forsigtigt og sonikere i 20 s for at sprede perlerne.
  5. Aktivér perlerne med sulfo-NHS og EDC.
    BEMÆRK: Stamopløsningen af sulfo-NHS er 50 mg/ml opløst i aktiveringsbuffer. Stamopløsningen af EDC er også 50 mg/ml opløst i aktiveringsbuffer. Både aktiveringsbufferen og fugtigheden i atmosfæren forårsager EDC-nedbrydning. Det anbefales ikke at bruge opbevaret EDC-opløsning. Lav lige nok frisk EDC-opløsning før trinnet, og brug den straks, når opløsningen er klar. Kassér overskydende EDC-opløsning.
    FORSIGTIG: EDC forårsager alvorlig øjenirritation og er irriterende for luftvejene og huden.
    1. Tilsæt 10 μL sulfo-NHS til mikrofugerøret, der indeholder de vaskede og aktiverede perler.
    2. Tilsæt 10 μL EDC-stamopløsning til mikrofugerøret, der indeholder perlerne og sulfo-NHS.
    3. Beskyt de lysfølsomme mikrosfærer mod lys, og drej på rotatoren i 20 minutter ved 15-30 o / min ved RT (18-22 °C). Alternativt kan røret forblive stationært under aktiveringstrinnet, hvis det forsigtigt hvirvles for at omfordele perlerne med 10 minutters mellemrum.
  6. Vask overskydende koblingsreagenser af perlerne.
    1. Anbring røret med de aktiverede perler i en magnetisk separator i 1-2 min.
    2. Supernatanten suges til med en pipette fra magnetimmobiliserede eller pelleterede perler, mens røret stadig er placeret i magnetseparatoren.
    3. Fjern mikrocentrifugerøret fra magneten, og tilsæt 100 μL aktiveringsbuffer.
    4. Vortex reaktionsrøret forsigtigt for at sprede perlerne.
    5. Gentag trin 2.6.1-2.6.4 yderligere to gange for i alt tre vaske. Efter vask ophænges perlerne i 100 μL aktiveringsbuffer i en koncentration på ca. 10 × 106 perler/ml.
  7. Par rhPD-1-peptidet til de aktiverede perler.
    1. Tilsæt 390 μL aktiveringsbuffer til røret, der indeholder de aktiverede perler, for at bringe det samlede perleophængsvolumen op på 490 μL.
    2. Der tilsættes 1 μg PD-1-peptid til den aktiverede perlesuspension ved at tilsætte 10 μL PD-1-peptidopløsning (1 mg/ml opløst i PBS) til røret indeholdende de aktiverede perler.
    3. Kort hvirvel mikrocentrifugerøret for ensartet fordeling af PD-1 og aktiverede perler.
    4. Perlerne inkuberes med PD-1 i 2 timer i mørke ved RT (18-22 °C) med rotation (15-30 omdr./min.).
  8. Vask perlerne to gange (2x) med Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).
    1. Anbring røret med de aktiverede perler i en magnetisk separator i 1-2 min.
    2. Supernatanten suges til med en pipette fra de magnetimmobiliserede eller pelleterede perler, mens røret stadig er placeret i magnetseparatoren.
    3. Fjern mikrocentrifugerøret fra magneten, og tilsæt 100 μL aktiveringsbuffer.
    4. Vortex reaktionsrøret forsigtigt for at sprede perlerne.
    5. Gentag trin 2.8.1-2.8.4 en ekstra gang for i alt to vaske. Efter vask suspenderes perlerne i 100 μL aktiveringsbuffer i en koncentration på 10 × 106 perler/ml.
      BEMÆRK: Assay/Wash-bufferen kan fremstilles uden natriumazid (konserveringsmiddel), hvis bufferen ikke også anvendes som lagringsmedium.
    6. Opbevar rhPD-1-koblede perler i mørke i køleskabet ved 2-8 °C, hvis de ikke anvendes straks. Proteinkoblede perler er stabile i op til 18 måneder.

3. Evaluering af vellykket rhPD-1-kobling til perlerne

BEMÆRK: De rhPD-1-koblede mikrosfærer omsættes med biotinyleret rhPD-L1, hvoraf sidstnævnte detekteres ved inkubation med SAPE efterfulgt af en vurdering af flowcytometeret. Dette verificerer både vellykket PD-1-kobling til magnetperlerne og også funktionel interaktion mellem rhPD-1- og rhPD-L1-proteinerne.

  1. Opret en dobbelt seriel fortyndingsserie af biotinyleret rhPD-L1 i PBS-TBN (stamopløsningen rhPD-L1 er 1 mg/ml). Det endelige rhPD-L1-koncentrationsområde, der skal testes, er en 8 μg/ml opløsning ned til en 313 pg/ml opløsning. Der oprettes 150 μL volumener af hver rhPD-L1-fortynding: 50 μL for hver reaktion og to reaktioner pr. tilstand plus tilstrækkelig overskridelse til at rumme pipetteringstab.
    1. Mærk rhPD-L1 fortyndingsmikrofugerørene som 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml, 0,063 μg/ml og 0,031 μg/ml. Et 0 μg/ml rør (kun PBS-TBN) fungerer som no-PD-L1-styring.
    2. Forindlæs 150 μL PBS-TBN til alle de mærkede rhPD-L1 fortyndingsrør.
      BEMÆRK: Den højeste endelige rhPD-L1-koncentration, der skal testes, er 8 μg / ml, og rhPD-L1 fortyndes 1: 1 ved tilsætning til reaktionsblandingen, så fortyndingsrøret mærket "8 μg / ml" henviser til den endelige koncentration og indeholder faktisk 16 μg / ml rhPD-L1. Etiketterne på alle fortyndingsrørene angiver den endelige rhPD-L1-koncentration efter tilsætning til reaktionen.
    3. Opret den højeste koncentration rhPD-L1-fortynding (16 μg/ml faktisk). Dette er en totrins, 62,5 gange fortynding af 1 mg/ml rhPD-L1 stamopløsning (1.000 μg/16 μg = 62,5).
      1. Der kombineres 84 μL PBS-TBN med 16 μL rhPD-L1 stamopløsning (1 mg/ml, dvs. 1.000 μL) i et mikrocentrifugeglas. Dette er en 6,25 gange fortynding, og den resulterende koncentration er 160 μg/ml rhPD-L1.
      2. I røret mærket "8 μg / ml" kombineres 270 μL PBS-TBN med 30 μL af rhPD-L1-fortyndingen oprettet i det foregående trin (160 μg / ml). Dette er en 10 gange fortynding, og den resulterende koncentration er faktisk 16 μg / ml. Røretiketten "8 μg/ml" henviser til dens endelige koncentration efter tilsætning af reaktionen.
    4. 150 μL af rhPD-L1-fortyndingen skabt i trin 3.1.3 ("8 μg/ml") overføres til "4 μg/ml"-røret, mikrocentrifugerørhætten lukkes og hvirvles kortvarigt for at blande opløsningen.
    5. Gentag trin 3.1.4 sekventielt, indtil rhPD-L1-fortyndingsserien er afsluttet. Efter fremstillingen skal alle rør mellem "8 μg/ml" til "0,063 μg/ml" samt 0 μg/ml kontrollen indeholde 150 μL opløsning, og det sidste rør, "0,031 μg/ml", skal indeholde 300 μL opløsning. Dette skaber et tilstrækkeligt volumen af hver fortynding til at teste 50 μL af hver biotinyleret rhPD-L1-fortynding i dobbeltreaktioner, med tilstrækkeligt overskud tilbage til at rumme pipetteringstab.
  2. Tæl rhPD-1-koblede perler ved hjælp af et hæmocytometer17.
  3. De rhPD-1-koblede stamperler fortyndes til 5 × 104 perler/ml med et volumen, der er tilstrækkeligt til 2.500 perler/50 μL/reaktion.
  4. Vortex 5 × 104 perler/ml rhPD-1-koblet perlesuspension og pipette 50 μL af suspensionen i hver mærket/kortlagt brønd i en 96-brønds rundbundet mikrotiterplade, så der oprettes duplikatbrønde for hver rhPD-L1-fortynding, der testes.
  5. Der tilsættes 50 μL af hvert biotinyleret rhPD-L1-fortyndingsrør, der er skabt i trin 3.1, til de relevante huller på mikrotiterpladen.
  6. Mikrotiterpladen dækkes med en engangsfolie eller plastklæbepladeforsegler, og pladen inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster (600 omdr./min.).
  7. Vask overskydende biotinyleret rhPD-L1 fra perlerne.
    1. Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    2. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, bekræft, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og deponer supernatanterne i en vask eller beholder med flydende affald ved biofarlig fare, alt efter hvad der er relevant. Bank forsigtigt, men hurtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirservietter for at fjerne den resterende supernatant.
    3. Mikrotiterpladen fjernes fra magnetpladeseparatoren, og der pipetteres 150 μL PBS-TBN i hvert hul.
    4. Placer den uforseglede plade på magnetseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    5. Det bekræftes, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, og vend pladen på hovedet, og supernatanterne hældes i en vask eller beholder med flydende affald ved biofarlig fare, alt efter hvad der er relevant. Bank forsigtigt, men hurtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirservietter for at fjerne den resterende supernatant.
  8. Vasketrin 3.7.3-3.7.5 gentages to gange for i alt tre vaske med hver 150 μL PBS-TBN. Sørg for, at der ikke er supernatant tilbage i hullerne ved afslutningen af det sidste vasketrin. Arbejd støt for at forhindre tørring af de immobiliserede perler på brøndbunden.
  9. Tilføj SAPE-detektionsreagens.
    1. SAPE-stamopløsningen fortyndes i PBS-TBN til en arbejdskoncentration på 6 μg/ml. Forbered et tilstrækkeligt SAPE-arbejdsløsningsvolumen, så alle reaktionsbrønde kan modtage 100 μL/brønd med tilstrækkeligt ekstra til at rumme pipetteringstab.
    2. Fjern mikrotiterpladen fra magnetpladeseparatoren.
    3. Tilsæt 100 μL SAPE-arbejdsløsning i hvert reaktionshul, og resuspender de vaskede perler ved pipettering.
    4. Mikrotiterpladen med 96 brønde forsegles med en folie- eller plastklæbepladeforsegler, og den inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min.
    5. Mikrotiterpladen fjernes fra inkubatoren, overføres til magnetpladeseparatoren for at immobilisere perlerne, den klæbende pladeforsegler fjernes, og perlerne vaskes tre gange med 150 μL PBS-TBN, som beskrevet i trin 3.7.3-3.7.5.
    6. Når den endelige vask er fjernet, fjernes pladen fra magnetpladeseparatoren, og perlerne resuspenderes i 100 μL PBS-TBN pr. hul.
  10. Analyser resultaterne.
    1. Aflæs pladen på flowanalyseinstrumentet (se materialetabellen) for at bestemme medianfluorescensintensiteten (MFI) for hver reaktion ved hjælp af følgende instrumentindstillinger: aspirationsvolumen = 50 μL; minimum perleantal = 100 perler; timeout-indstilling = 40 s; gating = 7.000-17.000; driftstilstand = Enkelt reporter. Duplikerede brønde køres for hver betingelse, og de to output-MFI-værdier for hver betingelse beregnes som gennemsnit, før der udføres yderligere databeregning og graftegning.
      BEMÆRK: MFI-værdien for hver fortynding skal vise koncentrationsafhængig binding, hvilket indikerer acceptabel rhPD-1-koblingseffektivitet til perlerne og bekræfter god interaktion mellem de rekombinante PD-1/PD-L1-proteiner.

4. PD-L1 magnetisk perlebaseret PD-1 / PD-L1 blokerende assay

BEMÆRK: Dette assay vurderer den blokerende aktivitet af opløselige mediatorer (fx anti-PDL1-peptidantistoffer) på rekombinante PD1/PD-L1-interaktioner. Kort fortalt præinkuberes biotinyleret rhPD-L1 med antistoffer genereret hos kaniner efter forskellige PDL1-Vaxx-peptidinokulationer. rhPD-L1 + anti-PDL1-antistofblandingen fanges derefter ved hjælp af rhPD-1-koblede magnetiske perler, og rhPD-L1-bindingen til de rhPD-1-koblede perler kvantificeres ved tilsætning af streptavidin-PE. PE-fluorescenssignalet korrelerer omvendt med blokeringsaktiviteten af de testede anti-PDL1-antistoffer/-hæmmere. Anti-PDL1-peptid-antistofbinding vurderes samtidigt ved binding af en BV421-koblet antikanin (for anti-PDL1-peptidantistoffer) eller anti-human (for kontrolantistoffer) sekundært antistof og ved evaluering af BV421-fluorescensen i instrumentets anden kanal. Analysetrinnene er billedligt beskrevet i figur 1.

  1. Der fremstilles en dobbelt seriel fortyndingsserie af testantistofferne, herunder PDL1-Vaxx-inducerede polyklonale antistofkandidater, et negativt kontrolantistof (trastuzumab, Herceptin, humaniseret anti-HER2 monoklonalt antistof) og et positivt kontrolantistof (atezolizumab; humaniseret anti-PDL1 IgG1 monoklonalt antistof). Hver reaktion vil bruge 25 μL af den tildelte antistoffortynding, så de viste volumener er tilstrækkelige til at udføre hver reaktion i dobbeltbrønde pr. tilstand (dvs. 50 μL pr. tilstand), med noget overskud tilbage til at rumme pipetteringstab.
    1. For hvert vaccineinduceret anti-PDL1-peptidantistof og kontrolantistof skal det sikres, at intervallet for de endelige antistofkoncentrationer, der testes, er fra 1.000 μg/ml ned til 8 μg/ml. Der fremstilles stamopløsninger af alle antistofferne ved 2.000 μg/ml.
    2. For hvert antistof mærkes fortyndingsglassene som 1.000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 63 μg/ml, 31 μg/ml, 16 μg/ml og 8 μg/ml, og antistofnavnet angives. For hvert antistof tilsættes også et "0 μg/ml"-rør, som vil være den eneste køretøjskontrol (PBS-TBN).
      BEMÆRK: Når der tilsættes reaktionsblandingen, fortyndes antistofkoncentrationen 1:1. Antistoffortyndingsrørene er mærket som den endelige antistofkoncentration efter tilsætning til reaktionen og indeholder faktisk dobbelt så meget antistof end mærket.
    3. Der tilsættes 75 μL PBS-TBN til alle antistoffortyndingsrør mærket "500 μg/ml" og derunder, inklusive "0 μg/ml" reagensglas kun til køretøjet.
    4. For hvert antistof pipetteres 150 μL af 2.000 μg/ml stamopløsning i det respektive rør mærket "1.000 μg/ml". Dette vil blive brugt til at lave alle de efterfølgende fortyndinger for hvert antistof.
    5. For hvert antistof oprettes en komplet fortyndingsserie ved pipetteoverførsel af 75 μL fra røret "1.000 μg/ml" til røret med den næste lavere fortynding i serien (dvs. "500 μg/ml"). Det nyligt færdigbyggede fortyndingsrør lukkes, hvirvles kortvarigt rundt, og fortyndingsserien fortsættes ved at overføre 75 μL fra røret "500 μg/ml" til røret "250 μg/ml". Dette mønster gentages, indtil den sidste fortynding, "8 μg/ml", er foretaget for alle antistofferne.
      BEMÆRK: I den færdige fortyndingsserie for hvert antistof skal der være et volumen på 75 μL for alle rørene undtagen den laveste fortynding, 8 μg/ml, som skal indeholde et volumen på 150 μL. Hver reaktion vil bruge 25 μL antistoffortynding, så disse volumener er tilstrækkelige til at udføre hver reaktion i dobbeltbrønde pr. tilstand (dvs. 50 μL pr. tilstand) med ekstra for at imødekomme pipetteringstab.
  2. 25 μL af de fortyndede antistoffer anbringes i de udpegede huller i en mikrotiterplade med 96 huller.
  3. Biotinyleret rhPD-L1 fortyndes til en arbejdskoncentration på 4 μg/ml i PBS-TBN i et volumen, der er tilstrækkeligt til at inkludere 25 μL i dobbeltbrønde pr. tilstand (dvs. 50 μL pr. tilstand), med ekstra for at tage højde for pipetteringstab.
    BEMÆRK: I dette arbejde resulterede biotinyleret rhPD-L1 ved 4 μg/ml i ca. 50% af det maksimale MFI-signal målt i den tidligere koblingsevaluering og blev brugt til PD-1/PD-L1-blokadeanalysen.
  4. Der tilsættes 25 μL biotinyleret rhPD-L1 (4 μg/ml) til hvert reaktionshul, mikrotiterpladen dækkes med en klæbeforsegling af folie eller plast, og der inkuberes ved RT (18-22 °C) i 1 time under omrystning på en orbitalpladeryster ved 600 omdr./min.
  5. De rhPD-1-koblede perler fortyndes til 50.000 perler/ml med et tilstrækkeligt volumen til 50 μL/brønd (2.500 perler/brønd) plus ekstra for at imødekomme pipetteringstab.
  6. Fjern mikrotiterreaktionspladen med 96 brønde fra rysteren, og fjern klæbepladeforseglingen.
  7. Der tilsættes 50 μL af rhPD-1-koblet perleblanding til hvert hul.
  8. Pladen forsegles, og der inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min.
  9. Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
  10. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og supernatanterne dumpes. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant.
  11. Vask overskydende reaktionsreagenser fra perlerne.
    1. Mikrotiterpladen fjernes fra magnetpladeseparatoren, og der tilsættes 150 μL PBS-TBN til hvert hul.
    2. Placer mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    3. Det kontrolleres, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, og vend pladen på hovedet, og supernatanterne dumpes. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant.
  12. Pladevasketrin 4.11.1-4.11.3 gentages to gange i alt tre vaske med PBS-TBN. Sørg for, at SAPE-reagenset er fremstillet (nedenfor), før du fjerner den sidste (tredje) vaskeopløsning.
  13. Tilføj SAPE-detekteringsreagenset.
    1. SAPE-stamopløsningen fortyndes til en arbejdskoncentration på 6 μg/ml i PBS-TBN; lav et tilstrækkeligt volumen til 100 μL/brønd plus ekstra for at imødekomme pipetteringstab.
    2. Der tilsættes 100 μL/hul SAPE-arbejdsløsning i hvert reaktionshul, og perlerne resuspenderes ved pipettering.
    3. Pladen forsegles, og der inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min.
  14. Dekanter overskydende SAPE fra reaktionen.
    1. Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    2. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne supernatanten med overskydende SAPE.
  15. Vask overskydende SAPE af perlerne.
    1. Fjern mikrotiterpladen fra magnetpladeholderen.
    2. Der tilsættes 150 μL PBS-TBN til hvert hul for at genopsuspendere perlerne.
    3. Placer mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    4. Kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant.
  16. Udfør yderligere to vasketrin med PBS-TBN i i alt tre vaske ved at gentage trin 4.15.1-4.15.4. Få BV421-kongugerede sekundære detektionsantistoffer klargjort (næste trin), før du fjerner den endelige (tredje) vaskeopløsning.
  17. Tilføj BV421-kongugerede sekundære antistoffer.
    1. Fortyndet BV421-kongugeret anti-human IgG (til påvisning af humaniserede kontrolantistoffer) og BV421-kongugerede anti-kanin IgG (til påvisning af PDL1-Vaxx-inducerede polyklonale antistoffer) (se materialetabellen) 1:400 i vaske-/analysebuffer ved volumener, der er tilstrækkelige til at bruge 100 μL/hul af hver, med ekstra til at rumme pipetteringstab.
    2. Der tilsættes 100 μL fortyndet BV421-konjugeret anti-human IgG eller BV421-konjugeret antikanin IgG til de relevante huller.
    3. Pladen forsegles, og der inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min.
  18. De overskydende BV421-konjugerede sekundære antistoffer dekanteres fra perlerne.
    1. Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    2. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade mod en pude af absorberende papirserviet for at fjerne supernatanten indeholdende overskydende BV421-konjugerede sekundære antistoffer.
  19. Vask de overskydende BV421-konjugerede sekundære antistoffer fra perlerne.
    1. Der tilsættes 150 μL PBS-TBN til hvert hul for at genopsuspendere perlerne.
    2. Placer mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne.
    3. Kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant.
  20. Udfør yderligere tre vasketrin med PBS-TBN i i alt fire vaske ved at gentage trin 4.19.1-4.19.3.
  21. Når den sidste (fjerde) vaskebuffer er fjernet, fjernes mikrotiterpladen fra magnetpladeseparatoren, og perlerne resuspenderes i 100 μL PBS-TBN/brønd med en pipetter.
  22. Analyser resultaterne.
    1. Læs pladen på dual-reporter flowanalysesystemet for at bestemme MFI for hver reaktion ved hjælp af følgende instrumentindstillinger: aspirationsvolumen = 50 μL; minimum perleantal = 100 perler; timeout-indstilling = 40 s; gating: 7.000-17.000; driftstilstand = Dual Reporter.
    2. Med dobbeltreportersystemet skal du sikre dig, at Reporter Channel 1 måler den orange PE-fluorescens (mængde rhPD-L1 bundet til rhPD-1-konjugerede perler) og Reporter Channel 2 måler den blå BV421-fluorescens (mængde vedhæftet blokerende antistof bundet til rhPD-L1).
    3. Kør dublerede brønde for hver betingelse, og gennemsnit de to output-MFI-værdier for hver betingelse, før du udfører yderligere databeregning og graftegning.
    4. Standardiser MFI-værdien for hver prøve til den negative kontrol, og beregn hæmningsprocenten for hver prøve:
      Hæmning% = (100 × [MFI for negativ kontrol - prøve MFI])/MFI for negativ kontrol
      BEMÆRK: MFI-værdierne for negativ kontrol (ingen hæmning) er de højeste værdier; det bundne PD-L1-signal MFI er 100%, og hæmningen af rhPD-L1-binding til rhPD-1 defineres som 0%.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over dobbeltreporteren PD-1/PD-L1 blokadeanalyse. Biotinyleret rekombinant humant PD-L1 (rhPD-L1) præinkuberes med udvalgte PDL1-Vaxx-inducerede anti-PDL1-antistoffer, før de kombineres med rhPD-1-koblede magnetiske perler for at tillade dannelse af PD-1/PD-L1 checkpoint-kompleks. Kompleksbundet rhPD-L1 detekteres derefter og markeres ved tilsætning af streptavidinkoblet phycoerythrin (SAPE, orange fluorofor). Antistoffer mod PDL1-Vaxx epitoper er rettet mod rhPD-L1, der er kompleksbundet til rhPD-1 forkoblet til de magnetiske perler, og de belyses ved hjælp af et strålende violet 421-konjugeret sekundært antistof (BV421, blå fluorofor). Både biotinyleret rhPD-L1, der er kompleksbundet til PD-1 (PE-signal) og anti-PDL1-antistoffer, der genkender og binder rhPD-L1 (BV421-signalet), analyseres samtidigt ved hjælp af et cytometrisk instrument med dobbeltreporterflow, der forhører prøver for begge fluoroforer i to separate reporterkanaler. Outputværdierne for hver prøve er medianfluorescensintensiteten for hver fluorofor. Inhiberingen af PD1/PD-L1-kompleksdannelse af forskellige PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer ekstrapoleres derefter ved at sammenligne de eksperimentelle signaler med dem, der genereres ved anvendelse af et negativt kontrolmonoklonalt antistof, der ikke binder rhPD-L1 (0% hæmning). Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Assayet var i stand til præcist at kvantificere hæmningen af PD-1 / PD-L1-interaktionen med fire unikke polyklonale antistoffer, genereret mod rhPD-L1-vaccinepeptiderne, der undersøges som potentielle kræftterapeutiske midler. Skemaet for dette assay er vist i figur 1. Mængden af biotinyleret rhPD-L1, der bandt til rhPD-1-konjugerede perler, og hæmningen af denne binding af de fire PLD1-Vaxx-inducerede antistofkandidater blev målt i Reporter Channel 1 ved hjælp af et streptavidin-PE-detektionsreagens, der direkte bandt rhPD-L1 (figur 2).

Alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer blokerede rhPD-L1-interaktionen med PD-1, der var blevet immobiliseret på mikrosfærer i varierende omfang. Hæmningsprocenten for de forskellige anti-PDL1-peptidantistoffer varierede fra 48 % til 74 % ved den maksimalt testede koncentration på 1.000 μg/ml. Det positive monoklonale kontrolantistof atezolizumab opnåede 92 % blokade af PD-1/PD-L1-interaktionen ved den maksimale testede koncentration14 på 4 μg/ml (figur 2). Alle de eksperimentelle PDL1-Vaxx-antistoffer viste koncentrationsafhængig hæmning af rhPD-L1-binding til rhPD-1-konjugerede perler sammenlignet med trastuzumab, det negative kontrolantistof, der ikke forventedes at interagere med PD-1/PD-L1-systemet.

Figure 2
Figur 2: Blokade af rhPD-L1-interaktion med rhPD-1 koblet til magnetiske perler af anti-PDL1-peptidantistoffer, som vist ved et nyt fluorescerende perlebaseret immunoassay. Rekombinant human PD-1 blev koblet til magnetiske mikrosfærer, og perlerne blev derefter inkuberet med biotinyleret rhPD-L1, der var blevet præinkuberet med forskellige anti-PDL1-peptidantistoffer. Et streptavidin-phycoerythrindetektionsreagens blev anvendt til at binde biotinet og dermed vurdere den relative mængde rhPD-L1, der var tilgængelig til at binde til PD-1. Polyklonale antistoffer rejst hos kaniner mod PDL1-peptidvaccinerne (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] og anti-PDL1[130]) blev testet for hæmmende aktivitet og viste 48%-74% blokade af rekombinante PD-1/PD-L1-interaktioner ved den højeste testede koncentration. Atezolizumab (et andet anti-PDL1 monoklonalt antistof) blev anvendt som den positive kontrol. Det ikke-relaterede kommercielle monoklonale antistof trastuzumab (anti-HER2) blev anvendt som en negativ kontrol. Denne figur er tilpasset fra Guo et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sammenlignende binding af forskellige PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer mod rhPD-L1 kompleksbundet til rhPD1-belagte magnetiske perler. Brilliant violet 421-konjugeret sekundært detektionsantistof blev brugt til at sammenligne bindingen af forskellige kaninpolyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer til rhPD-L1 via rhPD-1-coatede perler. BV421 blå fluorescenssignal blev optaget i Reporter Channel 2 i dobbeltreporterinstrumentet; dette signal korrelerer med den relative bindingseffektivitet af de eksperimentelle anti-PDL1-peptidantistoffer. Trastezumab (anti-HER2), et monoklonalt antistof, der er rettet mod et andet kontrolpunkt end PD-1 / PD-L1, blev brugt som en negativ kontrol. MFI repræsenterer den gennemsnitlige perlemedian fluorescensintensitet, som blev målt i dobbeltreaktionsbrønde pr. Tilstand. Denne figur er tilpasset fra Guo et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

De relative evner af de fire eksperimentelle PDL1-Vaxx-inducerede kandidatantistoffer til at binde rhPD-L1 blev sammenlignet ved hjælp af et separat detektionssystem (BV421-konjugeret anti-kanin IgG), der blev evalueret på instrumentets anden reporterkanal. Disse resultater indikerede, at alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer bundet til rhPD-L1 på en koncentrationsafhængig måde14 (figur 3). Anti-PDL1(130)-antistoffet viste det højeste rhPDL1-bindingssignal af de fire PDL1-Vaxx-inducerede antistofkandidater.

Discussion

Formålet med checkpoint-relateret cancerimmunterapi er at forstyrre interaktionen mellem checkpoint-proteiner og deres vigtige ligander i tumoroverlevelse og progression2. Denne forskergruppe udvikler aktivt nye PD-1- og PD-L1-vacciner, der fremkalder et antistofrespons, der er målrettet mod og afbryder PD-1 / PD-L1-kontrolpunktet 3,8,13,14. Tidligere blev to variationer af enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er) udført for at evaluere virkningerne af anti-PDL1-peptidantistoffer på hæmningen af den rekombinante PD1/PD-L1-interaktion14. (1) I den første variant blev rhPD-L1 overtrukket på en mikrotiterplade, og derefter blev pladen inkuberet med fortyndede anti-PDL1-vaccinekandidatinducerede antistoffer. Inhiberingen af antistoffernes rekombinante PD-1/PD-L1-interaktion blev derefter evalueret ved tilsætning af biotinyleret rhPD-1 og kvantificering af bindingen til det immobiliserede rhPD-L1 under anvendelse af et streptavidin-peberrodsperoxidasekonjugat og et kolorimetrisk substrat. Vi definerede dette som den direkte blokadeanalyse. (2) I den anden variant blev PD-1 belagt på mikrotiterpladen. Biotinyleret rhPD-L1 blev præinkuberet med hvert af de anti-PLD1 kandidatinducerede polyklonale antistoffer i separate reaktionsrør. RhPDL1/anti-PDL1-blandingerne blev derefter tilsat pladebrøndene indeholdende immobiliseret rhPD-1 og fik lov til at reagere. Enhver rhPDL1, der reagerede med den immobiliserede rhPD-1 i nærvær af de potentielt blokerende PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer, blev påvist med efterfølgende streptavidin-HRP og kolorimetrisk substratinkubation. Vi definerede dette som omvendt blokadeanalyse.

Den omvendte blokade af den rekombinante PD-1/PD-L1-interaktion med anti-PDL1-peptidantistoffer viste hæmning af signalet (dvs. PD-1/PD-L1-blokade) på en antistofkoncentrationsafhængig måde14, mens den direkte blokadetilgang ikke gav konsistente resultater (ikke vist). Det perlebaserede dual-reporter-blokadeassay blev udviklet for at verificere ELISA-resultaterne og undersøge blokaden af PD-1/PD-L1-interaktionen i en væskefase, hvilket eliminerer de potentielle problemer med sterisk hindring/bindingsepitoptilgængelighed forbundet med immobilisering af rekombinante proteiner på brøndbunden. Mikrosfæreanalysen var direkte korreleret med ELISA-blokeringsresultaterne ved anvendelse af omvendt blokadeanalyse (figur 2). Derudover kan fluorescensbaserede immunoassays give forbedret analysefølsomhed og et udvidet dynamisk område sammenlignet med kolorimetriske ELISA'er18, og yderligere tillader det multipleksede perlebaserede assay samtidig udførelse af to uafhængige immunoassays inden for en enkelt reaktion. Sulfo-NHS og EDC, der anvendes til kovalent kobling af mikrosfærerne til rhPD-1, kan have ført til de præstationsforskelle, der ses mellem de direkte blokade- og omvendte blokadeassays og de observerede forskelle i følsomhed mellem ELISA- og Luminex-perlebaserede rekombinante PD-1/PD-L1-interaktionsassays. Yderligere undersøgelse på kemisk og molekylært niveau er berettiget for at undersøge de mulige mekanismer, der er ansvarlige for disse forskelle.

Både ELISA14 og de perlebaserede assays viser, at PDL1-Vaxx-inducerede anti-PDL1-antistoffer kan hæmme PD1/PD-L1 checkpoint-kompleksdannelse. Den peptidbaserede PDL1-Vaxx inducerer med succes anti-PDL1-antistoffer, der kan blokere PD-1 / PD-L1-interaktionen. Denne tilgang kan tjene som en ny terapeutisk strategi til behandling af kræft, som understøttet af prækliniske dyreforsøg 3,13,14. Planlagte kliniske forsøg vil bestemme effekten af PDL1-Vaxx til checkpoint immunterapi og sygdomskontrol hos kræftpatienter.

Disclosures

Pravin T.P. Kaumaya er konsulent for Imugene, Ltd.

Acknowledgments

Forfatterne takker Sherry Dunbar PhD, MBA of Luminex Corporation (Austin, TX) for forskningsstøtte og Matthew Silverman PhD of Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for videnskabelig og skriftlig bistand. Dette arbejde blev støttet af priser til Pravin T. P. Kaumaya fra National Institutes of Health (R21 CA13508 og R01 CA84356) og Imugene Ltd, Sydney, Australien (OSU 900600, GR110567 og GR124326).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 Millipore/Sigma S3139
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 MilliporeSigma  M2933
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 77149
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: Luminex Corp.  (Austin, TX) 40-50016
EDC, 10 mg 
sNHS solution, 250 µL
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) Luminex Corp.  (Austin, TX) INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Low protein-binding round bottom 96-well plate ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 07-200-761
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)  Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0269-01
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0288-01
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp.  (Austin, TX) MC-1**** (varies by bead label)
Protein LoBind microcentrifuge tubes ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 022431081
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)
Biotinylated recombinant human PDL1  Sino Biological (Wayne, PA) 10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 709-675-149
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 711-675-152
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) Acro Biosystems (Newark, DE) PD1-H5256 
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) Agilent (Santa Clara, CA) PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
  2. Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).
  3. Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).
  4. Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
  5. Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
  6. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  7. Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
  8. Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
  9. Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
  10. Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
  11. Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
  12. Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
  13. Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).
  14. Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  18. Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019).

Tags

Magnetisk fluorescerende perle Dual-Reporter flowanalyse PDL1-Vaxx peptidvaccine Antistofblokade PD-1 / PD-L1-interaktion Checkpoint-receptorer Monoklonale antistoffer Kliniske forsøg Kræftpatienter Kræftimmunterapi Terapeutiske strategier B-cellepeptidepitop PDL1-kræftvaccine Præklinisk testning immunogene antistoffer tumorbyrde overlevelsesrater virkningsmekanismer magnetisk perlebaseret analyse
Magnetisk fluorescerende perlebaseret dual-reporter flowanalyse af PDL1-vaxx peptidvaccineinduceret antistofblokade af PD-1 / PD-L1-interaktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. … More

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. T. P. Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction. J. Vis. Exp. (197), e65467, doi:10.3791/65467 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter