Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Magnetisk fluorescerande pärlbaserad dubbelrapportörsflödesanalys av PDL1-vaxxpeptidvaccininducerad antikroppsblockad av PD-1/PD-L1-interaktionen

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65467
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Checkpointhämmare är viktiga måltavlor för att utveckla terapier för kampen mot cancer. Denna rapport introducerar ett nytt PDL1-peptidbaserat cancervaccin, PDL1-Vaxx, som inducerar neutraliserande polyklonal antikroppsproduktion som blockerar bildandet av PD-1/PDL1-komplex. Detta arbete beskriver också utvecklingen och testningen av en fluorescerande pärlbaserad analys för att analysera denna aktivitet.

Abstract

Hämning av checkpoint-receptorer (PD-1, PD-L1 och CTLA-4) med monoklonala antikroppar har visat stor nytta i kliniska prövningar för behandling av cancerpatienter och har blivit en grundpelare i modern cancerimmunterapi. Det är dock endast en undergrupp av patienterna som svarar på immunterapi med monoklonala antikroppar vid checkpoint. Därför är det angeläget att utveckla nya behandlingsstrategier mot cancer. Ett nytt B-cellspeptidepitop PDL1 (programmerad dödsligand 1) cancervaccin har utvecklats, med aminosyrorna 130-147 kopplade till MVF-peptiden ("promiskuöst" T-cellsmässlingvirusfusionsprotein) via en GPSL-länkare. Prekliniska tester har indikerat att detta PDL1-vaccin (PDL1-Vaxx) effektivt stimulerar högimmunogena antikroppar hos djur. Djur som immuniserats med PDL1-Vaxx visar minskad tumörbörda och förlängd överlevnad i olika djurcancermodeller. Verkningsmekanismerna indikerar att vaccininducerade antikroppar hämmar tumörcellsproliferation, inducerar apoptos och blockerar PD-1/PD-L1-interaktionen. Detta manuskript introducerar en magnetisk pärlbaserad analys som använder ett flödesanalyssystem med dubbla rapportörer för att utvärdera PD-1/PD-L1-interaktionen och dess blockad av anti-PDL1-antikropparna som rests mot PDL1-Vaxx.

Introduction

I immunsystemets T-celler, B-celler och intracellulära kontrollpunkter reglerar signalvägar immunaktiviteter. Vissa cancerceller skyddar sig mot immunattacker genom att stimulera checkpoint-mål, vilket hämmar immunfunktionen och främjar neoplastisk överlevnad och spridning. Onkologisk immunterapi genom checkpoint-hämning använder antikroppar för att rikta in sig på och blockera signalkontrollpunkterna och på så sätt återställa immunsystemets antineoplastiska funktioner 1,2,3. Mycket effektiva anti-cancerterapier inkluderar för närvarande de monoklonala antikropparna nivolumab, som riktar sig mot programmerat dödsprotein 1 (PD-1)4, och atezolizumab, som riktar sig mot programmerad dödsligand 1 (PD-L1)5. Detta tillvägagångssätt har visat stor klinisk framgång vid behandling av cancerpatienter. Den kliniska nyttan av nuvarande strategier för checkpointhämning mildras dock av biverkningar och behandlingsresistens, särskilt vid behandling med ett enda läkemedel6. Det finns ett akut behov av en kombination av immunterapi och effektivare behandlingsstrategier med lägre toxicitet vid cancerbehandling 1,3,6.

Under de senaste 30 åren har Dr. Kaumayas laboratorium utvecklat peptidcancervacciner och peptidhärmningsrelaterade medel för cancerterapi, varav några är i pågående kliniska prövningar 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Till exempel har B-Vaxx med HER-2 kombinationsimmunterapi visat patientnytta mot metastaserande och/eller återkommande solida tumörer i kliniska prövningar12. Laboratoriets senaste cancervacciner är PD1-Vaxx 2,13 och PDL1-Vaxx14 som har visat stora fördelar i prekliniska studier, särskilt vid kombinationsbehandling. PD1-Vaxx har genomfört kliniska studier med doseskalering i USA och Australien. PD1-Vaxx kommer att kombineras med atezolizumab i fas 1b-studien som startar i maj 2023. Denna rapport fokuserar på att utvärdera förmågan hos PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar att blockera PD-1/PD-L1-interaktionen.

Cancervaccinet PDL1-Vaxx är ett nytt B-cellspeptidepitopvaccin med PD-L1-aminosyrorna 130-147 kopplade till den promiskuösa T-cellspeptiden för mässlingvirus (MVF) via en GPSL-peptidlänkare. Prekliniska studier har visat att PDL1-Vaxx är mycket immunogent när det gäller att stimulera produktionen av antikroppar mot cancer i olika djurmodeller, förlänger överlevnaden och minskar tumörbördan14. Dessa antikroppar som genereras mot PD-L1-peptiden kan framgångsrikt blockera PD1/PD-L1-interaktionen, vilket resulterar i antineoplastisk aktivitet. Denna rapport introducerar en analys som analyserar blockaden av PD1/PD-L1-komplexbildning av PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar med hjälp av ett magnetiskt pärlbaserat format med en dubbelrapportörsavläsning på ett flödescytometriinstrument.

Protocol

1. Experimentell förberedelse

OBS: Detaljerna för alla reagenser/utrustning som nämns i detta steg listas i materialtabellen.

  1. Erhåll rekombinant human PD-1 (rhPD-1; polyhistidin-märkt). Lös upp frystorkad rhPD1 med sterilt filtrerad fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), pH 7,4, före användning.
  2. Erhåll biotinylerad rekombinant human PD-L1 (rhPD-L1). Bered frystorkat rhPD-L1 med sterilt avjoniserat vatten före användning.
  3. Erhåll streptavidin-konjugerat R-fykoerytrindetektionsreagens (SAPE). Förvara alla SAPE-lösningar skyddade från ljus i kylskåpstemperaturer (dvs. 2-8 °C).
  4. Skaffa fluorescerande färgade magnetiska mikrosfärer (6.5 μm diameter, polystyren med inbäddad magnetit) och pärlkopplingssatsen15 (om sådan används, se materialtabellen). Kovalent koppling till mikrosfärerna kräver sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimid) och EDC (N-[3-dimetylaminopropyl]-N′-etylkarbodiimidhydroklorid).
    OBS: Magnetiska pärluppsättningar finns tillgängliga med någon av 500 unika fluorescerande taggar, vilket möjliggör identifiering och differentiering från olika pärluppsättningar16. Pärlor erbjuds i lagerkoncentrationer på 2,5 × 106 pärlor/ml och 12,5 × 106 pärlor/ml. Förvara pärlorna skyddade från ljus i kylskåpstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Frys inte pärlupphängningarna.
  5. Erhåll positiva och negativa kontrollantikroppar och Brilliant Violet 421 (BV421)-märkta sekundära detektionsantikroppar. Förvara alla fluorescerande konjugerade molekyler skyddade från ljus.
  6. Utföra alla kopplingsreaktioner i lågproteinbindande rör och alla analysreaktioner i lågproteinbindande, rundbottnade, 96-håls mikrotiterplattor. Försegla plattorna med självhäftande engångsfolie eller 96-håls mikroplattlock av plast för analysinkubationsstegen. Använd en magnetisk plattseparator för att immobilisera pärlorna under analystvättstegen.
    OBS: Flödesanalyssystemet med dubbla rapportörer har tre lasrar: (1) en som identifierar och kvantifierar den pärluppsättningsspecifika fluorescensen (klassificeringskanal); (2) en som detekterar och kvantifierar den målspecifika fykoerytrinfluorescensen (PE) (Reporter Channel 1; 532 nm excitation, "orange" 565-585 nm emission); och (3) en som detekterar och kvantifierar den målspecifika BV421-fluorescensen hos en andra målanalyt (Reporter Channel 2; 405 nm excitation, "blå" 421-441 nm emission).

2. Koppling rhPD-1 till magnetiska pärlor

ANMÄRKNING: Proteinet som ska kopplas måste vara fritt från bovint serumalbumin (BSA), natriumazid, glycin, glycerol, tris(hydroximetyl)aminometan (Tris) eller amininnehållande tillsatser och bör suspenderas i PBS vid pH 7.4. En kommersiell kopplingssats finns tillgänglig som innehåller alla nödvändiga reagenser och buffertar som beskrivs häri (se materialtabellen).

  1. Ta ut alla kopplingsreagenser ur kylskåpet och låt dem komma i jämvikt till rumstemperatur (RT, 18-22 °C) i 20-30 minuter.
  2. Återsuspendera de vanliga mikrosfärerna genom att kortvarigt virvla, sonikera eller rotera (15 min vid 15-30 rpm), enligt produktinformationsbladet.
  3. Överför 1 × 106 magnetiska pärlor till ett 1.5 ml mikrocentrifugrör med låg proteinbindning (se materialtabellen).
  4. Tvätta pärlorna med 100 μL aktiveringsbuffert15: 0,1 M NaH2PO4 (monobasisk), pH 6,2.
    OBS: Koppling kan också utföras med en förkonfigurerad kopplingssats, som innehåller 0.1 M 2-morfolinoetansulfonsyra (MES), pH 6.0, som en alternativ aktiverings- och kopplingsbuffert (se materialtabellen).
    1. Placera röret med pärlorna i en magnetisk separator i 1-2 min.
      OBS: Alternativt kan pärlorna separeras genom mikrocentrifugering vid ≥8 000 × g i 1-2 minuter.
    2. Aspirera supernatanten med en pipett från de magnetimmobiliserade eller pelleterade kulorna med röret fortfarande placerat i den magnetiska separatorn.
    3. Ta bort mikrocentrifugröret från magneten och tillsätt 80 μL kopplingsbuffert (se materialtabellen).
    4. Virvla reaktionsröret försiktigt och sonikera i 20 s för att sprida pärlorna.
  5. Aktivera pärlorna med sulfo-NHS och EDC.
    OBS: Stamlösningen av sulfo-NHS är 50 mg/ml upplöst i aktiveringsbuffert. Stamlösningen av EDC är också 50 mg/ml upplöst i aktiveringsbuffert. Både aktiveringsbufferten och fukten i atmosfären orsakar EDC-nedbrytning. Det är inte tillrådligt att använda lagrad EDC-lösning. Gör precis tillräckligt med färsk EDC-lösning före steget och använd den omedelbart när lösningen är klar. Kassera överskottet av EDC-lösning.
    VARNING: EDC orsakar allvarlig ögonirritation och är irriterande för luftvägarna och huden.
    1. Tillsätt 10 μL sulfo-NHS till mikrofugeröret som innehåller de tvättade och aktiverade pärlorna.
    2. Tillsätt 10 μl stamlösning av EDC till mikrofugeröret som innehåller kulorna och sulfo-NHS.
    3. Skydda de ljuskänsliga mikrosfärerna från ljus och rotera på rotatorn i 20 minuter vid 15-30 rpm, vid RT (18-22 °C). Alternativt kan röret förbli stillastående under aktiveringssteget om det virvlas försiktigt för att omfördela pärlorna med 10 minuters intervall.
  6. Tvätta bort överflödiga kopplingsreagenser från pärlorna.
    1. Placera röret som innehåller de aktiverade pärlorna i en magnetisk separator i 1-2 minuter.
    2. Aspirera supernatanten med en pipett från magnetimmobiliserade eller pelleterade kulor med röret fortfarande placerat i den magnetiska separatorn.
    3. Ta bort mikrocentrifugröret från magneten och tillsätt 100 μL aktiveringsbuffert.
    4. Virvla reaktionsröret försiktigt för att sprida pärlorna.
    5. Upprepa steg 2.6.1-2.6.4 ytterligare två gånger för totalt tre tvättar. I slutet av tvätten kommer pärlorna att suspenderas i 100 μL aktiveringsbuffert vid en ungefärlig koncentration av 10 ×10 6 pärlor/ml.
  7. Koppla rhPD-1-peptiden till de aktiverade pärlorna.
    1. Tillsätt 390 μL aktiveringsbuffert till röret som innehåller de aktiverade pärlorna för att få upp den totala vulstsuspensionsvolymen till 490 μL.
    2. Tillsätt 1 μg PD-1-peptid till den aktiverade pärlsuspensionen genom att tillsätta 10 μL PD-1-peptidlösning (1 mg/ml löst i PBS) till röret som innehåller de aktiverade kulorna.
    3. Virvla mikrocentrifugröret kort för att jämnt fördela PD-1 och aktiverade pärlor.
    4. Inkubera pärlorna med PD-1 i 2 timmar i mörker vid RT (18-22 °C) med rotation (15-30 rpm).
  8. Tvätta pärlorna två gånger (2x) med Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1 % BSA + 0,05 % Tween-20 + 0,05 % NaN315).
    1. Placera röret som innehåller de aktiverade pärlorna i en magnetisk separator i 1-2 minuter.
    2. Aspirera supernatanten med en pipett från de magnetimmobiliserade eller pelleterade kulorna med röret fortfarande placerat i den magnetiska separatorn.
    3. Ta bort mikrocentrifugröret från magneten och tillsätt 100 μL aktiveringsbuffert.
    4. Virvla reaktionsröret försiktigt för att sprida pärlorna.
    5. Upprepa steg 2.8.1-2.8.4 ytterligare en gång för totalt två tvättar. I slutet av tvätten kommer pärlorna att suspenderas i 100 μL aktiveringsbuffert vid en koncentration av 10 × 106 pärlor/ml.
      OBS: Analys-/tvättbufferten kan tillverkas utan natriumazid (konserveringsmedel) om bufferten inte också används som lagringsmedium.
    6. Förvara de rhPD-1-kopplade pärlorna mörkt i kylskåp vid 2-8 °C om de inte används omedelbart. Proteinkopplade kulor är stabila i upp till 18 månader.

3. Utvärdering av framgångsrik rhPD-1-koppling till pärlorna

OBS: De rhPD-1-kopplade mikrosfärerna reageras med biotinylerad rhPD-L1, varav den senare detekteras genom inkubation med SAPE följt av en bedömning på flödescytometern. Detta verifierar både framgångsrik PD-1-koppling till de magnetiska kulorna och även funktionell interaktion mellan rhPD-1- och rhPD-L1-proteinerna.

  1. Skapa en tvåfaldig seriespädningsserie av biotinylerat rhPD-L1 i PBS-TBN (stamlösningen rhPD-L1 är 1 mg/ml). Det slutliga koncentrationsintervallet för rhPD-L1 som ska testas är en lösning på 8 μg/ml ner till en lösning på 313 pg/ml. Skapa 150 μL volymer av varje rhPD-L1-utspädning: 50 μL för varje reaktion och två reaktioner per tillstånd, plus tillräckligt med överskott för att ta hänsyn till pipetteringsförluster.
    1. Märk rhPD-L1 utspädningsmikrofugerören som 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.125 μg/ml, 0.063 μg/ml och 0.031 μg/ml. Ett 0 μg/ml rör (endast PBS-TBN) fungerar som kontroll utan PD-L1.
    2. Fyll på 150 μl PBS-TBN till alla märkta rhPD-L1-spädningsrör.
      OBS: Den högsta slutliga rhPD-L1-koncentrationen som ska testas är 8 μg/ml, och rhPD-L1 kommer att spädas 1:1 vid tillsats till reaktionsblandningen, så utspädningsröret märkt "8 μg/ml" hänvisar till den slutliga koncentrationen och innehåller faktiskt 16 μg/ml rhPD-L1. Etiketterna på alla spädningsrör anger den slutliga rhPD-L1-koncentrationen efter tillsats till reaktionen.
    3. Skapa den högsta koncentrationen av rhPD-L1-utspädning (16 μg/ml faktiskt). Detta är en 62,5-faldig spädning i två steg av stamlösningen rhPD-L1 med 1 mg/ml (1 000 μg/16 μg = 62,5).
      1. Blanda 84 μl PBS-TBN med 16 μl rhPD-L1 stamlösning (1 mg/ml, dvs. 1 000 μL) i ett mikrocentrifugrör. Detta är en 6,25-faldig utspädning och den erhållna koncentrationen är 160 μg/ml rhPD-L1.
      2. Kombinera 270 μl PBS-TBN med 30 μL rhPD-L1-utspädning (160 μg/ml) i röret märkt "8 μg/ml". Detta är en 10-faldig utspädning, och den resulterande koncentrationen är faktiskt 16 μg/ml. Röretiketten "8 μg/ml" hänvisar till dess slutliga koncentration efter tillsats till reaktionen.
    4. Överför 150 μl av rhPD-L1-utspädningen som skapades i steg 3.1.3 ("8 μg/ml") till "4 μg/ml"-röret, stäng mikrocentrifugrörets lock och virvla kort för att blanda lösningen.
    5. Upprepa steg 3.1.4 sekventiellt tills utspädningsserien rhPD-L1 är avslutad. Efter skapandet ska alla rör mellan "8 μg/ml" och "0,063 μg/ml", samt 0 μg/ml-kontrollen, innehålla 150 μl lösning, och det sista röret, "0,031 μg/ml", ska innehålla 300 μl lösning. Detta skapar en tillräcklig volym av varje utspädning för att testa 50 μL av varje biotinylerad rhPD-L1-utspädning i dubbla reaktioner, med tillräckligt med överskott kvar för att ta hänsyn till pipetteringsförluster.
  2. Räkna de rhPD-1-kopplade pärlorna med hjälp av en hemocytometer17.
  3. Späd de stamkopplade rhPD-1-kopplade pärlorna till 5 × 104 pärlor/ml, med en volym som är tillräcklig för 2 500 pärlor/50 μL/reaktion.
  4. Virvla den 5 × 104 pärlor/ml rhPD-1-kopplad pärlsuspension och pipettera 50 μL av suspensionen i varje märkt/mappad brunn i en 96-håls rundbottnad mikrotiterplatta så att det skapas dubbla brunnar för varje rhPD-L1-utspädning som testas.
  5. Tillsätt 50 μl av varje biotinylerat rhPD-L1-spädningsrör som skapades i steg 3.1 till lämpliga brunnar på mikrotiterplattan.
  6. Täck mikrotiterplattan med en engångsfolie eller självhäftande plastplattförseglare och inkubera plattan i 1 timme i mörker vid RT (18-22 °C) på en orbitalskakapparat (600 rpm).
  7. Tvätta överflödigt biotinylerat rhPD-L1 från pärlorna.
    1. Överför den förseglade plattan från orbitalshakern till magnetplattseparatorn i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    2. Ta försiktigt bort den självhäftande plattans förseglare, kontrollera att magneten och mikrotiterplattan sitter ordentligt ihop, vänd upp och ner på plattan och dumpa supernatanterna i ett handfat eller behållare för flytande avfall med biologisk risk, beroende på vad som är lämpligt. Knacka försiktigt men snabbt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort det kvarvarande supernatanten.
    3. Ta bort mikrotiterplattan från magnetplattans separator och pipettera 150 μL PBS-TBN i varje brunn.
    4. Placera den oförseglade plattan på den magnetiska separatorn i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    5. Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan sitter ordentligt ihop, vänd upp och ner på plattan och töm supernatanterna i ett handfat eller en behållare för flytande avfall med biologisk risk, beroende på vad som är lämpligt. Knacka försiktigt men snabbt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort det kvarvarande supernatanten.
  8. Upprepa tvättstegen 3.7.3-3.7.5 två gånger för totalt tre tvättar med 150 μL PBS-TBN vardera. Se till att ingen supernatant finns kvar i brunnarna i slutet av det sista tvättsteget. Arbeta stadigt för att förhindra torkning av de immobiliserade pärlorna på brunnsbottnarna.
  9. Tillsätt SAPE-detektionsreagens.
    1. Späd stamlösningen SAPE i PBS-TBN till en arbetskoncentration på 6 μg/ml. Bered en tillräcklig SAPE-arbetslösningsvolym så att alla reaktionsbrunnar kan ta emot 100 μL/brunn, med tillräckligt med extra för att ta emot pipetteringsförluster.
    2. Ta bort mikrotiterplattan från magnetplattans separator.
    3. Tillsätt 100 μl SAPE-arbetslösning i varje reaktionsbrunn och återsuspendera de tvättade pärlorna genom pipettering.
    4. Försegla 96-hålens mikrotiterplatta med en folie- eller plastförseglare och inkubera i 1 timme i mörker vid RT (18-22 °C) på en orbitalskaker vid 600 rpm.
    5. Ta bort mikrotiterplattan från inkubatorn, överför den till magnetplattseparatorn för att immobilisera pärlorna, ta bort den självhäftande plattans försegling och tvätta pärlorna tre gånger med 150 μL PBS-TBN, enligt beskrivningen i steg 3.7.3-3.7.5.
    6. Efter att ha tagit bort den sista tvätten, ta bort plattan från magnetplattans separator och återsuspendera pärlorna i 100 μL PBS-TBN per brunn.
  10. Analysera resultaten.
    1. Läs av plattan på flödesanalysinstrumentet (se materialtabellen) för att bestämma medianfluorescensintensiteten (MFI) för varje reaktion med hjälp av följande instrumentinställningar: aspirationsvolym = 50 μL; minsta antal pärlor = 100 pärlor; timeout-inställning = 40 s; grind = 7 000-17 000; driftläge = Enkel rapportör. Dubbla brunnar körs för varje tillstånd, och de två MFI-utgångsvärdena för varje tillstånd beräknas i genomsnitt innan ytterligare databeräkning och grafering utförs.
      OBS: MFI-värdet för varje spädning bör visa koncentrationsberoende bindning, vilket indikerar acceptabel rhPD-1-kopplingseffektivitet till kulorna och bekräftar god interaktion mellan de rekombinanta PD-1/PD-L1-proteinerna.

4. PD-L1 magnetisk pärlbaserad PD-1/PD-L1-blockerande analys

OBS: Denna analys bedömer den blockerande aktiviteten hos lösliga mediatorer (t.ex. anti-PDL1-peptidantikroppar) på rekombinanta PD1/PD-L1-interaktioner. Kortfattat är biotinylerad rhPD-L1 förinkuberad med antikroppar som genereras i kaniner efter olika PDL1-Vaxx-peptidinokuleringar. Blandningen av rhPD-L1 + anti-PDL1-antikroppar fångas sedan upp med hjälp av rhPD-1-kopplade magnetiska pärlor, och rhPD-L1-bindningen till de rhPD-1-kopplade kulorna kvantifieras genom tillsats av streptavidin-PE. PE-fluorescenssignalen korrelerar omvänt med blockeringsaktiviteten hos de testade anti-PDL1-antikropparna/hämmarna. Anti-PDL1-peptidantikroppsbindning bedöms samtidigt genom bindning av en BV421-kopplad anti-kanin (för anti-PDL1-peptidantikroppar) eller anti-human (för kontrollantikroppar) sekundär antikropp och genom att utvärdera BV421-fluorescensen i instrumentets andra kanal. Analysstegen beskrivs bildvis i figur 1.

  1. Bered en tvåfaldig serie av testantikropparna, inklusive PDL1-Vaxx-inducerade polyklonala antikroppskandidater, en negativ kontrollantikropp (trastuzumab, Herceptin, humaniserad anti-HER2 monoklonal antikropp) och en positiv kontrollantikropp (atezolizumab; humaniserad anti-PDL1 IgG1 monoklonal antikropp). Varje reaktion kommer att använda 25 μl av den tilldelade antikroppsutspädningen, så de visade volymerna är tillräckliga för att utföra varje reaktion i dubbla brunnar per tillstånd (dvs. 50 μL per tillstånd), med ett visst överskott kvar för att ta hänsyn till pipetteringsförluster.
    1. För varje vaccininducerad anti-PDL1-peptidantikropp och kontrollantikropp, se till att intervallet för de slutliga antikroppskoncentrationerna som testas är från 1 000 μg/ml ner till 8 μg/ml. Bered stamlösningar av alla antikroppar vid 2 000 μg/ml.
    2. För varje antikropp ska utspädningsrören märkas som 1 000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 63 μg/ml, 31 μg/ml, 16 μg/ml och 8 μg/ml och antikroppsnamn. För varje antikropp, tillsätt också ett "0 μg/ml"-rör, som kommer att vara endast fordonskontrollen (PBS-TBN).
      OBS: När antikroppskoncentrationen tillsätts till reaktionsblandningen kommer den att spädas ut 1:1. Antikroppsspädningsrören är märkta som den slutliga antikroppskoncentrationen efter tillsats till reaktionen och innehåller faktiskt dubbelt så mycket antikroppar än vad som anges.
    3. Tillsätt 75 μl PBS-TBN till alla antikroppsspädningsrör märkta "500 μg/ml" och lägre, inklusive "0 μg/ml"-kontrollrör som endast är avsedda för fordon.
    4. För varje antikropp pipetterar du 150 μl av stamlösningen på 2 000 μg/ml i respektive rör märkt "1 000 μg/ml". Detta kommer att användas för att göra alla efterföljande spädningar för varje antikropp.
    5. För varje antikropp skapas en komplett spädningsserie genom att med pipett överföra 75 μl från "1 000 μg/ml"-röret till röret med nästa lägre utspädning i serien (dvs. "500 μg/ml"). Stäng det nyligen färdigställda utspädningsröret, virvla det en kort stund och fortsätt konstruktionen av spädningsserien genom att överföra 75 μl från "500 μg/ml"-röret till "250 μg/ml"-röret. Upprepa detta mönster tills den sista spädningen, "8 μg/ml", har gjorts för alla antikroppar.
      Anmärkning: I den färdiga spädningsserien för varje antikropp bör det finnas en volym på 75 μL för alla rör utom den lägsta spädningen, 8 μg/ml, som bör innehålla en volym på 150 μL. Varje reaktion kommer att använda 25 μL antikroppsutspädning, så dessa volymer är tillräckliga för att utföra varje reaktion i dubbla brunnar per tillstånd (dvs. 50 μL per tillstånd), med extra för att hantera pipetteringsförluster.
  2. Placera 25 μl av de utspädda antikropparna i de avsedda brunnarna på en mikrotiterplatta med 96 brunnar.
  3. Späd biotinylerad rhPD-L1 till en arbetskoncentration på 4 μg/ml i PBS-TBN vid en volym som är tillräcklig för att inkludera 25 μL i dubbla brunnar per kondition (dvs. 50 μL per kondition), med extra för att ta hänsyn till pipetteringsförluster.
    OBS: I detta arbete resulterade biotinylerad rhPD-L1 vid 4 μg/ml i cirka 50 % av den maximala MFI-signalen som uppmättes i den tidigare kopplingsutvärderingen och användes för PD-1/PD-L1-blockadanalysen.
  4. Tillsätt 25 μl biotinylerat rhPD-L1 (4 μg/ml) till varje reaktionsbrunn, täck mikrotiterplattan med en självhäftande försegling av folie eller plast och inkubera vid RT (18–22 °C) i 1 timme under omskakning i orbitalplattskakare vid 600 varv per minut.
  5. Späd de rhPD-1-kopplade pärlorna till 50 000 pärlor/ml, med en tillräcklig volym för 50 μL/brunn (2 500 pärlor/brunn) plus extra för att hantera pipetteringsförluster.
  6. Ta bort 96-håls mikrotiterreaktionsplattan från shakern och ta bort den självhäftande plattans tätning.
  7. Tillsätt 50 μL av den rhPD-1-kopplade pärlblandningen till varje brunn.
  8. Försegla plattan och inkubera i 1 timme i mörker vid RT (18-22 °C) på en orbitalskakapparat vid 600 rpm.
  9. Överför den förseglade plattan från orbitalshakern till magnetplattseparatorn i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
  10. Ta försiktigt bort den självhäftande plattans förseglare, kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är ordentligt ihop, och vänd plattan och dumpa supernatanterna. Knacka försiktigt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort överflödigt supernatant.
  11. Tvätta bort överflödiga reaktionsreagenser från pärlorna.
    1. Ta bort mikrotiterplattan från magnetplattans separator och tillsätt 150 μl PBS-TBN till varje brunn.
    2. Placera mikrotiterplattan på magnetplattans separator i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    3. Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är ordentligt ihop, vänd upp och ner på plattan och dumpa supernatanterna. Knacka försiktigt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort överflödigt supernatant.
  12. Upprepa tvättstegen 4.11.1-4.11.3 två gånger, totalt tre tvättar med PBS-TBN. Se till att SAPE-reagenset är berett (nedan) innan du tar bort den sista (tredje) tvättlösningen.
  13. Tillsätt SAPE-detektionsreagenset.
    1. Späd stamlösningen av SAPE till en arbetskoncentration på 6 μg/ml i PBS-TBN. gör en tillräcklig volym för 100 μL/brunn, plus extra för att hantera pipetteringsförluster.
    2. Tillsätt 100 μl/brunn SAPE-arbetslösning i varje reaktionsbrunn och återsuspendera pärlorna genom pipettering.
    3. Försegla plattan och inkubera i 1 timme i mörker vid RT (18-22 °C) på en orbitalskakapparat vid 600 rpm.
  14. Dekantera överskottet av SAPE från reaktionen.
    1. Överför den förseglade plattan från orbitalshakern till magnetplattseparatorn i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    2. Ta försiktigt bort den självhäftande plattans förseglare, kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är ordentligt ihop, och vänd plattan och dumpa supernatanten. Knacka försiktigt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort supernatanten som innehåller överskott av SAPE.
  15. Tvätta bort överflödig SAPE från pärlorna.
    1. Ta bort mikrotiterplattan från magnetplatthållaren.
    2. Tillsätt 150 μl PBS-TBN till varje brunn för att återsuspendera pärlorna.
    3. Placera mikrotiterplattan på magnetplattans separator i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    4. Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan sitter ordentligt ihop, vänd upp och ner på plattan och dumpa supernatanten. Knacka försiktigt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort överflödigt supernatant.
  16. Utför ytterligare två tvättsteg med PBS-TBN för totalt tre tvättar genom att upprepa steg 4.15.1-4.15.4. Ha de BV421-kongugerade sekundära detektionsantikropparna förberedda (nästa steg) innan du avlägsnar den slutliga (tredje) tvättlösningen.
  17. Tillsätt de BV421-kongugerade sekundära antikropparna.
    1. Späd ut BV421-kongugerad anti-human IgG (för att detektera humaniserade kontrollantikroppar) och BV421-kongugerad anti-kanin-IgG (för att detektera PDL1-Vaxx-inducerade polyklonala antikroppar) (se materialtabellen) 1:400 i tvätt-/analysbuffert vid volymer som är tillräckliga för användning av 100 μL/brunn av varje, med extra för att hantera pipetteringsförluster.
    2. Tillsätt 100 μl utspätt BV421-konjugerat anti-humant IgG eller BV421-konjugerat anti-kanin-IgG till lämpliga brunnar.
    3. Försegla plattan och inkubera i 1 timme i mörker vid RT (18-22 °C) på en orbitalskakapparat vid 600 rpm.
  18. Dekantera överskottet av BV421-konjugerade sekundära antikroppar från kulorna.
    1. Överför den förseglade plattan från orbitalshakern till magnetplattseparatorn i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    2. Ta försiktigt bort den självhäftande plattans förseglare, kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är ordentligt ihop, och vänd plattan och dumpa supernatanten. Knacka försiktigt den inverterade plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att avlägsna supernatanten som innehåller överskott av BV421-konjugerade sekundära antikroppar.
  19. Tvätta bort överskottet av BV421-konjugerade sekundära antikroppar från kulorna.
    1. Tillsätt 150 μl PBS-TBN till varje brunn för att återsuspendera pärlorna.
    2. Placera mikrotiterplattan på magnetplattans separator i 2 minuter för att immobilisera pärlorna.
    3. Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan sitter ordentligt ihop, vänd upp och ner på plattan och dumpa supernatanten. Knacka försiktigt den uppochnedvända plattan mot en kudde av absorberande pappersvävnad för att ta bort överflödigt supernatant.
  20. Utför ytterligare tre tvättsteg med PBS-TBN för totalt fyra tvättar genom att upprepa steg 4.19.1-4.19.3.
  21. Efter att ha tagit bort den sista (fjärde) tvättbufferten, ta bort mikrotiterplattan från magnetplattans separator och återsuspendera pärlorna i 100 μL PBS-TBN/brunn med en pipett.
  22. Analysera resultaten.
    1. Läs av plattan på flödesanalyssystemet med dubbla rapportörer för att bestämma MFI för varje reaktion med hjälp av följande instrumentinställningar: aspirationsvolym = 50 μL; minsta antal pärlor = 100 pärlor; timeout-inställning = 40 s; gating: 7 000-17 000; driftläge = Dubbel rapportör.
    2. Med dual-reporter-systemet, se till att Reporter Channel 1 mäter den orange PE-fluorescensen (mängden rhPD-L1 fäst vid rhPD-1-konjugerade pärlor) och Reporter Channel 2 mäter den blå BV421-fluorescensen (mängden fäst blockerande antikropp bunden till rhPD-L1).
    3. Kör dubbla brunnar för varje tillstånd och beräkna medelvärdet av de två MFI-utgångsvärdena för varje tillstånd innan du utför ytterligare databeräkning och grafning.
    4. Standardisera MFI-värdet för varje prov till den negativa kontrollen och beräkna den procentuella hämningen för varje prov:
      Hämning% = (100 × [Negativ kontroll MFI − Prov MFI])/Negativ kontroll MFI
      OBS: De negativa kontroll-MFI-värdena (ingen hämning) är de högsta värdena; den bundna PD-L1-signalen MFI är 100 % och hämningen av rhPD-L1-bindning till rhPD-1 definieras som 0 %.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av PD-1/PD-L1-blockadanalysen med dubbla rapportörer. Biotinylerad rekombinant human PD-L1 (rhPD-L1) förinkuberas med utvalda PDL1-Vaxx-inducerade anti-PDL1-antikroppar innan de kombineras med rhPD-1-kopplade magnetiska kulor för att möjliggöra PD-1/PD-L1 checkpointkomplexbildning. Komplexbildad rhPD-L1 detekteras sedan och markeras genom tillsats av streptavidinkopplat fykoerytrin (SAPE, orange fluorofor). Antikroppar mot PDL1-Vaxx-epitoper riktar sig mot rhPD-L1 som har komplext till rhPD-1 förbundet till de magnetiska pärlorna, och de belyses med en Brilliant Violet 421-konjugerad sekundär antikropp (BV421, blå fluorofor). Både biotinylerade rhPD-L1 som är komplexbundna till PD-1 (PE-signal) och anti-PDL1-antikroppar som känner igen och binder rhPD-L1 (BV421-signalen) analyseras samtidigt med hjälp av ett flödescytometriskt instrument med dubbel reporter som undersöker prover för båda fluoroforerna i två separata reporterkanaler. Utgångsvärdena för varje prov är medianfluorescensintensiteten för varje fluorofor. Hämningen av PD1/PD-L1-komplexbildning av olika PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar extrapoleras sedan genom att jämföra de experimentella signalerna med de som genereras med en monoklonal antikropp med negativ kontroll som inte binder rhPD-L1 (0 % hämning). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representative Results

Analysen kunde exakt kvantifiera hämningen av PD-1/PD-L1-interaktionen av fyra unika polyklonala antikroppar, genererade mot rhPD-L1-vaccinpeptiderna, som undersöks som potentiella cancerterapeutiska medel. Schemat för denna analys finns i figur 1. Mängden biotinylerad rhPD-L1 som band till rhPD-1-konjugerade kulor och hämningen av denna bindning av de fyra PLD1-Vaxx-inducerade antikroppskandidaterna mättes i Reporter Channel 1 med hjälp av ett streptavidin-PE-detektionsreagens som direkt band rhPD-L1 (Figur 2).

Alla fyra polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar blockerade rhPD-L1-interaktionen med PD-1 som hade immobiliserats på mikrosfärer i varierande utsträckning. Den procentuella hämningen av de olika anti-PDL1-peptidantikropparna varierade från 48 % till 74 % vid den maximala testade koncentrationen på 1 000 μg/ml. Den monoklonala antikroppen atezolizumab med positiv kontroll uppnådde 92 % blockad av PD-1/PD-L1-interaktionen vid den högsta testade koncentrationen14 på 4 μg/ml (figur 2). Alla de experimentella PDL1-Vaxx-antikropparna visade koncentrationsberoende hämning av rhPD-L1-bindning till rhPD-1-konjugerade kulor jämfört med trastuzumab, den negativa kontrollantikroppen som inte förväntades interagera med PD-1/PD-L1-systemet.

Figure 2
Figur 2: Blockering av rhPD-L1-interaktion med rhPD-1 kopplad till magnetiska pärlor av anti-PDL1-peptidantikroppar, vilket visas av en ny fluorescerande pärlbaserad immunanalys. Rekombinant human PD-1 kopplades till magnetiska mikrosfärer, och kulorna inkuberades sedan med biotinylerad rhPD-L1 som hade förinkuberats med olika anti-PDL1-peptidantikroppar. Ett stektafektionsreagens för streptavidin-fykoerytrin användes för att binda biotinet och därmed bedöma den relativa mängden rhPD-L1 som var tillgänglig för att binda till PD-1. Polyklonala antikroppar upphöjda hos kaniner mot PDL1-peptidvaccinerna (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] och anti-PDL1[130]) testades för hämmande aktivitet och visade 48%-74% blockad av rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktioner vid den högsta testade koncentrationen. Atezolizumab (en annan monoklonal anti-PDL1-antikropp) användes som positiv kontroll. Den obesläktade kommersiella monoklonala antikroppen trastuzumab (anti-HER2) användes som negativ kontroll. Denna figur är hämtad från Guo et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Jämförande bindning av olika PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar till rhPD-L1-komplexerade till rhPD1-belagda magnetiska kulor. Briljantviolett 421-konjugerad sekundär detektionsantikropp användes för att jämföra bindningen av olika polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar från kanin till rhPD-L1 via rhPD-1-belagda kulor. Den blå fluorescenssignalen BV421 spelades in i Reporter Channel 2 på instrumentet med dubbla rapporter. Denna signal korrelerar med den relativa bindningseffektiviteten hos de experimentella anti-PDL1-peptidantikropparna. Trastezumab (anti-HER2), en monoklonal antikropp som riktar sig mot en annan kontrollpunkt än PD-1/PD-L1, användes som negativ kontroll. MFI representerar den genomsnittliga medianfluorescensintensiteten för pärlor, som uppmättes i dubbla reaktionsbrunnar per tillstånd. Denna figur är hämtad från Guo et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

De relativa förmågorna hos de fyra experimentella PDL1-Vaxx-inducerade kandidatantikropparna att binda rhPD-L1 jämfördes med hjälp av ett separat detektionssystem (BV421-konjugerat anti-kanin-IgG) som utvärderades på instrumentets andra reporterkanal. Dessa resultat indikerade att alla fyra polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar band till rhPD-L1 på ett koncentrationsberoende sätt14 (Figur 3). Anti-PDL1(130)-antikroppen uppvisade den högsta rhPDL1-bindningssignalen av de fyra PDL1-Vaxx-inducerade antikroppskandidaterna.

Discussion

Syftet med checkpoint-relaterad cancerimmunterapi är att störa interaktionen mellan checkpointproteiner och deras viktiga ligander i tumöröverlevnad och progression2. Denna forskargrupp utvecklar aktivt nya PD-1- och PD-L1-vacciner som framkallar ett antikroppssvar som riktar sig mot och avbryter PD-1/PD-L1 checkpoint 3,8,13,14. Tidigare har två varianter av enzymkopplade immunadsorberande analyser (ELISA) utförts för att utvärdera effekterna av anti-PDL1-peptidantikroppar på hämningen av den rekombinanta PD1/PD-L1-interaktionen14. (1) I den första varianten belades rhPD-L1 på en mikrotiterplatta, och sedan inkuberades plattan med utspädda anti-PDL1-vaccinkandidatinducerade antikroppar. Antikropparnas hämning av den rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktionen utvärderades sedan genom att tillsätta biotinylerad rhPD-1 och kvantifiera bindningen till den immobiliserade rhPD-L1 med hjälp av ett streptavidin-pepparrotsperoxidaskonjugat och ett kolorimetriskt substrat. Vi definierade detta som den direkta blockadanalysen. (2) I den andra varianten belades PD-1 på mikrotiterplattan. Biotinylerad rhPD-L1 förinkuberades med var och en av de anti-PLD1-inducerade polyklonala antikropparna i separata reaktionsrör. rhPDL1/anti-PDL1-blandningarna tillsattes sedan till plattbrunnarna som innehöll immobiliserad rhPD-1 och fick reagera. Alla rhPDL1 som reagerade med den immobiliserade rhPD-1 i närvaro av de potentiellt blockerande PDL1-Vaxx-inducerade antikropparna detekterades med efterföljande inkubation av streptavidin-HRP och kolorimetriskt substrat. Vi definierade detta som den omvända blockadanalysen.

Den omvända blockaden av den rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktionen av anti-PDL1-peptidantikroppar visade hämning av signalen (dvs. PD-1/PD-L1-blockad) på ett antikroppskoncentrationsberoende sätt14, medan den direkta blockadmetoden inte gav konsekventa resultat (visas inte). Den pärlbaserade blockadanalysen med dubbla rapportörer utvecklades för att verifiera ELISA-resultaten och för att undersöka blockaden av PD-1/PD-L1-interaktionen i en vätskefas, vilket eliminerar de potentiella steriska hindren/bindningsproblemen med epitoptillgänglighet i samband med immobilisering av rekombinanta proteiner på brunnsbottnar. Mikrosfäranalysen var direkt korrelerad till ELISA-blockeringsresultaten med hjälp av den omvända blockadanalysen (figur 2). Dessutom kan fluorescensbaserade immunanalyser ge förbättrad analyskänslighet och ett breddat dynamiskt omfång jämfört med kolorimetriska ELISAs18, och vidare möjliggör den multiplexerade pärlbaserade analysen samtidig prestanda för två oberoende immunanalyser inom en enda reaktion. Sulfo-NHS och EDC som användes för den kovalenta kopplingen av mikrosfärerna till rhPD-1 kan ha lett till de prestandaskillnader som sågs mellan direktblockaden och omvänd blockad och de observerade skillnaderna i känslighet mellan ELISA- och Luminex-pärlbaserade rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktionsanalyser. Ytterligare undersökningar på kemisk och molekylär nivå är motiverade för att studera de möjliga mekanismerna som är ansvariga för dessa skillnader.

Både ELISA14 och de pärlbaserade analyserna visar att PDL1-Vaxx-inducerade anti-PDL1-antikroppar kan hämma bildandet av PD1/PD-L1-checkpointkomplex. Den peptidbaserade PDL1-Vaxx inducerar framgångsrikt anti-PDL1-antikroppar som kan blockera PD-1/PD-L1-interaktionen. Detta tillvägagångssätt kan fungera som en ny terapeutisk strategi för behandling av cancer, vilket stöds av prekliniska djurstudier 3,13,14. Planerade kliniska prövningar kommer att fastställa effekten av PDL1-Vaxx för checkpoint-immunterapi och sjukdomskontroll hos cancerpatienter.

Disclosures

Pravin T.P. Kaumaya är konsult för Imugene, Ltd.

Acknowledgments

Författarna tackar Sherry Dunbar PhD, MBA från Luminex Corporation (Austin, TX) för forskningsstöd och Matthew Silverman PhD från Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) för vetenskaplig och skrivande hjälp. Detta arbete stöddes av utmärkelser till Pravin T. P. Kaumaya från National Institutes of Health (R21 CA13508 och R01 CA84356) och Imugene Ltd, Sydney, Australien (OSU 900600, GR110567 och GR124326).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 Millipore/Sigma S3139
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 MilliporeSigma  M2933
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 77149
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: Luminex Corp.  (Austin, TX) 40-50016
EDC, 10 mg 
sNHS solution, 250 µL
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) Luminex Corp.  (Austin, TX) INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Low protein-binding round bottom 96-well plate ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 07-200-761
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)  Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0269-01
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0288-01
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp.  (Austin, TX) MC-1**** (varies by bead label)
Protein LoBind microcentrifuge tubes ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 022431081
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)
Biotinylated recombinant human PDL1  Sino Biological (Wayne, PA) 10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 709-675-149
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 711-675-152
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) Acro Biosystems (Newark, DE) PD1-H5256 
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) Agilent (Santa Clara, CA) PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
  2. Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).
  3. Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).
  4. Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
  5. Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
  6. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  7. Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
  8. Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
  9. Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
  10. Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
  11. Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
  12. Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
  13. Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).
  14. Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  18. Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019).

Tags

Magnetisk fluorescerande pärla flödesanalys med dubbla rapporterare PDL1-Vaxx peptidvaccin antikroppsblockad PD-1/PD-L1-interaktion checkpointreceptorer monoklonala antikroppar kliniska prövningar cancerpatienter cancerimmunterapi terapeutiska strategier B-cellspeptidepitop PDL1-cancervaccin preklinisk testning immunogena antikroppar tumörbörda överlevnadsgrad verkningsmekanismer magnetisk pärlbaserad analys
Magnetisk fluorescerande pärlbaserad dubbelrapportörsflödesanalys av PDL1-vaxxpeptidvaccininducerad antikroppsblockad av PD-1/PD-L1-interaktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. … More

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. T. P. Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction. J. Vis. Exp. (197), e65467, doi:10.3791/65467 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter