Summary
Este protocolo se centra en la neovascularización corneal inducida por quemaduras alcalinas en ratones. El método genera un modelo de enfermedad corneal reproducible y controlable para estudiar la angiogénesis patológica y los mecanismos moleculares asociados y probar nuevos agentes farmacológicos para prevenir la neovascularización corneal.
Abstract
La neovascularización corneal (CoNV), una forma patológica de angiogénesis, implica el crecimiento de vasos sanguíneos y linfáticos en la córnea avascular desde el limbo y afecta negativamente la transparencia y la visión. La quemadura alcalina es una de las formas más comunes de traumatismo ocular que conduce a la CoNV. En este protocolo, la CoNV se induce experimentalmente utilizando una solución de hidróxido de sodio de forma controlada para garantizar la reproducibilidad. El modelo de quemaduras alcalinas es útil para comprender la patología de la CoNV y puede extenderse para estudiar la angiogénesis en general debido a la avascularidad, transparencia y accesibilidad de la córnea. En este trabajo, la CoNV se analizó mediante examen directo bajo un microscopio de disección y mediante inmunotinción de córneas de montaje plano utilizando mAb anti-CD31. La linfangiogénesis se detectó en córneas de montaje plano mediante inmunotinción con mAb anti-LYVE-1. El edema corneal se visualizó y cuantificó mediante tomografía de coherencia óptica (OCT). En resumen, este modelo ayudará a avanzar en los ensayos de neovascularización existentes y a descubrir nuevas estrategias de tratamiento para la angiogénesis ocular y extraocular patológica.
Introduction
La córnea es un tejido avascular que mantiene su transparencia estableciendo un privilegio angiogénico 1,2. El daño a la córnea puede provocar inflamación y el desarrollo de vasos sanguíneos y linfáticos, así como fibrosis3. La neovascularización corneal (CoNV) conduce a la discapacidad visual y es la segunda causa de ceguera en todo el mundo4. La CoNV afecta a alrededor de 1.4 millones de personas en los Estados Unidos por año5. La CoNV puede ser inducida por varios factores, incluyendo quemaduras químicas, infecciones, inflamación e hipoxia 3,6. Las quemaduras químicas son una de las emergencias oculares más comunes, y representan alrededor del 13,2% de los traumatismos oculares y requieren evaluación y tratamientoinmediatos 7. Las quemaduras químicas pueden ser quemaduras alcalinas o ácidas, pero las quemaduras alcalinas causan lesiones más graves, ya que el álcali penetra más profundamente enel tejido.
Los modelos de ratón de quemaduras alcalinas se utilizan ampliamente para estudiar la CoNV y la cicatrización de heridas. En comparación con el modelo de angiogénesis de bolsa corneal 9,10, los modelos de quemaduras alcalinas son relativamente sencillos de crear y también se pueden utilizar para estudiar la inflamación corneal, la fibrosis y la proliferación epitelial. Estos modelos también están más estrechamente relacionados con las quemaduras químicas clínicas que los modelos de sutura corneal de angiogénesis11. Con la quemadura alcalina, la córnea avascular desarrolla vasos sanguíneos debido a la inflamación y a un desequilibrio en los factores antiangiogénicos y proangiogénicos 1,2. Los inconvenientes de los modelos de quemaduras alcalinas corneales son las dificultades para controlar el área y la gravedad de la quemadura alcalina, la variación en la neovascularización corneal y la quema involuntaria de los tejidos adyacentes debido al exceso de solución alcalina. El propósito de este estudio es describir un modelo controlado de quemadura alcalina corneal en ratones utilizando papel de filtro previamente empapado en solución de hidróxido de sodio. Este modelo podría utilizarse para estudiar factores angiogénicos, reactivos terapéuticos antiangiogénicos y otros factores y reactivos que podrían modular la inflamación y la fibrosis.
Protocol
Todo el trabajo con animales, incluidos los procedimientos experimentales y la eutanasia, fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Baylor College of Medicine con el número de protocolo AN-8790.
1. Preparación de NaOH 1 N
- Agregue 4 ml de agua desionizada estéril a un tubo de centrífuga de 15 ml. Pesa 400 mg de hidróxido de sodio (NaOH) y agrégalos al tubo con cuidado.
- Disuelva el NaOH agitando lentamente la solución con una varilla de vidrio. Aumente el volumen a 10 ml agregando agua desionizada estéril al tubo y mezcle nuevamente invirtiendo suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo. Cierre bien la tapa y guarde la solución a temperatura ambiente.
- Prepare la solución fresca todos los meses porque la concentración de la solución de NaOH puede reducirse si la solución absorbe dióxido de carbono en el aire.
- Mezcle siempre suavemente la solución de NaOH antes de usarla.
PRECAUCIÓN: Prepare la solución dentro de una cubierta química y use el equipo de protección personal (EPP) adecuado.
2. Preparación de la solución de paraformaldehído (PFA) al 4%
- Agregue 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a un vaso de precipitados de vidrio. Pesa 4 g de paraformaldehído (PFA) y añádelo al vaso de precipitados.
- Mantener el vaso de precipitados en una placa calefactora a 60 °C agitando. Agregue la solución de NaOH 1 N gota a gota para elevar el pH hasta que la solución se aclare.
- Verifique y ajuste el pH a 7.4 usando ácido clorhídrico (HCl) 1 N. Ajuste el volumen final a 50 ml con 1x PBS.
- Enfríe y filtre la solución. Almacenar la solución a 4 °C.
PRECAUCIÓN: Prepare la solución en una campana extractora mientras usa el EPP adecuado.
3. Preparación del cóctel de ketamina y xilacina
- Prepare el cóctel de ketamina/xilacina añadiendo 0,8 ml de ketamina (concentración de stock: 100 mg/mL) y 0,16 mL de xilacina (concentración de stock: 100 mg/mL) a 9,4 mL de solución salina.
- Guarde el cóctel en frascos de inyección estériles a temperatura ambiente (RT).
4. Quemadura alcalina en la córnea del ratón
- Inyecte meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea 30 minutos antes del procedimiento para aliviar el dolor. Anestesiar a los ratones (C57BL/6J, 6-8 semanas de edad, machos) mediante una inyección i.p. del cóctel ketamina/xilacina (ketamina 80 mg/kg y xilacina 16 mg/kg de peso corporal).
- Compruebe la respuesta refleja (retirada del pedal) pellizcando los dedos del ratón y confirme la ausencia del reflejo. Aplique una gota de anestésico tópico, proparacaína al 0,5%, en la superficie corneal de un ojo y una gota de lágrimas artificiales en el otro ojo.
- Con un punzón de biopsia de 2 mm, perfore los discos de papel de filtro Whatman.
- Agregue 2 μL de NaOH 1N a una placa de Petri limpia. Coloque el disco de papel de filtro de 2 mm sobre la gota de NaOH 1 N y déjelo en remojo durante 15 s.
- Tome el papel de filtro con pinzas y aplique el papel de filtro en el ojo tratado con proparacaína en el centro de la córnea durante 30 segundos.
NOTA: El papel de filtro debe tocar solo el centro de la córnea, y se debe tener cuidado de evitar el movimiento del papel de filtro una vez colocado, ya que mover el papel de filtro puede causar quemaduras en los tejidos adyacentes. - Lávese el ojo enjuagándolo con 20 ml de solución salina estéril en una jeringa estéril.
NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que la córnea, junto con el saco conjuntival, se lave a fondo para garantizar que no se dañe más la córnea o el tejido circundante. Lavar el saco conjuntival prevendrá aún más el sínbler. - Limpie suavemente el exceso de solución salina de los ojos y el área circundante con toallitas suaves desechables. Después, mantenga a los ratones en una jaula de recuperación sobre una almohadilla térmica tibia hasta que deambulen.
NOTA: Los ratones se monitorean diariamente después de la quemadura alcalina durante 3 días. Si se observan síntomas de dolor o estrés, se administra meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea.
5. Examen y evaluación de la neovascularización y opacidad
- En ratones anestesiados, examinar los ojos bajo un microscopio de disección el día 10 después de la quemadura, y obtener imágenes utilizando una cámara conectada al telescopio de disección para puntuar la opacidad y la neovascularización.
NOTA: Un endoscopio de disección normal con una cámara acoplada es suficiente. - Mientras observa la córnea a través del microscopio de disección, puntúe la opacidad después de la quemadura en función de la siguiente escala12:
0 = Sin opacidad; córnea transparente
1 = Opacidad leve; ligera opacidad en las áreas del iris y la pupila; iris y pupila fácilmente visibles
2 = Opacidad moderada; iris y pupila apenas visibles
3 = Opacidad severa; iris o pupila no visibles
4 = Córnea opaca; iris y pupila no visibles - Mientras observa la córnea a través del microscopio de disección, puntúe la CoNV en función de la siguiente escala12:
0 = Sin neovascularización; No hay nuevos vasos del limbo
1 = Neovascularización leve; Nuevos vasos que se originan en el limbo
2 = Neovascularización moderada; Los vasos sanguíneos se originaron en el limbo y crecieron hacia el centro de la córnea
3 = Neovascularización grave; vasos sanguíneos que se originan en el limbo y alcanzan y/o cruzan el centro de la córnea - Utilice una prueba t de Student para comparar estadísticamente las puntuaciones de opacidad y neovascularización entre los grupos de quemaduras alcalinas y ojos sanos.
- Eutanasiar a los ratones el día 10 mediante la exposición al isoflurano al 5% hasta 1 minuto después de que se detenga la respiración, seguida de una dislocación cervical, y recolectar las córneas para obtener imágenes de montaje plano.
6. Imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT)
- Tome imágenes OCT del segmento anterior de los ojos en ratones anestesiados el día 10 después de la quemadura. Realice la adquisición de imágenes OCT como un escaneo de volumen utilizando el modo IR + OCT con un campo de visión de 30° y una intensidad IR del 100 %.
- Cuantifique el grosor de las córneas con el software ImageJ.
- Para medir el grosor, utilice la herramienta Selección de líneas del software ImageJ para crear una línea recta entre las superficies anterior y posterior en la córnea central.
- Haga clic en Analizar > medir en las herramientas de software para transferir los valores a la ventana de datos.
- Copie los valores en un archivo de hoja de cálculo y compare estadísticamente el grosor de la córnea entre la quemadura alcalina y los grupos de ojos sanos utilizando una prueba t de Student.
NOTA: El grosor de la córnea es la distancia desde un punto en la superficie corneal anterior hasta el punto más cercano en la superficie corneal posterior en el centro de la córnea.
7. Inmunotinción para CoNV en córneas de montaje plano
- Sacrificar a los ratones el día 10 después de la quemadura alcalina y enuclear los ojos mediante disección roma.
- Separe los párpados con los dedos pulgar e índice, y coloque pinzas debajo del globo ocular. Cierre las pinzas y retire suavemente el globo ocular de la órbita.
- Coloque los globos oculares en 1x PBS. Para cada globo ocular, retire la córnea del globo ocular haciendo primero una incisión con una aguja de 30 G por debajo del área del limbo.
- Corta alrededor de la zona del limbo con unas microtijeras corneales, con la incisión como punto de partida, y separa lentamente la córnea y el limbo del globo.
- Limpie las córneas suavemente con un pincel fino para eliminar el iris. Fijar las córneas en paraformaldehído al 4% durante 1 h.
- Lave las córneas tres veces durante 20 minutos cada una en 1x PBS a temperatura ambiente (RT).
- Incubar en un tampón de bloqueo (1x PBS suplementado con 0,1% de Triton-X 100 y 5% de albúmina sérica bovina [BSA]) durante 1 h a RT.
- Transfiera las córneas a una solución de anticuerpos que contenga anticuerpos primarios. Prepare la solución de anticuerpos en 1x PBS suplementado con BSA al 1 %, Triton-X 100 al 0,1 %, AcM anti-CD31 conjugado con Dylight550 (1:100) y AcM anti-LYVE-1 conjugado con Alexa Fluor488 (1:100).
- Incubar durante 3 días a 4 °C. Lave las córneas en 1x PBS tres veces durante 20 minutos cada una.
- Tiñir los núcleos con solución de tinción de Hoechst (1:1.000) durante 5 min en la oscuridad.
- Aplana las córneas con cortes radiales y móntalas en un portaobjetos de vidrio previamente limpiado con medio de montaje y cubreobjetos. Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y seque los portaobjetos durante la noche en la oscuridad antes de analizarlos con microscopía confocal.
- Obtener imágenes de las córneas de montaje plano mediante microscopía confocal mediante la unión de imágenes individuales de la pila Z; Utilice un objetivo de 10x, láseres de 488 nm y 561 nm, y una resolución de 512 píxeles x 512 píxeles por corte en escáneres Galvano no resonantes.
- Cuantifique la densidad de la sangre CD31+ y de los vasos linfáticos LYVE-1+ utilizando el software ImageJ.
- Para determinar la densidad vascular, convierta las imágenes confocales en una imagen de 8 bits.
- Elija Densidad vascular en los complementos.
- Elija la región de interés en la imagen y haga clic en Aceptar. Las mediciones se abrirán en una nueva ventana de datos.
- Copie los valores en un archivo de hoja de cálculo y compare estadísticamente la densidad vascular entre los grupos de quemaduras alcalinas y ojos sanos mediante una prueba t de Student.
NOTA: CD31, también llamada molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM-1), es una molécula de adhesión celular involucrada en la angiogénesis y está altamente expresada en las células endoteliales de los vasos sanguíneos tempranos y maduros13. LYVE-1 (receptor de hialuronano endotelial de vasos linfáticos-1) es un marcador de superficie celular en las células endoteliales linfáticas y puede utilizarse como marcador de linfangiogénesis14.
Representative Results
Este estudio describe un método para inducir la angiogénesis corneal en el ojo del ratón por quemadura alcalina. Las imágenes obtenidas con el microscopio de disección (Figura 1A,B) demostraron puntuaciones de neovascularización y opacidad significativamente elevadas en las córneas en el grupo de quemaduras alcalinas (P < 0,05; Figura 1C,D). Las córneas que se recolectaron el día 10 se inmunotiñeron adicionalmente con mAb anti-CD31 para los vasos sanguíneos y mAb anti-LYVE-1 para los vasos linfáticos, respectivamente (Figura 2A-I). El grupo de quemaduras alcalinas mostró densidades significativamente más altas de vasos sanguíneos y linfáticos después de 10 días (P < 0,001 y P < 0,05, respectivamente; Figura 2J,K). Se observó que el grosor de la córnea, tal como se visualizó y cuantificó mediante OCT (Figura 3A,B), fue significativamente mayor en el grupo con quemadura alcalina (P < 0,01; Figura 3C).
Figura 1: Neovascularización y opacidad corneal inducida por quemaduras alcalinas. (A,B) La neovascularización corneal brotó de los vasos del limbo hacia el centro de la córnea en el ojo de ratón (A) quemado por álcali (B), pero no en el ojo sano 10 días después de la lesión. (C,D) Cuantificación de la (C) neovascularización corneal y (D) opacidad en los paneles A y B (± SEM; prueba t; *P < 0,05; n = 3 ojos, 1 ojo/ratón). Las flechas rojas representan el limbo, y la flecha amarilla indica el brote de nuevos vasos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Neovascularización corneal y linfangiogénesis causada por quemadura alcalina. La inmunohistoquímica reveló vasos sanguíneos (A,D,G) y linfáticos (B,E,H) utilizando los anticuerpos monoclonales anti-CD31 y anti-LYVE-1, respectivamente. (A-C) La córnea de ratón sana. (D-I) La córnea quemada con álcali 10 días después de la lesión. (C, F, I) Imágenes superpuestas de señales CD31 y LYVE-1. (G-I) Imágenes ampliadas para paneles D-F. Barras de escala = (A-F) 200 μm y (G-I) 500 μm. (J,K) Cuantificación de la densidad de vasos sanguíneos y linfáticos en paneles A-F, como se indica (± SEM; prueba t; *P < 0,05; ***P < 0,001; n = 3 ojos, 1 ojo/ratón). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aumento del grosor de la córnea causado por quemaduras alcalinas . (A) Una imagen OCT de un ojo de ratón sano. (B) Una imagen OCT de la córnea del ratón 10 días después de la quemadura alcalina. (C) Cuantificación del espesor corneal en los paneles A y B, medido en el centro de la córnea (± SEM; prueba t; **P < 0,01; n = 3 ojos, 1 ojo/ratón). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La córnea es un tejido excelente para el estudio de la angiogénesis y la inflamación, ya que es accesible y avascular, lo que significa que la neovascularización puede detectarse y documentarse convenientemente. La quemadura corneal en conejos, ratas y ratones se ha utilizado para estudiar la angiogénesis corneal, la inflamación y la opacidad, la ulceración, la perforación de la córnea y la fibrosis15,16,17. Además, el modelo murino de quemadura corneal es valioso para probar diversas estrategias terapéuticas para la angiogénesis y la inflamación, ya que los ratones tienen un sistema inmune estrechamente relacionado con el de los humanos18. La disponibilidad de técnicas para manipular genéticamente el genoma del ratón también hace que la especie sea una excelente opción para este tipo de estudio19. El reto de esta investigación ha sido desarrollar un método de quemadura corneal que proporcione una fisiopatología consistente y reproducible.
El modelo de quemaduras alcalinas es particularmente útil para el cribado farmacológico de fármacos que modulan la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis. Los requisitos mínimos de reactivos y recursos, la simplicidad de realizar la quema alcalina y los beneficios de la corta duración del protocolo y la observación directa de los resultados hacen que la quemadura alcalina en la córnea del ratón sea una opción primaria para el cribado farmacológico de fármacos. Sin embargo, se deben tener en cuenta algunas precauciones al realizar este procedimiento para garantizar la consistencia y la reproducibilidad. En primer lugar, el papel de filtro debe colocarse en el centro de la córnea para evitar quemar otras zonas del ojo, especialmente el limbo, los párpados y la conjuntiva; en segundo lugar, el volumen y la concentración de NaOH deben ser apropiados para obtener resultados consistentes de la quemadura alcalina en la córnea. El filtro no debe estar mojado, sino que debe haber sido empapado en la solución de NaOH. El tamaño y el tipo de filtro, así como la normalidad y el volumen de la solución utilizada en este método, se optimizan para evitar un desbordamiento de NaOH. El uso de un papel de filtro de diferente tamaño o un volumen mayor o menor de NaOH provocaría inconsistencias en la neovascularización. En tercer lugar, es importante evitar que la solución de NaOH absorbaCO2 en el aire de la habitación apretando inmediatamente la tapa del tubo de la solución después de su uso y reduciendo la relación aire/solución. Se debe tener cuidado de utilizar soluciones alcalinas frescas para evitar inconsistencias en la neovascularización y evitar la ulceración corneal. Por último, es necesario lavar extensamente toda la solución de NaOH del ojo y la conjuntiva con solución salina para evitar un mayor daño a la córnea y a los tejidos circundantes del ojo. El lavado minucioso de la córnea y los tejidos adyacentes también evitará el sinflarón.
El protocolo aquí descrito es un método eficaz y fiable para estudiar la fisiopatología de la angiogénesis corneal. Este protocolo se puede utilizar además para estudiar la inflamación de la córnea, la fibrosis y la cicatrización de heridas.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Corporación Benéfica SRB, los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) P30EY002520 y una subvención institucional sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera (RPB, por sus siglas en inglés) al Departamento de Oftalmología de la Facultad de Medicina de Baylor. W.L. cuenta con el apoyo de la Fundación Oftalmológica de los Caballeros Templarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
| Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Forceps | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
| Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
References
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