Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों में क्षार जलने से प्रेरित कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन पर केंद्रित है। विधि पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस और संबंधित आणविक तंत्र का अध्ययन करने और कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन को रोकने के लिए नए औषधीय एजेंटों का परीक्षण करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और नियंत्रणीय कॉर्नियल रोग मॉडल उत्पन्न करती है।
Abstract
कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीओएनवी), एंजियोजेनेसिस का एक पैथोलॉजिकल रूप, लिम्बस से एवैस्कुलर कॉर्निया में रक्त और लिम्फ वाहिकाओं की वृद्धि को शामिल करता है और पारदर्शिता और दृष्टि पर प्रतिकूल प्रभाव डालता है। क्षार जलन ओकुलर आघात के सबसे आम रूपों में से एक है जो सीओएनवी की ओर जाता है। इस प्रोटोकॉल में, प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित तरीके से सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान का उपयोग करके CoNV को प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित किया जाता है। क्षार बर्न मॉडल CoNV की विकृति को समझने के लिए उपयोगी है और कॉर्निया की संवहनी, पारदर्शिता और पहुंच के कारण सामान्य रूप से एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस काम में, CoNV का विश्लेषण एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्यक्ष परीक्षा द्वारा और एंटी-सीडी 31 एमएबी का उपयोग करके फ्लैट-माउंट कॉर्निया को इम्यूनोस्टेनिंग करके किया गया था। एंटी-एलवाईवीई -1 एमएबी का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा फ्लैट-माउंट कॉर्निया पर लिम्फोजियोजेनेसिस का पता लगाया गया था। कॉर्नियल एडिमा को ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) का उपयोग करके कल्पना और मात्रा निर्धारित की गई थी। सारांश में, यह मॉडल मौजूदा नियोवैस्कुलराइजेशन परख को आगे बढ़ाने और पैथोलॉजिकल ओकुलर और एक्स्ट्राओकुलर एंजियोजेनेसिस के लिए नई उपचार रणनीतियों की खोज करने में मदद करेगा।
Introduction
कॉर्निया एक एवास्कुलर ऊतक है जो एंजियोजेनिक विशेषाधिकार 1,2 स्थापित करके अपनी पारदर्शिता बनाए रखता है। कॉर्निया को नुकसान के परिणामस्वरूप सूजन और रक्त और लिम्फ वाहिकाओं का विकास हो सकता है, साथ ही फाइब्रोसिस3 भी हो सकता है। कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन (CoNV) दृश्य हानि की ओर जाता हैऔर दुनिया भर में अंधापन का दूसरा प्रमुख कारण है। CoNVप्रति वर्ष संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 1.4 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। CoNV को रासायनिक जलन, संक्रमण, सूजन और हाइपोक्सिया 3,6 सहित विभिन्न कारकों से प्रेरित किया जा सकता है। रासायनिक जलन सबसे आम ओकुलर आपात स्थितियों में से एक है, और वे ओकुलर आघात के लगभग 13.2% के लिए जिम्मेदार हैं और तत्काल मूल्यांकन और उपचार की आवश्यकता होतीहै। रासायनिक जलन क्षार या एसिड जलने हो सकती है, लेकिन क्षार जलने से अधिक गंभीर चोट लगती है, क्योंकि क्षार ऊतक8 में गहराई से प्रवेश करता है।
क्षार जलने के माउस मॉडल व्यापक रूप से CoNV और घाव भरने का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। कॉर्नियल पॉकेट एंजियोजेनेसिस मॉडल 9,10 की तुलना में, क्षार बर्न मॉडल बनाने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं और इसका उपयोग कॉर्नियल सूजन, फाइब्रोसिस और उपकला प्रसार का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। ये मॉडल एंजियोजेनेसिस11 के कॉर्नियल सीवन मॉडल की तुलना में नैदानिक रासायनिक जलन से अधिक निकटता से संबंधित हैं। क्षार जलने के साथ, अन्यथा एवैस्कुलर कॉर्निया सूजन और एंटी-एंजियोजेनिकऔर प्रो-एंजियोजेनिक कारकों में असंतुलन के कारण रक्त वाहिकाओं को विकसित करता है। कॉर्नियल क्षार बर्न मॉडल की कमियां क्षार जलने के क्षेत्र और गंभीरता को नियंत्रित करने में कठिनाइयां, कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन में भिन्नता और अतिरिक्त क्षार समाधान के कारण आसन्न ऊतकों का अनजाने में जलना है। इस अध्ययन का उद्देश्य सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में पहले से भिगोए गए फिल्टर पेपर का उपयोग करके चूहों में एक नियंत्रित कॉर्नियल क्षार बर्न मॉडल का वर्णन करना है। इस मॉडल का उपयोग एंजियोजेनिक कारकों, एंटी-एंजियोजेनिक चिकित्सीय अभिकर्मकों, और अन्य कारकों और अभिकर्मकों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो सूजन और फाइब्रोसिस को संशोधित कर सकते हैं।
Protocol
प्रायोगिक प्रक्रियाओं और इच्छामृत्यु सहित सभी पशु कार्यों को प्रोटोकॉल नंबर एएन -8790 के साथ बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. 1 एन एनएओएच की तैयारी
- 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 4 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी जोड़ें। 400 मिलीग्राम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) का वजन करें, और ट्यूब को सावधानी से जोड़ें।
- कांच की छड़ का उपयोग करके घोल को धीरे-धीरे हिलाकर एनएओएच को घोलें। ट्यूब में बाँझ विआयनीकृत पानी जोड़कर मात्रा को 10 एमएल तक बनाएं, और ट्यूब को धीरे से ऊपर और नीचे घुमाकर फिर से मिलाएं। टोपी को कसकर बंद करें, और समाधान को कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
- हर महीने ताजा घोल तैयार करें क्योंकि हवा में कार्बन डाइऑक्साइड को अवशोषित करने वाले घोल से एनएओएच समाधान की एकाग्रता कम हो सकती है।
- उपयोग करने से पहले हमेशा एनएओएच समाधान को धीरे से मिलाएं।
सावधानी: रासायनिक हुड के अंदर समाधान तैयार करें, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।
2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान की तैयारी
- एक ग्लास बीकर में 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 30 एमएल जोड़ें। पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 4 ग्राम वजन करें, और इसे बीकर में जोड़ें।
- बीकर को गर्म प्लेट पर 60 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते हुए रखें। समाधान के साफ़ होने तक पीएच बढ़ाने के लिए 1 एन एनएओएच समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें।
- 1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक जांचें और समायोजित करें। 1x PBS के साथ अंतिम मात्रा को 50 mL में समायोजित करें।
- घोल को ठंडा करके छान लें। घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
सावधानी: उचित पीपीई पहनते समय फ्यूम हुड में घोल तैयार करें।
3. केटामाइन / ज़ाइलेज़िन कॉकटेल तैयार करना
- 0.8 एमएल केटामाइन (स्टॉक एकाग्रता: 100 मिलीग्राम / एमएल) और 0.16 एमएल ज़ाइलेज़िन (स्टॉक एकाग्रता: 100 मिलीग्राम / एमएल) को 9.4 एमएल खारा में जोड़कर केटामाइन / ज़ाइलेज़िन कॉकटेल तैयार करें।
- कॉकटेल को कमरे के तापमान (आरटी) पर बाँझ इंजेक्शन की बोतलों में स्टोर करें।
4. माउस कॉर्निया पर क्षार जलता है
- दर्द से राहत के लिए प्रक्रिया से 30 मिनट पहले मेलोक्सिकैम (शरीर के वजन का 4-6 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें। चूहों (सी 57बीएल / 6 जे, 6-8 सप्ताह की उम्र, पुरुष) को केटामाइन / ज़ाइलेज़िन कॉकटेल (केटामाइन 80 मिलीग्राम / किग्रा और ज़ाइलेज़िन 16 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के इंजेक्शन का उपयोग करके एनेस्थेटाइज करें।
- माउस के पैर की उंगलियों को चुटकी देकर रिफ्लेक्स प्रतिक्रिया (पेडल वापसी) की जांच करें, और रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति की पुष्टि करें। एक आंख की कॉर्नियल सतह पर सामयिक एनेस्थेटिक, 0.5% प्रोपेराकेन की एक बूंद और दूसरी आंख पर कृत्रिम आँसू की एक बूंद लागू करें।
- 2 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके, व्हाटमैन फिल्टर पेपर डिस्क को पंच करें।
- एक साफ पेट्री डिश में 1 एन एनएओएच के 2 μL जोड़ें। 1 एन एनएओएच ड्रॉप पर 2 मिमी फिल्टर पेपर डिस्क डालें, और इसे 15 सेकंड के लिए भिगोने दें।
- फिल्टर पेपर को बल के साथ उठाएं, और फिल्टर पेपर को 30 सेकंड के लिए कॉर्निया के केंद्र में प्रोपैराकेन-उपचारित आंख पर लागू करें।
नोट: फ़िल्टर पेपर केवल कॉर्निया के केंद्र को छूना चाहिए, और एक बार फ़िल्टर पेपर के आंदोलन से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि फ़िल्टर पेपर को स्थानांतरित करने से आसन्न ऊतकों को जलन हो सकती है। - एक बाँझ सिरिंज में 20 मिलीलीटर बाँझ नमकीन घोल के साथ फ्लश करके आंखों को धोएं।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि कॉर्निया, नेत्रश्लेष्मला थैली के साथ, कॉर्निया या आसपास के ऊतकों को कोई और नुकसान न हो, यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से धोया जाता है। नेत्रश्लेष्मला थैली को धोने से सिम्बलेफेरॉन को और रोका जा सकेगा। - डिस्पोजेबल सॉफ्ट वाइप्स का उपयोग करके आंखों और आसपास के क्षेत्र से अतिरिक्त खारा को धीरे से पोंछें। बाद में, चूहों को एम्बुलेटरी तक गर्म हीटिंग पैड पर एक रिकवरी पिंजरे में रखें।
नोट: 3 दिनों के लिए क्षार जलने के बाद चूहों की दैनिक निगरानी की जाती है। यदि दर्द या तनाव के लक्षण देखे जाते हैं, तो मेलोक्सिकैम (शरीर के वजन का 4-6 मिलीग्राम / किग्रा) चमड़े के नीचे प्रशासित किया जाता है।
5. नियोवैस्कुलराइजेशन और अपारदर्शिता की परीक्षा और मूल्यांकन
- एनेस्थेटाइज्ड चूहों में, जलने के बाद 10 वें दिन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत आंखों की जांच करें, और अस्पष्टता और नियोवैस्कुलराइजेशन स्कोर करने के लिए विच्छेदन दायरे से जुड़े कैमरे का उपयोग करके चित्र प्राप्त करें।
नोट: एक कैमरा संलग्न के साथ एक नियमित विच्छेदन दायरा पर्याप्त है। - विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से कॉर्निया का अवलोकन करते समय, निम्नलिखित पैमाने12 के आधार पर जलने के बाद अस्पष्टता स्कोर करें:
0 = कोई अपारदर्शिता नहीं; कॉर्निया को साफ करें
1 = हल्की अस्पष्टता; आईरिस और पुतली क्षेत्रों में मामूली धुंधलापन; आईरिस और पुतली आसानी से दिखाई देती है
2 = मध्यम अस्पष्टता; आईरिस और पुतली मुश्किल से दिखाई देते हैं।
3 = गंभीर अस्पष्टता; आंख की पुतली या पुतली दिखाई नहीं दे रही है
4 = अपारदर्शी कॉर्निया; आंख की पुतली और पुतली दिखाई नहीं दे रही है - विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से कॉर्निया का अवलोकन करते समय, निम्नलिखित पैमाने12 के आधार पर CoNV स्कोर करें:
0 = कोई नियोवैस्कुलराइजेशन नहीं; लिम्बस से कोई नया जहाज नहीं
1 = हल्के नियोवैस्कुलराइजेशन; लिम्बस से निकलने वाले नए जहाज।
2 = मध्यम नियोवैस्कुलराइजेशन; रक्त वाहिकाएं लिम्बस से उत्पन्न होती हैं और कॉर्निया के केंद्र की ओर बढ़ती हैं।
3 = गंभीर नियोवैस्कुलराइजेशन; रक्त वाहिकाएं लिम्बस से उत्पन्न होती हैं और कॉर्निया के केंद्र तक पहुंचती हैं और / या पार करती हैं - क्षार जलने और स्वस्थ आंख समूहों के बीच अस्पष्टता और नियोवैस्कुलराइजेशन स्कोर की सांख्यिकीय रूप से तुलना करने के लिए एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करें।
- 10 वें दिन चूहों को सांस लेने से रोकने के बाद 1 मिनट तक 5% पर आइसोफ्लुरेन एक्सपोजर द्वारा इच्छामृत्यु करें, इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, और फ्लैट-माउंट इमेजिंग के लिए कॉर्निया एकत्र करें।
6. ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) इमेजिंग
- जलने के बाद 10 वें दिन एनेस्थेटाइज्ड चूहों में आंखों के पूर्ववर्ती खंड की ओसीटी छवियां लें। 30° फील्ड ऑफ व्यू और 100% आईआर तीव्रता के साथ आईआर + ओसीटी मोड का उपयोग करके वॉल्यूम स्कैन के रूप में ओसीटी छवि अधिग्रहण करें।
- ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉर्निया की मोटाई की मात्रा निर्धारित करें।
- मोटाई को मापने के लिए, केंद्रीय कॉर्निया पर पूर्ववर्ती और पीछे की सतहों के बीच एक सीधी रेखा बनाने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर में लाइन चयन उपकरण का उपयोग करें।
- डेटा विंडो में मानों को स्थानांतरित करने के लिए सॉफ़्टवेयर उपकरण में विश्लेषण > माप पर क्लिक करें।
- मानों को एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में कॉपी करें, और सांख्यिकीय रूप से एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके क्षार जलने और स्वस्थ आंख समूहों के बीच कॉर्नियल मोटाई की तुलना करें।
नोट: कॉर्निया की मोटाई पूर्ववर्ती कॉर्नियल सतह पर एक बिंदु से कॉर्नियल केंद्र में पीछे की कॉर्नियल सतह पर निकटतम बिंदु तक की दूरी है।
7. फ्लैट-माउंट कॉर्निया पर कोएनवी के लिए इम्यूनोस्टेनिंग।
- क्षार जलने के बाद 10 वें दिन चूहों को इच्छामृत्यु दें, और कुंद विच्छेदन द्वारा आंखों को एन्यूक्लिएट करें।
- अंगूठे और तर्जनी उंगलियों का उपयोग करके पलकों को अलग खींचें, और आंखों के ग्लोब के नीचे बल रखें। बल को बंद करें, और धीरे से नेत्रगोलक को कक्षा से बाहर खींचें।
- आंखों की पुतलियों को 1x PBS में रखें। प्रत्येक नेत्रगोलक के लिए, पहले लिम्बस क्षेत्र के नीचे 30 ग्राम सुई का उपयोग करके चीरा लगाकर आंखों के ग्लोब से कॉर्निया को हटा दें।
- कॉर्नियल माइक्रो कैंची का उपयोग करके लिम्बस क्षेत्र के चारों ओर काटें, चीरा को शुरुआती बिंदु के रूप में रखें, और धीरे-धीरे कॉर्निया और लिंबस को ग्लोब से अलग करें।
- आईरिस को हटाने के लिए एक बारीक पेंटब्रश का उपयोग करके कॉर्निया को धीरे से साफ करें। कॉर्निया को 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 1x पीबीएस में 20 मिनट के लिए कॉर्निया को तीन बार धोएं।
- आरटी में 1 घंटे के लिए एक ब्लॉकिंग बफर (1x पीबीएस 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 और 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए] के साथ पूरक) में इनक्यूबेट करें।
- कॉर्निया को प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त एंटीबॉडी समाधान में स्थानांतरित करें। 1x PBS में एंटीबॉडी समाधान तैयार करें जो 1% BSA, 0.1% ट्राइटन-एक्स 100, Dylight 550-संयुग्मित एंटी-CD31 mAb (1:100), और Alexa Fluor488-संयुग्मित एंटी-LYVE-1 mAb (1:100) के साथ पूरक है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। कॉर्निया को 1x PBS में 20 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
- अंधेरे में 5 मिनट के लिए होचस्ट स्टेन समाधान (1: 1,000) का उपयोग करके नाभिक को दाग दें।
- कॉर्निया को रेडियल कट के साथ समतल करें, और उन्हें माउंटिंग माध्यम और कवरलिप्स का उपयोग करके पूर्व-साफ ग्लास स्लाइड पर माउंट करें। स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरलिप को सील करें, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण से पहले अंधेरे में रात भर स्लाइड को सुखाएं।
- व्यक्तिगत जेड-स्टैक छवियों को सिलाई करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लैट-माउंटेड कॉर्निया की छवि बनाएं; 10x उद्देश्य, 488 एनएम और 561 एनएम लेजर का उपयोग करें, और गैर-अनुनाद गैल्वानो स्कैनर पर 512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल प्रति स्लाइस का रिज़ॉल्यूशन करें।
- इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सीडी 31 + रक्त और एलवाईवीई -1 + लिम्फ वाहिकाओं के घनत्व को निर्धारित करें।
- संवहनी घनत्व निर्धारित करने के लिए, कॉन्फोकल छवियों को 8-बिट छवि में परिवर्तित करें।
- प्लगइन्स से संवहनी घनत्व चुनें।
- छवि पर रुचि का क्षेत्र चुनें, और ओके पर क्लिक करें। माप एक नई डेटा विंडो में खुल जाएगा।
- मानों को स्प्रेडशीट फ़ाइल में कॉपी करें, और सांख्यिकीय रूप से छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके क्षार जलने और स्वस्थ आंख समूहों के बीच संवहनी घनत्व की तुलना करें।
नोट: सीडी 31, जिसे प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 (पीईसीएएम -1) भी कहा जाता है, एंजियोजेनेसिस में शामिल एक सेल आसंजन अणु है और प्रारंभिक और परिपक्व रक्त वाहिकाओं13 के एंडोथेलियल कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। एलवाईवीई -1 (लसीका वाहिका एंडोथेलियल हायलूरोनन रिसेप्टर -1) लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं पर एक सेल सतह मार्कर है और इसका उपयोग लिम्फोजियोजेनेसिस मार्कर14 के रूप में किया जा सकता है।
Representative Results
यह अध्ययन क्षार जलने से माउस आंख में कॉर्नियल एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करने की एक विधि का वर्णन करता है। विच्छेदन माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 ए, बी) के साथ प्राप्त छवियों ने क्षार बर्न समूह (पी < 0.05) में कॉर्निया में काफी ऊंचा नियोवैस्कुलराइजेशन और अस्पष्टता स्कोर प्रदर्शित किया। चित्रा 1 सी, डी)। 10 वें दिन एकत्र किए गए कॉर्निया को क्रमशः रक्त वाहिकाओं के लिए एंटी-सीडी 31 एमएबी और लिम्फ वाहिकाओं के लिए एंटी-एलवाईवीई -1 एमएबी के साथ इम्यूनोस्टेन किया गया था (चित्रा 2 ए-1)। क्षार जलने वाले समूह ने 10 दिनों के बाद रक्त और लसीका वाहिकाओं की काफी अधिक घनत्व दिखाई (पी < 0.001 और पी < 0.05, क्रमशः; चित्र 2जे, के)। कॉर्निया की मोटाई, जैसा कि ओसीटी (चित्रा 3 ए, बी) का उपयोग करके चित्रित और परिमाणित किया गया था, क्षार जलने वाले समूह में काफी अधिक देखा गया था (पी < 0.01; चित्रा 3 सी)।
चित्रा 1: क्षार जलने से प्रेरित कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन और अस्पष्टता। (ए, बी) कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन (बी) क्षार-जले हुए माउस आंख (ए) में कॉर्नियल सेंटर की ओर लिम्बस वाहिकाओं से अंकुरित हुआ, लेकिन चोट के 10 दिन बाद स्वस्थ आंख नहीं। (C, D) पैनल ए और बी में (सी) कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन और (डी) अस्पष्टता का परिमाणीकरण (± एसईएम; टी-टेस्ट; * पी < 0.05; एन = 3 आंखें, 1 आंख / माउस)। लाल तीर लिम्बस का प्रतिनिधित्व करते हैं, और पीला तीर अंकुरित नए जहाजों को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: क्षार जलने के कारण कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन और लिम्फोजियोजेनेसिस। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने क्रमशः एंटी-सीडी 31 और एंटी-एलवाईवीई -1 एमएबीएस का उपयोग करके (ए, डी, जी) रक्त और (बी, ई, एच) लिम्फ वाहिकाओं का खुलासा किया। (A-C) स्वस्थ माउस कॉर्निया. (D-I) क्षार-जला कॉर्निया चोट के 10 दिन बाद। (C, F, I) CD31 और LYVE-1 संकेतों की सुपरइम्पोज्ड छवियां। (G-I) पैनल डी-एफ के लिए ज़ूम-इन छवियां। स्केल बार = (A-F) 200 μm और (G-I) 500 μm. (J, K) पैनल A-F में रक्त और लसीका वाहिका घनत्व का परिमाणीकरण, जैसा कि संकेत दिया गया है (± SEM; t-test; *P < 0.05; ***P < 0.001; n = 3 आंखें, 1 आंख / माउस)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: क्षार जलने के कारण कॉर्नियल मोटाई में वृद्धि । (ए) एक स्वस्थ माउस आंख की एक ओसीटी छवि। (बी) क्षार जलने के 10 दिन बाद माउस कॉर्निया की एक ओसीटी छवि। (सी) पैनल ए और बी में कॉर्नियल मोटाई का परिमाणीकरण, जैसा कि कॉर्निया के केंद्र में मापा जाता है (± एसईएम; टी-टेस्ट; ** पी < 0.01; एन = 3 आंखें, 1 आंख / माउस)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
कॉर्निया एंजियोजेनेसिस और सूजन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट ऊतक है क्योंकि यह सुलभ और संवहनी है, जिसका अर्थ है कि नियोवैस्कुलराइजेशन को आसानी से पता लगाया जा सकता है और प्रलेखित किया जा सकता है। खरगोशों, चूहों और चूहों में कॉर्नियल बर्न का उपयोग कॉर्नियल एंजियोजेनेसिस, सूजन और अस्पष्टता, अल्सर, कॉर्निया के छिद्र और फाइब्रोसिस15,16,17 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, कॉर्नियल बर्न का माउस मॉडल एंजियोजेनेसिस और सूजन के लिए विभिन्न चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए मूल्यवान है क्योंकि चूहों में एक प्रतिरक्षा प्रणाली हैजो मनुष्यों से निकटता से संबंधित है। माउस जीनोम में आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए तकनीकों की उपलब्धता भी प्रजातियों को इस प्रकारके अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बनाती है। इस शोध में चुनौती कॉर्नियल बर्न की एक विधि विकसित करना है जो सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पैथोफिज़ियोलॉजी प्रदान करता है।
क्षार बर्न मॉडल दवाओं की औषधीय स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो एंजियोजेनेसिस, सूजन और फाइब्रोसिस को नियंत्रित करता है। अभिकर्मकों और संसाधनों के लिए न्यूनतम आवश्यकताएं, क्षार जलने की सादगी, और प्रोटोकॉल की छोटी अवधि के लाभ और परिणामों का प्रत्यक्ष अवलोकन माउस कॉर्निया पर क्षार जलने को औषधीय दवा स्क्रीनिंग के लिए एक प्राथमिक विकल्प बनाता है। हालांकि, स्थिरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को करते समय कुछ सावधानियों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, फिल्टर पेपर को आंख के अन्य क्षेत्रों, विशेष रूप से लिम्बस, पलकें और नेत्रश्लेष्मला को जलाने से बचने के लिए कॉर्निया के केंद्र में रखा जाना चाहिए; दूसरे, कॉर्निया पर क्षार जलने से लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए एनएओएच की मात्रा और एकाग्रता उपयुक्त होनी चाहिए। फिल्टर गीला नहीं टपकना चाहिए, लेकिन एनएओएच समाधान में भिगोया जाना चाहिए था। फ़िल्टर आकार और फ़िल्टर प्रकार और इस विधि में उपयोग किए जाने वाले समाधान की सामान्यता और मात्रा को NaOH के अतिप्रवाह से बचने के लिए अनुकूलित किया जाता है। एक अलग आकार के फिल्टर पेपर या एनएओएच की उच्च या कम मात्रा का उपयोग करने से नियोवैस्कुलराइजेशन में विसंगतियां पैदा होंगी। तीसरा, उपयोग के बाद समाधान के ट्यूब कैप को तुरंत कसकर और हवा / समाधान अनुपात को कम करके कमरे की हवा में सीओ2 को अवशोषित करने से एनएओएच समाधान को रोकना महत्वपूर्ण है। नियोवैस्कुलराइजेशन में विसंगतियों को रोकने और कॉर्नियल अल्सरेशन से बचने के लिए ताजा क्षार समाधान का उपयोग करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। अंत में, कॉर्निया और आंख के आसपास के ऊतकों को और नुकसान को रोकने के लिए आंख से सभी एनएओएच समाधान और नमकीन के साथ नेत्रश्लेष्मला की व्यापक धुलाई आवश्यक है। कॉर्निया और आसन्न ऊतकों की पूरी तरह से धोने से सिम्बलेफेरॉन को भी रोका जा सकेगा।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल कॉर्नियल एंजियोजेनेसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय तरीका है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग आगे कॉर्नियल सूजन, फाइब्रोसिस और घाव भरने का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को एसआरबी चैरिटेबल कॉर्पोरेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) P30EY002520 द्वारा समर्थित किया गया था, और नेत्र विज्ञान विभाग, बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन को अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान (आरपीबी) से एक अप्रतिबंधित संस्थागत अनुदान दिया गया था। डब्ल्यूएल को नेत्र विज्ञान में नाइट्स टेम्पलर आई फाउंडेशन एंडोमेंट द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
| Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Forceps | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
| Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
References
- Ellenberg, D., et al. Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).
- Azar, D. T. Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).
- Rolfsen, M. L., et al. Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies. Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).
- Skobe, M., Dana, R.
- Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. Ocular neovascularization: An epidemiologic review. Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).
- Su, W., et al. Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).
- Lasagni Vitar, R. M., et al. Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study. Frontiers in Medicine. 8, 733538 (2021).
- Said, D. G., Dua, H. S. Chemical burns acid or alkali, what's the difference. Eye. 34, 1299-1300 (2020).
- Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R.
- Kenyon, B. M., et al. A model of angiogenesis in the mouse cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).
- Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation. Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).
- Yoeruek, E., et al. penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- DeLisser, H. M., et al.
- Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).
- Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
- Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound. Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).
- Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T.
- Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity. Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021 (2019).
- vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism. Genome Biology. 12 (6), 224 (2011).
