Summary
Detta protokoll fokuserar på alkalibrännskadeinducerad hornhinneneovaskularisering hos möss. Metoden genererar en reproducerbar och kontrollerbar modell för hornhinnesjukdom för att studera patologisk angiogenes och tillhörande molekylära mekanismer samt för att testa nya farmakologiska medel för att förhindra kärlnybildning i hornhinnan.
Abstract
Kärlnybildning av hornhinnan (CoNV), en patologisk form av angiogenes, innebär tillväxt av blod- och lymfkärl in i den avaskulära hornhinnan från limbus och påverkar synen och synen negativt. Alkalibrännskador är en av de vanligaste formerna av okulärt trauma som leder till CoNV. I detta protokoll induceras CoNV experimentellt med användning av natriumhydroxidlösning på ett kontrollerat sätt för att säkerställa reproducerbarhet. Modellen för alkalibränning är användbar för att förstå patologin för CoNV och kan utvidgas till att studera angiogenes i allmänhet på grund av hornhinnans avaskularitet, transparens och tillgänglighet. I detta arbete analyserades CoNV genom direkt undersökning under ett dissektionsmikroskop och genom immunfärgning av flat-mount hornhinnor med anti-CD31 mAb. Lymfangiogenes detekterades på flatmonterade hornhinnor genom immunfärgning med anti-LYVE-1 mAb. Hornhinneödem visualiserades och kvantifierades med hjälp av optisk koherenstomografi (OCT). Sammanfattningsvis kommer denna modell att bidra till att främja befintliga neovaskulariseringsanalyser och upptäcka nya behandlingsstrategier för patologisk okulär och extraokulär angiogenes.
Introduction
Hornhinnan är en avaskulär vävnad som bibehåller sin genomskinlighet genom att etablera ett angiogent privilegium 1,2. Skador på hornhinnan kan leda till inflammation och utveckling av blod- och lymfkärl samt fibros3. Kärlnybildning av hornhinnan (CoNV) leder till synnedsättning och är den näst vanligaste orsaken till blindhet i världen4. CoNV drabbar cirka 1,4 miljoner människor i USA varje år5. CoNV kan induceras av olika faktorer, inklusive kemiska brännskador, infektioner, inflammation och hypoxi 3,6. Kemiska brännskador är en av de vanligaste nödsituationerna i ögonen, och de står för cirka 13,2 % av ögontrauman och kräver omedelbar bedömning och behandling7. Kemiska brännskador kan vara alkaliska eller sura brännskador, men alkaliska brännskador orsakar allvarligare skador, eftersom alkali tränger djupare in i vävnaden8.
Musmodeller av alkalibrännskador används ofta för att studera CoNV och sårläkning. Jämfört med hornhinnans fickangiogenes modell 9,10 är alkalibrännmodeller relativt enkla att skapa och kan också användas för att studera hornhinneinflammation, fibros och epitelproliferation. Dessa modeller är också närmare besläktade med kliniska kemiska brännskador än hornhinnesuturmodeller för angiogenes11. Vid alkalibrännskador utvecklar den annars avaskulära hornhinnan blodkärl på grund av inflammation och en obalans i antiangiogena och proangiogena faktorer 1,2. Nackdelarna med modeller för alkalibränning av hornhinnan är svårigheterna att kontrollera området och svårighetsgraden av alkalibrännskadan, variationen i hornhinnans kärlnykastning och oavsiktlig bränning av intilliggande vävnader på grund av överskott av alkalilösning. Syftet med denna studie är att beskriva en kontrollerad modell för alkaliförbränning av hornhinnan hos möss med hjälp av filterpapper indränkt i natriumhydroxidlösning. Denna modell kan användas för att studera angiogena faktorer, antiangiogena terapeutiska reagenser och andra faktorer och reagenser som kan modulera inflammation och fibros.
Protocol
Allt djurarbete, inklusive experimentella procedurer och avlivning, godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Baylor College of Medicine med protokollnummer AN-8790.
1. Beredning av 1 N NaOH
- Tillsätt 4 ml sterilt avjoniserat vatten till ett 15 ml centrifugrör. Väg upp 400 mg natriumhydroxid (NaOH) och tillsätt försiktigt till röret.
- Lös upp NaOH genom att långsamt röra om lösningen med hjälp av en glasstav. Fyll på volymen till 10 ml genom att tillsätta sterilt avjoniserat vatten i röret och blanda igen genom att försiktigt vända röret upp och ner. Stäng locket ordentligt och förvara lösningen i rumstemperatur.
- Bered den färska lösningen varje månad eftersom koncentrationen av NaOH-lösningen kan minskas genom att lösningen absorberar koldioxid i luften.
- Blanda alltid NaOH-lösningen försiktigt före användning.
VARNING: Förbered lösningen inuti en kemikaliehuv och använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
2. Beredning av 4-procentig lösning av paraformaldehyd (PFA)
- Tillsätt 30 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till en glasbägare. Väg upp 4 g paraformaldehyd (PFA) och tillsätt det i bägaren.
- Förvara bägaren på en värmeplatta vid 60 °C under omrörning. Tillsätt 1 N NaOH-lösningen droppvis för att höja pH-värdet tills lösningen klarnar.
- Kontrollera och justera pH-värdet till 7,4 med 1 N saltsyra (HCl). Justera den slutliga volymen till 50 ml med 1x PBS.
- Kyl och filtrera lösningen. Förvara lösningen vid 4 °C.
VARNING: Bered lösningen i ett dragskåp medan du bär lämplig personlig skyddsutrustning.
3. Beredning av ketamin/xylazincocktail
- Bered ketamin/xylazincocktailen genom att tillsätta 0,8 ml ketamin (stamkoncentration: 100 mg/ml) och 0,16 ml xylazin (stamkoncentration: 100 mg/ml) till 9,4 ml saltlösning.
- Förvara cocktailen i sterila injektionsflaskor i rumstemperatur (RT).
4. Alkalibränning på musens hornhinna
- Injicera meloxikam (4-6 mg/kg kroppsvikt) subkutant 30 minuter före ingreppet för smärtlindring. Bedöva mössen (C57BL/6J, 6-8 veckors ålder, hane) med en intravenös injektion av ketamin/xylazincocktailen (Ketamin 80 mg/kg och Xylazin 16 mg/kg kroppsvikt).
- Kontrollera reflexresponsen (pedaluttag) genom att nypa ihop musens tår och bekräfta frånvaron av reflexen. Applicera en droppe lokalbedövningsmedel, 0,5 % proparakain, på hornhinnans yta av ena ögat och en droppe konstgjorda tårar på det andra ögat.
- Använd en 2 mm biopsistans och stansa ut Whatman-filterpappersskivorna.
- Tillsätt 2 μL 1N NaOH till en ren petriskål. Sätt 2 mm filterpappersskivan på 1 N NaOH-droppen och låt den dra i 15 s.
- Ta upp filterpapperet med pincett och applicera filtrerpapperet på det proparakainbehandlade ögat i mitten av hornhinnan i 30 s.
OBS: Filterpapperet får endast vidröra mitten av hornhinnan, och försiktighet måste iakttas för att undvika att filterpapperet rör sig när det väl har placerats, eftersom flyttning av filterpapperet kan orsaka brännskador på intilliggande vävnader. - Skölj ögat genom att spola med 20 ml steril koksaltlösning i en steril spruta.
OBS: Försiktighet måste iakttas för att säkerställa att hornhinnan, tillsammans med bindhinnesäcken, tvättas noggrant för att säkerställa att hornhinnan eller omgivande vävnad inte skadas ytterligare. Att tvätta bindhinnesäcken kommer ytterligare att förhindra symblepharon. - Torka försiktigt bort överflödig saltlösning från ögonen och det omgivande området med mjuka engångsservetter. Efteråt ska du hålla mössen i en återhämtningsbur på en varm värmedyna tills de är ambulerande.
OBS: Möss övervakas dagligen efter alkalibränningen i 3 dagar. Om symtom på smärta eller stress observeras administreras meloxikam (4-6 mg/kg kroppsvikt) subkutant.
5. Undersökning och bedömning av kärlnybildning och opacitet
- Hos sövda möss, undersök ögonen under ett dissektionsmikroskop på dag 10 efter brännskadan och ta bilder med hjälp av en kamera fäst vid dissektionsskopet för att poängsätta opaciteten och neovaskulariseringen.
OBS: Ett vanligt dissektionsskop med en kamera monterad räcker. - När du observerar hornhinnan genom dissektionsmikroskopet, poängsätt opaciteten efter brännskadan baserat på följande skala12:
0 = Ingen opacitet; klar hornhinna
1 = Mild opacitet; lätt grumlighet i iris- och pupillområdena; Iris och pupill väl synliga
2 = Måttlig opacitet; Iris och pupill knappt synliga
3 = Svår opacitet; Iris eller pupill syns inte
4 = Ogenomskinlig hornhinna; Iris och pupill syns inte - Medan du observerar hornhinnan genom dissektionsmikroskopet, poängsätt CoNV baserat på följande skala12:
0 = Ingen neovaskularisering; Inga nya kärl från limbus
1 = Lindrig kärlnybildning; Nya fartyg med ursprung i limbus
2 = Måttlig kärlnybildning; Blodkärl härstammar från limbus och växer mot mitten av hornhinnan
3 = Svår kärlnybildning; blodkärl som utgår från limbus och når och/eller korsar hornhinnans centrum - Använd ett Students t-test för att statistiskt jämföra opacitets- och neovaskulariseringspoängen mellan alkalibrännskadan och friska ögongrupper.
- Avliva mössen på dag 10 genom isofluranexponering vid 5 % fram till 1 minut efter att andningen upphört, följt av cervikal luxation, och samla in hornhinnorna för platt avbildning.
6. Optisk koherenstomografi (OCT) avbildning
- Ta OCT-bilder av det främre segmentet av ögonen hos sövda möss på dag 10 efter brännskadan. Utför OCT-bildtagning som en volymskanning med IR + OCT-läge med 30° synfält och 100 % IR-intensitet.
- Kvantifiera tjockleken på hornhinnorna med hjälp av programvaran ImageJ.
- För att mäta tjockleken, använd linjemarkeringsverktyget i ImageJ-programvaran för att skapa en rak linje mellan de främre och bakre ytorna vid den centrala hornhinnan.
- Klicka på Analysera > mäta i programvaruverktygen för att överföra värdena till datafönstret.
- Kopiera värdena till en kalkylbladsfil och jämför statistiskt hornhinnans tjocklek mellan alkalibrännskadan och friska ögongrupper med hjälp av ett studentens t-test.
OBS: Hornhinnans tjocklek är avståndet från en punkt på hornhinnans främre yta till den närmaste punkten på hornhinnans bakre yta vid hornhinnans centrum.
7. Immunfärgning för CoNV på flatmonterade hornhinnor
- Avliva mössen på dag 10 efter alkalibrännskador och enukleera ögonen genom trubbig dissektion.
- Dra isär ögonlocken med tummen och pekfingret och placera pincetten under ögongloben. Stäng pincetten och dra försiktigt av ögongloben från omloppsbanan.
- Placera ögongloberna i 1x PBS. För varje ögonglob tar du bort hornhinnan från ögongloben genom att först göra ett snitt med en 30 G nål under limbusområdet.
- Klipp runt limbusområdet med hjälp av en mikrosax på hornhinnan, med snittet som utgångspunkt, och separera långsamt hornhinnan och limbus från jordklotet.
- Rengör hornhinnorna försiktigt med en fin pensel för att ta bort iris. Fixera hornhinnorna i 4% paraformaldehyd i 1 timme.
- Tvätta hornhinnorna tre gånger i 20 minuter vardera i 1x PBS vid rumstemperatur (RT).
- Inkubera i en blockerande buffert (1x PBS kompletterat med 0,1 % Triton-X 100 och 5 % bovint serumalbumin [BSA]) i 1 timme vid RT.
- Överför hornhinnorna till en antikroppslösning som innehåller primära antikroppar. Bered antikroppslösningen i 1x PBS kompletterad med 1 % BSA, 0,1 % Triton-X 100, Dylight550-konjugerad anti-CD31 mAb (1:100) och Alexa Fluor488-konjugerad anti-LYVE-1 mAb (1:100).
- Inkubera i 3 dygn vid 4 °C. Tvätta hornhinnorna i 1x PBS tre gånger i 20 minuter vardera.
- Färga kärnorna med Hoechst färglösning (1:1 000) i 5 minuter i mörker.
- Platta till hornhinnorna med radiella snitt och montera dem på en förrengjord glasskiva med hjälp av monteringsmedium och täckglas. Försegla täckglasen med genomskinligt nagellack och torka objektglasen över natten i mörker innan de analyseras med konfokalmikroskopi.
- Ta en bild av de plattmonterade hornhinnorna med hjälp av konfokalmikroskopi genom att sy ihop enskilda Z-stackbilder. Använd ett 10x objektiv, 488 nm och 561 nm lasrar och en upplösning på 512 pixlar x 512 pixlar per skiva på icke-resonanta galvanoskanner.
- Kvantifiera densiteten hos CD31+ blod och LYVE-1+ lymfkärl med hjälp av ImageJ-programvaran.
- För att bestämma kärltätheten, konvertera de konfokala bilderna till en 8-bitarsbild.
- Välj Vascular Density från Plugins .
- Välj intresseområde på bilden och klicka på OK. Mätningarna öppnas i ett nytt datafönster.
- Kopiera värdena till en kalkylbladsfil och jämför statistiskt kärltätheten mellan alkalibrännskadan och friska ögongrupper med hjälp av ett studentens t-test.
OBS: CD31, även kallad trombocytendotelcellsadhesionsmolekyl-1 (PECAM-1), är en celladhesionsmolekyl som är involverad i angiogenes och uttrycks i hög grad i endotelcellerna i tidiga och mogna blodkärl13. LYVE-1 (lymfkärlendotelial hyaluronreceptor-1) är en cellytemarkör på lymfatiska endotelceller och kan användas som lymfangiogenesmarkör14.
Representative Results
Denna studie beskriver en metod för att inducera hornhinnesangiogenes i musögat genom alkalibrännskada. Bilderna som erhölls med dissektionsmikroskopet (Figur 1A,B) visade signifikant förhöjda neovaskulariserings- och opacitetspoäng i hornhinnan i gruppen med alkalibrännskador (P < 0,05; Figur 1C,D). Hornhinnorna som samlades in dag 10 immunfärgades ytterligare med anti-CD31 mAb för blodkärl respektive anti-LYVE-1 mAb för lymfkärl (Figur 2A-I). Gruppen med alkaliska brännskador uppvisade signifikant högre täthet av blod- och lymfkärl efter 10 dagar (P < 0,001 respektive P < 0,05; Figur 2J,K). Hornhinnans tjocklek, avbildad och kvantifierad med OCT (Figur 3A,B), observerades vara signifikant högre i gruppen med alkaliförbränning (P < 0,01; Figur 3C).
Figur 1: Alkalibrännskadeinducerad hornhinneneovaskularisering och opacitet. (A,B) Kärlnybildning av hornhinnan grodde från limbuskärlen mot hornhinnans centrum i det (B) alkalibrända musögat (A) men inte friska ögat 10 dagar efter skadan. (C,D) Kvantifiering av (C) hornhinnans kärlnybildning och (D) opacitet i panelerna A och B (± SEM; t-test; *P < 0,05; n = 3 ögon, 1 öga/mus). De röda pilarna representerar limbus, och den gula pilen indikerar de nya kärlen som spirar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kärlnybildning i hornhinnan och lymfangiogenes orsakad av alkalibrännskada. Immunhistokemi avslöjade (A,D,G) blod och (B,E,H) lymfkärl med anti-CD31 respektive anti-LYVE-1 mAbs. (A-C) Den friska mushornhinnan. (D-I) Den alkalibrända hornhinnan 10 dagar efter skadan. (C,F,I) Överlagrade bilder av CD31- och LYVE-1-signaler. (G-I) Inzoomade bilder för paneler D-F. Skalstreck = (A-F) 200 μm och (G-I) 500 μm. (J,K) Kvantifiering av blod- och lymfkärlstätheten i panelerna A-F, enligt anvisningarna (± SEM; t-test; *P < 0,05; ***P < 0,001; n = 3 ögon, 1 öga/mus). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ökning av hornhinnans tjocklek orsakad av alkalibränna . (A) En OCT-bild av ett friskt musöga. (B) En OCT-bild av musens hornhinna 10 dagar efter alkalibränning. C) Kvantifiering av hornhinnans tjocklek i panelerna A och B, uppmätt i mitten av hornhinnan (± SEM; t-test; **P < 0,01; n = 3 ögon, 1 öga/mus). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Hornhinnan är en utmärkt vävnad för att studera angiogenes och inflammation eftersom den är tillgänglig och avaskulär, vilket innebär att neovaskularisering enkelt kan detekteras och dokumenteras. Hornhinnebrännskada hos kaniner, råttor och möss har använts för att studera hornhinnans angiogenes, inflammation och opacitet, sårbildning, perforering av hornhinnan och fibros15,16,17. Dessutom är musmodellen av hornhinnebrännskada värdefull för att testa olika terapeutiska strategier för angiogenes och inflammation eftersom möss har ett immunsystem som är nära besläktat med det hos människor18. Tillgången till tekniker för att genetiskt manipulera musens arvsmassa gör också arten till ett utmärkt val för denna typ av studie19. Utmaningen i denna forskning har varit att utveckla en metod för hornhinnebränna som ger konsekvent, reproducerbar patofysiologi.
Modellen med alkaliförbränning är särskilt användbar för farmakologisk screening av läkemedel som modulerar angiogenes, inflammation och fibros. De minimala kraven på reagenser och resurser, enkelheten att utföra alkalibränningen och fördelarna med protokollets korta varaktighet och den direkta observationen av resultaten gör alkalibränning på mushornhinnan till ett primärt val för farmakologisk läkemedelsscreening. Några försiktighetsåtgärder bör dock övervägas när du utför denna procedur för att säkerställa konsekvens och reproducerbarhet. För det första måste filterpapperet placeras i mitten av hornhinnan för att undvika att bränna andra delar av ögat, särskilt limbus, ögonlocken och bindhinnan; För det andra bör volymen och koncentrationen av NaOH vara lämplig för att få konsekventa resultat från alkalibränningen på hornhinnan. Filtret får inte vara droppande vått utan bör ha blötts i NaOH-lösningen. Filterstorleken och filtertypen samt normaliteten och volymen hos lösningen som används i denna metod optimeras för att undvika ett överflöd av NaOH. Användning av ett filterpapper av annan storlek eller en högre eller lägre volym NaOH skulle orsaka inkonsekvenser i neovaskulariseringen. För det tredje är det viktigt att förhindra att NaOH-lösningen absorberar CO2 i rumsluften genom att omedelbart dra åt lösningens tublock efter användning och minska luft/lösningsförhållandet. Försiktighet måste iakttas för att använda färska alkalilösningar för att förhindra inkonsekvenser i neovaskulariseringen och för att undvika sår på hornhinnan. Slutligen är det nödvändigt att tvätta bort all NaOH-lösning från ögat och bindhinnan med koksaltlösning för att förhindra ytterligare skador på hornhinnan och omgivande vävnader i ögat. Noggrann tvättning av hornhinnan och de intilliggande vävnaderna kommer också att förhindra symblepharon.
Protokollet som beskrivs här är en effektiv och tillförlitlig metod för att studera patofysiologin för hornhinneangiogenes. Detta protokoll kan vidare användas för att studera hornhinneinflammation, fibros och sårläkning.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520 och ett obegränsat institutionellt bidrag från Research to Prevent Blindness (RPB) till Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine. W.L. stöds av The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
| Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Forceps | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
| Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
References
- Ellenberg, D., et al. Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).
- Azar, D. T. Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).
- Rolfsen, M. L., et al. Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies. Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).
- Skobe, M., Dana, R.
- Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. Ocular neovascularization: An epidemiologic review. Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).
- Su, W., et al. Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).
- Lasagni Vitar, R. M., et al. Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study. Frontiers in Medicine. 8, 733538 (2021).
- Said, D. G., Dua, H. S. Chemical burns acid or alkali, what's the difference. Eye. 34, 1299-1300 (2020).
- Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R.
- Kenyon, B. M., et al. A model of angiogenesis in the mouse cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).
- Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation. Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).
- Yoeruek, E., et al. penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- DeLisser, H. M., et al.
- Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).
- Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
- Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound. Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).
- Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T.
- Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity. Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021 (2019).
- vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism. Genome Biology. 12 (6), 224 (2011).
