Summary
여기에서는 맥락총의 유전자 발현을 선택적으로 변경하면서 다른 뇌 영역에는 영향을 주지 않는 방법을 설명합니다.
Abstract
맥락총(ChP)은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 중요한 관문 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 ChP 활동을 조절하면 중추신경계 장애를 예방할 수 있습니다. 그러나 다른 뇌 영역에 영향을 주지 않고 ChP의 생물학적 기능을 연구하는 것은 섬세한 구조로 인해 어렵습니다. 이 연구는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 TAT 서열(CRE-TAT)로 구성된 고리화 재조합 효소(Cre) 재조합 효소 단백질을 사용하여 ChP 조직에서 유전자 녹다운을 위한 새로운 방법을 제시합니다. 결과는 AAV 또는 CRE-TAT를 측심실에 주입한 후 형광이 ChP에만 집중되었음을 보여줍니다. 이 접근법을 사용하여 RNA 간섭(RNAi) 또는 X-overP1의 Cre/locus(Cre/LoxP) 시스템을 사용하여 ChP의 아데노신 A 2A 수용체(A2A R)를 성공적으로 녹다운하고 이 녹다운이 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 병리를 완화할 수 있음을 보여주었습니다. 이 기술은 중추신경계 장애에서 ChP의 역할에 대한 향후 연구에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.
Introduction
맥락총(ChP)은 뇌척수액(CSF)과 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)를 분비하여 뇌 기능적 항상성을 유지하는 데 도움이 되는 것으로 여겨지곤 합니다1,2. 지난 30년 동안 진행된 연구에서 ChP가 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 뚜렷한 경로를 나타낸다는 사실이 밝혀졌습니다.
단층 ChP 상피로 구성된 ChP의 단단한 연접(TJ)은 거대분자와 면역세포가 뇌로 들어가는 것을 막아 면역학적 항상성을 유지한다3. 그러나 특정 병리학적 조건에서 ChP 조직은 뇌척수액과 혈액의 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 감지하고 반응하여 비정상적인 면역 침윤 및 뇌 기능 장애를 유발합니다 4,5. 중요한 역할에도 불구하고 ChP의 작은 크기와 뇌의 독특한 위치로 인해 다른 뇌 영역에 영향을 미치지 않고 기능을 연구하기가 어렵습니다. 따라서 ChP에서 유전자 발현을 특이적으로 조작하는 것은 그 기능을 이해하는 데 이상적인 접근 방식입니다.
초기에, ChP에서 발현된 유전자에 특이적인 프로모터의 제어 하에 Cre를 발현하는 고리화 재조합 효소(Cre) 형질전환 계통은 플록싱된 후보 유전자 6,7,8과 육종하여 표적 유전자를 삭제하는데 일반적으로 사용되었다. 예를 들어, 전사인자 포크헤드 박스 J1(FoxJ1)은 태아기 마우스 뇌(prenatal mouse brain)의 ChP 상피(ChP epithelium)에서만 독점적으로 발현된다(7). 따라서, FoxJ1-Cre 라인은 종종 ChP 6,9에 위치한 유전자를 삭제하는데 사용되었다. 그러나 이 전략의 성공은 프로모터의 특수성에 크게 의존합니다. FoxJ1은 뇌와 말초계의 다른 부분에 있는 섬모 상피 세포에도 존재하기 때문에 FoxJ1 발현 패턴이 충분히 뚜렷하지 않다는 것이 점차 발견되었다7. 이러한 한계를 극복하기 위해, Cre 재조합효소의 뇌뇌내 (ICV) 주사를 수행하여 플록스된 형질전환 라인의 심실로 재조합효소를 전달하였다. 이 전략은 ChP 조직10,11에서만 tdTomato 형광의 존재에 의해 입증 된 바와 같이 높은 특이성을 보여주었습니다. 그러나, 이 방법은 여전히 플록스된 형질전환 마우스 라인의 가용성에 의해 제한된다. 이 문제를 해결하기 위해 연구자들은 아데노 관련 바이러스(AAV)의 ICV 주입을 사용하여 ChP 특이적 녹다운 또는 표적 유전자12,13의 과발현을 달성했습니다. ChP 감염에 대한 다양한 AAV 혈청형을 종합적으로 평가한 결과, AAV2/5 및 AAV2/8은 ChP에서 강력한 감염 능력을 나타내면서 다른 뇌 영역은 감염시키지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 AAV2/8은 뇌실 주위의 뇌실막을 감염시키는 것으로 밝혀진 반면, AAV2/5 그룹은 감염을 나타내지 않았다14. 이 방법은 플록스드 형질전환 동물을 획득하는 한계를 극복할 수 있는 장점이 있다.
이 글에서는 아데노신 A 2A 수용체(A 2A R)의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV와 A2A R의 ChP 특이적 knockdown을 달성하기 위해 TAT서열(CRE-TAT) 재조합효소로 구성된 Cre 재조합효소 단백질의 두 가지 방법을 사용하여 ChP에서 유전자 knockdown을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 연구 결과에 따르면 ChP에서 A2AR을 녹다운하면 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 완화할 수 있습니다. 이 상세한 프로토콜은 ChP 기능 연구 및 ChP 유전자의 특정 knockdown에 유용한 지침을 제공합니다.
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Protocol
이 연구에 설명된 모든 동물 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 요약된 지침에 따라 수행되었으며 Wenzhou Medical University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다.
1. 동물
- 8-12주 되고 체중이 20-22g인 수컷 C57BL/6 마우스를 구입하십시오.
- 형질전환 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9) 마우스 라인 및 수컷 A2AR 플록스/플록스 마우스를 얻습니다.
- 생쥐를 무작위로 두 그룹에 할당하고 1주일 동안 표준 12시간 조명/12시간 어둡기 주기 하에서 케이지당 최대 5마리의 생쥐를 케이지에 넣습니다.
- 생쥐에게 충분한 먹이와 물을 제공하고 25°C의 일정한 온도로 유지합니다.
2. AAV2/5-shRNA를 이용한 A 2A Rs의 ChP 특이적 knockdown
- 각 마우스의 무게를 측정하고 값을 기록해 둡니다.
- 60-80mg/kg 펜토바르비탈에 해당하는 6-8mL/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 복강내 마취하고 마우스를 가열 패드에 올려 따뜻하게 유지합니다.
참고: 성공적인 수술을 위해서는 마우스의 체중에 따라 정확한 용량의 펜토바르비탈 나트륨을 투여하는 것이 중요합니다. 마취는 사망을 초래할 수 있으므로 너무 깊어서는 안 되지만 시술 중에 쥐가 깨어나 바이러스 주입의 효과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있으므로 너무 얕아서는 안 됩니다. 발가락을 꼬집어 적절한 마취량을 확인하고 쥐가 반응하지 않는지 확인하십시오. - 특수 마우스 면도기를 사용하여 마취된 쥐의 윗털을 다듬습니다.
- 양쪽 눈에 안연고를 발라 건조를 방지하고, 쥐를 입체장치에 고정시켜 뇌를 고정시킨다. 멸균 드레이프로 동물을 덮으십시오.
- 수술 후 감염을 줄이기 위해 요오드포 소독제와 75% 알코올로 쥐의 머리와 목 피부를 3회 소독합니다. 그런 다음 1% 리도카인을 쥐의 두피에 국소적으로 바르고 현미경으로 두개골이 완전히 노출되도록 작게 절개합니다.
알림: 절차 전반에 걸쳐 멸균 기구를 사용하십시오. - 10μL 주사기 2개를 준비합니다: 하나는 AAV2/5-A 2A R-shRNA(역가: 6.27 × 10 9 vg/μL)를 구입하고 다른 하나는 AAV2/5-Scramble(역가:6.21× 109 vg/μL)을 구입합니다.
알림: 주사기를 사용할 때 프런트 엔드를 유리 모세관에 연결해야 하며 유리 모세관의 길이를 제어하여 10μL의 범위를 얻을 수 있습니다. - 현미경을 사용하여 브레그마와 람다를 찾고 좌표점(AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20)을 10μL 주사기에 표시합니다(그림 1). 좌표점은 마우스 뇌 입체 아틀라스(15)를 기반으로 한다.
- 조정된 좌표 지점에서 두개골에 작은 구멍을 뚫습니다.
알림: 현미경에서 드릴링은 두개골 표면에 대해 멸균 마이크로 드릴을 사용하여 수행됩니다. 시추 후 뇌를 덮고 있는 뇌수막을 제거하고 뇌 실질(parenchyma)을 노출시킴으로써 혈관 손상을 예방할 수 있습니다. 이 단계는 유리 모세관의 끝이 수막에 의해 부러지는 것을 방지합니다. 뚫린 구멍의 직경은 바늘 끝이 뇌 조직에 들어갈 수 있을 만큼 충분해야 합니다. - AAV2/5-A 2A R-shRNA 바이러스2μL를 100nL/min의 일정한 속도로 측면 주입 을 통해 뇌실에 투여합니다. 빼기 전에 바늘을 10분 동안 제자리에 두십시오. 바이러스는 일방적인 주사로 투여되었습니다.
- 의료용 바이오피브린 접착제를 사용하여 손상된 피부를 즉시 밀봉하여 바이러스 손실을 방지하고, 접착제를 빨리 바르지 않으면 바늘을 제거한 후 CSF로 헹굴 수 있습니다. 또한 면봉으로 뇌척수액을 닦으면 바이러스가 손실될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- 회복을 촉진하려면 마우스를 온열 패드에 올려 체온을 37.0 ± 0.5 °C로 유지하고 1% 리도카인을 쥐의 두피에 국소적으로 바릅니다. 이 기간은 AAV2/5-A 2A R-shRNA 바이러스 발현 및 후속 A2AR knockdown에 필요하므로 EAE 모델을 유도하기 전에마우스를 2주 동안 회복시킵니다.
3. X-overP1(Cre/LoxP) 시스템의 Cre/locus를 사용한 A 2A R의 ChP 특이적 녹다운
참고: 다음 절차는 앞에서 설명한 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 자세한 주입 방법은 2.1-2.11단계를 참조하십시오.
- 실험군으로 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato 마우스의 각 외측심실에 2μL의 CRE-TAT 재조합효소를 주입하고 대조군으로 2μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입합니다. 위와 동일한 프로토콜(섹션 2)을 사용하여 2μL의 CRE-TAT 재조합효소를 대조군으로 2μL의 멸균 PBS와 함께A 2AR 플록스/플록스 마우스의 각 외측 심실에 주입합니다.
- 냉동 조직 절편을 준비하고 CRE-TAT 재조합효소 주입 후 2주 후에 핵 염색을 수행합니다. 자세한 내용은 4.1-4.3단계를 참조하십시오.
4. 생쥐의 심 경관류
- 60-80mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 투여하여 생쥐를 깊이 마취시킵니다. 발가락 꼬집음으로 마취면을 확인하고 멸균 PBS 용액 40mL와 4% 파라포름알데히드(PFA) 20mL를 사용하여 심 경관류를 수행합니다.
알림: 성공적인 관류는 간에서 흰색으로 표시되며 관류 중 폐가 커지거나 입에서 PBS 유출이 발생하면 절차가 실패했음을 나타냅니다. - 쥐의 뇌를 빠르게 추출하여 단백질 분해를 최소화합니다.
- 고정 후 마우스 뇌를 4% PFA/PBS에 하룻밤 동안 담근 다음 30% 자당 PB 용액으로 72시간 동안 교체합니다.
참고: 뇌 조직의 과도한 탈수를 피하는 것이 중요하므로 뇌를 자당 PB 용액에 너무 오래 방치해서는 안 됩니다.
5. 냉동 조직 절편 및 염색
- 이전에 탈수된 쥐의 뇌를 최적의 절단 온도(OCT) 접착제에 삽입하고, 내장된 뇌를 동결하고, 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 20μm 두께의 관상 절편을 절단합니다.
- 유리 슬라이드에 뇌 부분을 놓습니다. 뇌 절편이 건조되면 후속 실험을 위해 -20°C 냉장고에 보관합니다.
- 각 유리 슬라이드를 프레임 케이스에 넣고 PBS로 채워진 용기에 프레임을 담가 슬라이드를 완전히 헹굽니다. PBS 용액으로 뇌 슬라이드를 10분 동안 세 번 부드럽게 헹굽니다.
알림: 뇌 부분이 유리 슬라이드에서 떨어지지 않도록 주의해야 합니다. - 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 용액으로 10분 동안 뇌 슬라이드를 염색합니다.
- PBS 용액으로 5분 동안 브레인 슬라이드를 헹굽니다.
- 안티페이드 마운팅 배지 한 방울을 뇌 부위에 바릅니다.
- 뇌 절편에 커버슬립을 씌우고, 매니큐어로 커버슬립을 밀봉한 다음, 기존의 형광 현미경을 사용하여 절편을 분석합니다.
6. EAE 감응작용
NOTE: shRNA 또는 CRE-TAT 재조합효소 주입 2주 후 EAE 유도를 수행합니다11.
- 2.5mg의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG35-55)과 2mL의 PBS를 혼합하여 수용액을 만듭니다. M. tuberculosis (H37Ra)와 불완전 Freunds 보조제(IFA)를 혼합하여 완전한 Freunds adjuvant(CFA) 오일 용액을 준비합니다.
- 수용액과 오일 용액을 1:1 비율로 혼합합니다. 티 파이프를 사용하여 혼합물을 수중 오일 상태로 휘젓습니다.
알림: 티 파이프는 3방향 파이프라고도 합니다. MOG35-55 와 CFA를 완전히 혼합하기 위해 용액의 흐르는 방향을 제어할 수 있는 플라스틱 튜브입니다. - 고속 균질화기를 사용하여 얼음 수조 조건에서 EAE 모델용 MOG 항원 에멀젼을 만듭니다.
- 60-80mg/kg 펜토바르비탈에 해당하는 6-8mL/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 복강내로 마취합니다.
- MOG 항원 에멀젼을 4개의 다른 지점(목, 등, 좌우 엉덩이)에 10mL/kg의 부피로 피하 주사하여 각각 총 4회 주사합니다.
참고: 주사 부위를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다., 다른 부위가 쥐의 이환율과 사망률에 다양한 영향을 미칠 수 있기 때문에. 또한 MOG 주사를 반복하면 면역 내성이 생길 수 있으므로 연구팀은 이러한 잠재적인 문제를 방지하기 위해 단일 주사 방법을 선택했습니다. - MOG 주입 후 즉시 5mg/kg의 용량으로 500ng/mL의 백일해 독소(PT)를 복강내로 주사합니다.
참고: PT는 혈액뇌장벽(BBB)의 투과성을 증가시키고 T 세포가 뇌로 침투하는 것을 촉진합니다. - 48시간 후 PT 용액을 동일한 부피로 복강내 주사합니다.
7. 신경학적 결손 점수
- 다음과 같은 신경학적 결함에 따라 EAE의 발생률과 중증도를 평가하기 위해 0에서 15까지의 평가 척도16 을 사용하여 매일 마우스를 평가하고 등급을 매깁니다.
꼬리: 0은 징후가 없음을 나타내고, 1은 반쯤 마비된 꼬리를 나타내고, 2는 완전히 마비된 꼬리를 나타냅니다.
팔다리: 0은 징후가 없음을 나타내고, 1은 약하거나 변화된 걸음걸이를 나타내고, 2는 마비를 나타내고, 3은 완전히 마비된 팔다리를 나타냅니다. - 완전 마비가 있는 사지 마비 동물에게 12점을 할당하고 사망률에 15점을 할당합니다.
8. 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색
- 탈수된 쥐의 뇌를 녹인 파라핀에 집어넣는다. 나중에 사용할 수 있도록 파라핀 블록을 식히고 응고시키십시오.
알림: 파라핀 블록은 조직 손상을 방지하기 위해 완전히 건조되고 차갑어야 합니다. - 생쥐 뇌 파라핀 블록을 5μm 두께의 슬라이드로 자릅니다. 파라핀 마우스 뇌 절편을 유리 슬라이드에 놓고 60°C 오븐에서 3시간 동안 건조시킵니다.
- 슬라이드를 크실렌 용액 I에 10분, 크실렌 용액 II에 10분, 100% 알코올 I에 3분, 100% 알코올 II에 3분, 95% 알코올에 3분, 90% 알코올에 3분, 80% 알코올에 3분, 70% 알코올에 3분, 증류수에 순차적으로 담그십시오.
9. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 분석
- PBS로 마우스를 관류한 후 심실에서 ChP를 제거하고 Trizol로 RNA를 추출합니다. 첫 번째 Strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
- Ex Taq SYBR-green 프리믹스 및 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 qPCR 분석을 수행합니다. 다음 A2AR 프라이머를 사용하십시오 : 앞으로 - GCCATCCCATTCGCCATCA; 역 - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
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Representative Results
AAV2/5-shRNA 또는 CRE-TAT의 ICV 주입에 의한 ChP 특이적A 2AR knockdown
EAE 발병기전에서 신경 정보의 강력한 조절자로서 ChP에서A 2AR의 역할은 불분명합니다. ChP 특이적 A 2A R 발현을 녹다운하면 EAE 및 기타 신경계 염증의 중추 면역 체계에 대한 A2AR 조절 효과를 밝힐 수 있습니다. 이 연구는 CRE-TAT의 ICV 주입을 사용하여 A 2A R 플록스/플록스 마우스의 ChP에서A 2AR 발현을 감소시켰습니다. ChP 특이성을 보장하기 위해 먼저 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9) 마우스의 외측 심실에 CRE-TAT를 주입했습니다. 이미지는 자발적인 tdTomato 형광이 ChP 조직으로 제한되었음을 나타냅니다(그림 2). 이와 유사하게, 이 연구는 AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-CMV 강화 녹색 형광 단백질(EGFP)을 C57BL/6 마우스에 투여한 결과, EGFP 형광이 ChP의 상피 세포층에 국한되고 외측 심실 근처의 주변 실질 세포를 감염시키지 않는 것을 발견했습니다(그림 3).
MOG35-55를 사용한 EAE 유도
안정적인 EAE를 유도하기 위해 마우스에 MOG35-55 및 CFA로 구성된 에멀젼을 피하 주사한 후 면역 후 0일과 2일에 PT를 복강내 주사했습니다(그림 4). 임상 증상 척도는 꼬리와 팔다리 상태에 따라 매일 EAE 점수를 평가하는 데 사용되었습니다. EAE의 시작은 EAE 점수가 ≥1인 첫날로 정의되었으며, 시작과 최대 EAE 점수 사이의 기간을 진행단계라고 했습니다.
ChP 특이적A 2AR 녹다운으로 EAE 병리 완화
EAE 병리학에서 A 2A R 신호의 관여를 조사하기 위해 이 연구는 ChP 특이적 A2AR녹다운을 사용했습니다. 이 연구는 특히 CRE-TAT 또는 AAV2/5-A2AR-shRNA의 ICV 주입을 사용하여 ChP에서 A2AR을 녹다운했습니다. 넉다운 후 2주에, EAE는 MOG35-55 면역에 의해 유도되었다. 그 결과, 대조군에 비해 A2AR 넉다운을 받은 마우스는 점수가 낮고 척수에서 면역 세포의 침윤이 감소한 것으로 입증되었듯이 더 가벼운 EAE 병리학을 발달시켰습니다(그림 5A,B,E,F). 또한, MOG35-55 면역 후 20일째에 각 그룹에서 5마리의 EAE 유도 마우스를 무작위로 선택했습니다. PBS로 관류 후, RNA 추출 및 qPCR을 위해 ChP를 분리했습니다. qPCR 분석 결과, AAV2/5-shRNA(A 2A R-Kd) 및 CRE-TAT 그룹에서 A2AR의mRNA수준이 각 대조군에 비해 분명히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 5C,D).
그림 1: 외측 심실 주사 부위의 해부학적 국소화. (A) 바이러스 주입 지점을 보여주는 개략도. (B) 외측 심실의 주사 부위는 빨간색 점으로 표시된 바와 같이 브레그마 아래 0.58mm, 시상 봉합사 측면 1.1mm에 위치합니다. (C) 마우스에 바이러스를 주입한 부위를 보여주는 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ChP에서 tdTomato 형광의 국소화 (A,B) CRETAT의 ICV 주입으로 처리한 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato 마우스의 대표 이미지. 2주 후, tdTomato 자가형광은 ChP 조직(n=3/그룹)에 특이적으로 국한되었습니다. (씨,디) tdTomato 자가형광 및 DAPI의 병합된 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: AAV2/5-scramble-EGFP 또는 AAV2/5-shRNA-EGFP의 ICV 주입 2주 후 촬영한 C57BL/6 마우스의 대표 이미지. (A,B) AAV2/5-scramble-EGFP를 주입한 마우스의 대표 이미지(n=3/그룹). (씨,디) AAV2/5-shRNA-EGFP(n=3/group)를 주입한 마우스의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: EAE 모델의 유도. (A) 첫째, MOG 항원 에멀젼을 4개의 다른 위치(목, 등, 왼쪽 및 오른쪽 엉덩이)에 피하 주사하며 빨간색 점으로 표시됩니다. (B) PT는 예방접종 시 복강내 주사를 2일 후에 반복한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: A 2A R의 ChP 특이적 녹다운은 EAE 병리를 완화시켰습니다. (A) CRE-TAT의 ICV 주입을 통해 달성된 A 2A R 플록스/플록스 마우스에서 A2AR의 ChP 특이적 녹다운은 EAE 임상 점수 감소(n=6-7/그룹)를 초래했습니다. 통계 분석은 twoway RM ANOVA를 사용한 후 Sidak의 다중 비교 검정을 사용하여 수행되었습니다. (B) AAV2/5-shRNA의 ICV 주입으로 달성된 야생형(WT) 마우스에서 A2AR의 ChP 특이적 녹다운은 EAE 임상 점수를 감소시켰습니다(n=7-8/그룹). 통계 분석은 twoway RM ANOVA를 사용한 후 Sidak의 다중 비교 검정을 사용하여 수행되었습니다. (씨,디) ChP 조직에서 A2A R mRNA수준의 qPCR 분석 결과(n=5/그룹). 통계 분석은 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. (E,F) H&E 염색. ChP 특이적 A2AR 녹다운은 척수로의 면역 세포 침투를 약화시켰습니다. 통계적 유의성은 ###p < 0.001, **p < 0.01, ***p < 0.001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 ChP 유전자의 표적 녹다운에 대한 두 가지 뚜렷한 접근 방식을 제시했습니다. 첫 번째 접근법은 Cre 재조합 효소를 함유한 CRE-TAT를 A2AR 플록스/플록스 마우스에 ICV로 주입하는 것이었습니다. 두 번째 접근법은 A2AR의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV 주입을 수반했습니다. 이 두 가지 전략을 활용함으로써 ChP 내에서 A 2A R의 선택적 녹다운을 달성하고 EAE 병리학에 대한 ChP의 A2AR 신호 억제의보호 효과를 입증할 수 있었습니다. 참고로 이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫째, 입체 위치 파악 작업이 필수적이며, 제안된 좌표에서 크게 벗어나면 무작위 오류가 발생할 수 있습니다. 둘째, 주입된 바이러스의 부피가 매우 중요한데, 1μL 미만의 바이러스(~6 x 1012)를 주입하는 것도 실패할 가능성이 있는 것으로 밝혀졌기 때문입니다. 이는 충분한 감염을 위해 적절한 양의 바이러스 입자가 필요하기 때문일 수 있습니다.
Cre/LoxP 시스템을 사용하면 ICV 주입 후 뇌에서 CRE-TAT 재조합효소의 정확한 분포를 관찰할 수 없었습니다. 그 결과, 이 연구는 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato 마우스를 사용하여 tdTomato 단백질의 자가형광을 사용하여 CRE-TAT의 분포를 추적했습니다. tdTomato 형광은 CRE-TAT 뇌내 뇌실을 주입한 후 2주 후에 ChP 조직에서만 발견되었으며, 이는 재조합효소가 ChP에 주로 흡수되었음을 나타냅니다. 다음으로, CRE-TAT를 A 2A R flox/flox 마우스에 투여하고, ChP 조직에서 A2A R mRNA수준의 감소를 관찰하였다. 이 표적 녹다운 전략은 심리적 스트레스를 매개하는 ChP에서 코르티코스테로이드 신호전달의 역할을 조사하는 데 사용되었다17. 이 연구는 AAV2/5를 사용하여 ChP 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 전달했습니다. 이전 연구에서는 ChP 조직에서 AAV와 렌티바이러스의 다양한 혈청형의 감염 능력을 평가한 결과 AAV2/5 및 AAV2/8이 가장 효과적인 것으로 나타났습니다14. 이 연구는 AAV2/5가 다른 뇌 영역에 명백한 감염을 일으키지 않고 ChP를 특이적으로 감염시킬 수 있다는 것을 밝혔습니다. 이 두 가지 방법은 두 개의 형질전환 라인(Cre 및 Flox 라인)이 필요한 기존 녹아웃 전략보다 덜 힘들다6,18. 이 연구의 한 가지 한계는 유전자 과발현에 대한 기능 이득 실험이 없다는 것입니다. 그러나 이를 달성하기 위한 가능한 접근 방식은 전체 cDNA를 복제하여 ICV 감염을 통해 투여되는 AAV2/5 바이러스에 포장하는 것입니다. 이전 연구에서 AAV2/5를 사용한 ChP에서 NKCC1의 과발현은 뇌척수액 청소를 촉진하고 생체 내 뇌실 비대를 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다 9. AAV2/5 또는 Cre/LoxP 전략에는 고유한 이점이 있다는 점에 유의해야 합니다. 형질전환 마우스에 CRE-TAT를 ICV로 주입하면 표적 유전자가 세포의 DNA에서 직접 삭제되기 때문에 높은 녹다운 효율이 보장됩니다. 그러나 이 방법은 플록시드 마우스 생산 및 번식에 따라 다릅니다. 반면에, AAV2/5의 ICV 주입은 형질전환 마우스를 번식시키는 시간 소모적인 과정을 피할 수 있습니다. 그러나 이 방법의 knockdown 효율은 설계된 shRNA의 성능에 크게 좌우됩니다. 따라서 연구자는 실험 조건에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있습니다.
다발성 경화증(MS)은 중추신경계의 백질에 염증과 탈수초화를 일으키는 자가면역 질환입니다19. 다발성경화증의 병리학적 메커니즘을 연구하기 위해 연구자들은 탈수초화 및 면역 침윤과 같은 질병의 증상을 시뮬레이션하는 EAE 모델을 사용했습니다. 이 모델은 MS를 이해하는 데 이상적인 것으로 간주됩니다. 2009년에는 다발성경화증 병리학에서 면역세포 진입의 핵심 경로인 ChP를 통해 면역세포가 중추신경계에 침투한다는 사실이 밝혀졌습니다. 면역 세포의 "첫 번째 파동"은 ChP를 통해 뇌척수액으로 들어가고, BBB20을 통해 뇌 실질로 들어가는 "두 번째 파동"이 뒤따릅니다. 면역 세포의 "첫 번째 파동"은 염증을 촉진하고 BBB 누출을 가속화하므로 ChP에서 면역 침윤을 억제하는 것이 다발성 경화증의 조기 개입에 유용할 수 있습니다. 케모카인과 접착 분자는 ChP의 게이팅 활성을 조절하여 림프구가 이를 가로질러 침투하는 능력을 제어합니다21,22,23.
이전 연구에서는 ChP의 신호 분자를 조사하기 위해 전신 녹아웃 또는 약리학적 기술(예: 중화 항체)을 사용했지만, 이러한 방법은 MS 병리학적 과정에서 생물학적 기능을 정확하게 정의하지 못했습니다. 최근 연구에서 연구원들은 A 2A R 플록스/플록스 마우스의 ChP에 위치한A 2AR을 녹다운하고 EAE 점수와 면역 침투가 현저히 감소한 것을 발견했습니다11. 이 연구는 EAE 병리학 중 ChP에서A 2AR 신호의 역할을 확인하고 ChP 특이적 녹다운 방법이 CNS 병리학에서 ChP 기능을 연구하는 데 유용한 도구임을 보여줍니다.
결론적으로, ChP 특이적 조작 프로토콜은 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성경화증 등과 같은 중추신경계의 퇴행성 질환과 관련된 ChP의 생물학적 기능을 탐구하는 데 이상적인 도구입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 선언할 기타 공개가 없다고 말합니다.
Acknowledgments
우리는 이 작업에 대한 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 31800903, W. Zheng에게 수여)과 Wenzhou Science and Technology Project(No. Y2020426, Y. Y. Weng에게 수여)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
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