Summary
هنا ، نصف طريقة لتغيير التعبيرات الجينية بشكل انتقائي في الضفيرة المشيمية مع تجنب أي تأثير في مناطق الدماغ الأخرى.
Abstract
تعمل الضفيرة المشيمية (ChP) كبوابة حرجة لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. أظهرت الأبحاث الحديثة أن تنظيم نشاط ChP قد يوفر الحماية ضد اضطرابات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن دراسة الوظيفة البيولوجية ل ChP دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى أمر صعب بسبب هيكله الدقيق. تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لضربة قاضية للجينات في أنسجة ChP باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) أو بروتين إعادة التركيب الدائري (Cre) الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT). تظهر النتائج أنه بعد حقن AAV أو CRE-TAT في البطين الجانبي ، كان التألق يتركز حصريا في ChP. باستخدام هذا النهج ، نجحت الدراسة في إسقاط مستقبل الأدينوزين A 2A (A2A R) في ChP باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أو Cre / locus لأنظمة X-overP1 (Cre / LoxP) ، وأظهرت أن هذه الضربة القاضية يمكن أن تخفف من أمراض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). قد يكون لهذه التقنية آثار مهمة على الأبحاث المستقبلية حول دور ChP في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
غالبا ما كان يعتقد أن الضفيرة المشيمية (ChP) تساعد في الحفاظ على التوازن الوظيفي للدماغ عن طريق إفراز السائل النخاعي (CSF) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) 1,2. كشفت الأبحاث المتزايدة على مدى العقود الثلاثة الماضية أن ChP يمثل مسارا متميزا لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS).
تحافظ الوصلات الضيقة (TJs) ل ChP ، المكونة من ظهارة ChP أحادية الطبقة ، على التوازن المناعي عن طريق منع الجزيئات الكبيرة والخلايا المناعية من دخول الدماغ3. ومع ذلك ، في ظل ظروف مرضية معينة ، يكتشف نسيج ChP ويستجيب للأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (DAMPs) في السائل الدماغي النخاعي والدم ، مما يؤدي إلى تسلل مناعي غير طبيعي وخلل وظيفي في الدماغ 4,5. على الرغم من دوره الحاسم ، فإن صغر حجم ChP وموقعه الفريد في الدماغ يجعل من الصعب دراسة وظيفته دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى. لذلك ، فإن معالجة التعبير الجيني على وجه التحديد في ChP هو نهج مثالي لفهم وظيفته.
في البداية ، كانت الخطوط المعدلة وراثيا لإنزيم إعادة التركيب الدائري (Cre) ، والتي تعبر عن Cre تحت سيطرة المروجين الخاصين بالجينات المعبر عنها في ChP ، تستخدم بشكل شائع لحذف الجينات المستهدفة عن طريق التكاثر بجينات مرشحة متخبطة6،7،8. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن عامل النسخ Forkhead box J1 (FoxJ1) حصريا في ظهارة ChP لدماغ الفأرقبل الولادة 7. وهكذا ، غالبا ما تم استخدام خط FoxJ1-Cre لحذف الجينات الموجودة في ChP 6,9. ومع ذلك ، فإن نجاح هذه الاستراتيجية يعتمد بشكل كبير على خصوصية المروج. تم اكتشاف تدريجيا أن نمط تعبير FoxJ1 لم يكن مميزا بما فيه الكفاية ، حيث كان FoxJ1 موجودا أيضا في الخلايا الظهارية الهدبية في أجزاء أخرى من الدماغ والجهاز المحيطي7. للتغلب على هذا القيد ، تم إجراء حقن داخل الدماغ البطيني (ICV) من Cre recombinase لتوصيل recombinase إلى البطينين من الخطوط المعدلة وراثيا floxed. أظهرت هذه الاستراتيجية خصوصية عالية ، كما يتضح من وجود مضان tdTomato فقط في أنسجة ChP10,11. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطريقة محدودة بسبب توفر خطوط الماوس المعدلة وراثيا. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدم الباحثون حقن ICV للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP أو الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة12,13. كشف تقييم شامل للأنماط المصلية المختلفة لعدوى AAV لعدوى ChP أن AAV2 / 5 و AAV2 / 8 يظهران قدرات عدوى قوية في ChP ، بينما لا يصيبان مناطق الدماغ الأخرى. ومع ذلك ، وجد أن AAV2 / 8 يصيب البطانة العصبية المحيطة بالبطينين ، في حين أن مجموعة AAV2 / 5 لم تظهر أي عدوى14. هذه الطريقة لها ميزة التغلب على قيود الحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا.
توضح هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لضربة قاضية للجين في ChP باستخدام طريقتين: ICV ل AAV2 / 5 الذي يحمل shRNA لمستقبل الأدينوزين A 2A (A 2A R) وبروتين Cre recombinase الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT) RECOMBINASE لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP لA 2A R. تشير نتائج الدراسة إلى أن هدمA 2AR في ChP يمكن أن يخفف من التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). يوفر هذا البروتوكول التفصيلي إرشادات مفيدة لدراسات وظائف ChP والضربة القاضية المحددة للجينات في ChP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ونتشو الطبية.
1. الحيوانات
- شراء ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ويزن 20-22 جم.
- احصل على خط الفأر Rosa-LSL المعدل وراثيا (Lox-StoP-Lox) -tdTomato (Ai9) ، وذكور الفئرانA 2AR flox/ flox .
- قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين والمنزل في أقفاص ، بحد أقصى خمسة فئران لكل قفص ، تحت دورة مظلمة قياسية مدتها 12 ساعة / 12 ساعة لمدة أسبوع واحد.
- تزويد الفئران بما يكفي من الطعام والماء والحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة عند 25 درجة مئوية.
2. ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2ARs مع AAV2 / 5-shRNA
- وزن كل ماوس وكتابة القيم.
- تخدير الفئران داخل الصفاق ب 1٪ من صوديوم بنتوباربيتال بجرعة 6-8 مل / كجم تعادل 60-80 مجم / كجم بنتوباربيتال ، وضع الماوس على وسادة تدفئة لإبقائه دافئا.
ملاحظة: من الضروري إعطاء الجرعة الصحيحة من صوديوم بنتوباربيتال وفقا لوزن الفأر لضمان نجاح الجراحة. يجب ألا يكون التخدير عميقا جدا ، لأنه قد يؤدي إلى الوفاة ، ولكن لا ينبغي أن يكون ضحلا جدا ، حيث قد يستيقظ الفأر أثناء العملية ، مما قد يؤثر على فعالية حقن الفيروس. تحقق من جرعة التخدير المناسبة عن طريق قرصة إصبع القدم وتأكد من أن الفئران لا تستجيب. - استخدم ماكينة حلاقة فأر متخصصة لقص الشعر العلوي للفئران المخدرة.
- ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف ، وقم بتثبيت الفئران على جهاز تجسيمي لشل حركة الدماغ. تغطية الحيوان مع ثنى معقمة.
- تعقيم جلد الرأس والرقبة من الفئران تماما مع ثلاث جولات من مطهر اليودوفور والكحول 75 ٪ للحد من العدوى بعد العملية الجراحية. ثم ضع 1٪ يدوكائين موضعيا على فروة رأس الفئران وقم بعمل شق صغير لفضح الجمجمة بالكامل تحت المجهر.
ملاحظة: استخدم أدوات معقمة طوال العملية. - قم بإعداد حقنتين سعة 10 ميكرولتر: واحدة مع AAV2 / 5-A 2A R-shRNA المشتراة (عيار: 6.27 × 10 9 vg / μL) والأخرى مع AAV2 / 5-Scramble المشتراة (عيار:6.21× 109 vg / μL).
ملاحظة: عند استخدام المحقنة ، يجب توصيل الواجهة الأمامية بشعيرات زجاجية ، ويمكن الحصول على نطاق 10 ميكرولتر عن طريق التحكم في طول الشعيرات الدموية الزجاجية. - استخدم المجهر لتحديد موقع bregma و lambda وتعيين نقطة الإحداثيات (AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20) على حقنة 10 ميكرولتر (الشكل 1). تعتمد نقطة الإحداثيات على الأطلس التجسيمي لدماغ الفأر15.
- حفر ثقب صغير في الجمجمة عند نقطة الإحداثيات المعدلة.
ملاحظة: تحت المجهر ، يتم إجراء الحفر باستخدام مثقاب دقيق معقم على سطح الجمجمة. بعد الحفر ، عن طريق إزالة السحايا التي تغطي الدماغ وكشف حمة الدماغ الكامنة ، يتم منع إصابة الأوعية الدموية. تمنع هذه الخطوة طرف الشعيرات الدموية الزجاجية من الكسر بواسطة السحايا. يجب أن يكون قطر الثقب المحفور كافيا للسماح لطرف الإبرة بدخول أنسجة المخ. - تطبيق 2 ميكرولتر من فيروس AAV2 / 5-A2AR-shRNA في بطين الدماغ عن طريق الحقن الجانبي بمعدل ثابت 100 nL / دقيقة. احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق قبل الانسحاب. لاحظ أن الفيروس كان يدار عن طريق الحقن من جانب واحد.
- أغلق الجلد المصاب باستخدام غراء البيوفيبرين الطبي على الفور لمنع فقدان الفيروس ، والذي يمكن شطفه باستخدام السائل الدماغي الشوكي بعد إزالة الإبرة إذا لم يتم تطبيق الغراء بسرعة. أيضا ، لا تستخدم أعواد القطن لمسح السائل الدماغي النخاعي ، لأنها قد تسبب أيضا فقدان الفيروس.
- لتسهيل الشفاء ، ضع الماوس على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37.0 ± 0.5 درجة مئوية ، وقم بتطبيق 1٪ ليدوكائين موضعيا على فروة رأس الفأر. اسمح للفئران بالتعافي لمدة أسبوعين قبل تحفيز نموذج EAE ، لأن هذه الفترة ضرورية لتعبير فيروس AAV2 / 5-A 2A R-shRNA وضربة قاضية A2AR اللاحقة.
3. ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2AR مع Cre / locus لنظام X-overP1 (Cre / LoxP)
ملاحظة: يمكن تحقيق الإجراءات التالية باستخدام الطريقة الموضحة سابقا. راجع الخطوات 2.1-2.11 للحصول على طرق الحقن التفصيلية.
- حقن 2 ميكرولتر من CRE-TAT recombinase في كل بطين جانبي لفأر Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato كمجموعة تجريبية و 2 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) كمجموعة ضابطة. باستخدام نفس البروتوكول المذكور أعلاه (القسم 2) ، قم بحقن 2 ميكرولتر من CRE-TAT recombinase في كل من البطينين الجانبيين للفئرانA 2AR flox/ flox جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من PBS المعقمة كمجموعة تحكم.
- تحضير أقسام الأنسجة المجمدة وإجراء تلطيخ نووي بعد 2 أسابيع من حقن CRE-TAT recombinase. راجع الخطوات 4.1-4.3 للحصول على مزيد من المعلومات.
4. التروية عبر القلب في الفئران
- تطبيق 60-80 ملغ/ كغ من صوديوم بنتوباربيتال لتخدير الفئران بعمق. قم بتأكيد مستوى التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم وقم بإجراء التروية عبر القلب باستخدام 40 مل من محلول PBS المعقم متبوعا ب 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
ملاحظة: يشار إلى التروية الناجحة باللون الأبيض في الكبد ، في حين أن وجود رئتين متضخمتين أو تدفق PBS من الفم أثناء التروية يشير إلى فشل الإجراء. - استخراج دماغ الفأر بسرعة ، وضمان الحد الأدنى من تدهور البروتين.
- اغمر دماغ الفأر في 4٪ PFA / PBS طوال الليل لما بعد التثبيت ، متبوعا بالاستبدال بمحلول 30٪ سكروز PB لمدة 72 ساعة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب الجفاف المفرط لأنسجة المخ ، لذلك لا ينبغي ترك الدماغ في محلول السكروز PB لفترة طويلة.
5. تقسيم الأنسجة المجمدة وتلطيخها
- قم بتضمين دماغ الفأر المجفف سابقا في غراء درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتجميد الدماغ المضمن ، واستخدم ميكروتوم منزلق لقطع المقاطع الإكليلية بسمك 20 ميكرومتر.
- ضع أقسام الدماغ على الشريحة الزجاجية. بمجرد أن تجف أقسام الدماغ ، قم بتخزينها في ثلاجة -20 درجة مئوية لإجراء تجارب لاحقة.
- ضع كل شريحة زجاجية في علبة إطار واغمر الإطار في وعاء مملوء ب PBS لشطف الشريحة جيدا. شطف بلطف شرائح الدماغ مع حل PBS ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لمنع أقسام الدماغ من السقوط من الشريحة الزجاجية. - قم بتلطيخ شرائح الدماغ بمحلول 4 ′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 10 دقائق.
- شطف شرائح الدماغ بمحلول PBS لمدة 5 دقائق.
- ضع قطرة واحدة من وسيط تركيب مضاد التلاشي على أقسام الدماغ.
- ضع غطاء على أقسام الدماغ ، وأغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر ، وحلل الأقسام باستخدام مجهر مضان تقليدي.
6. تحريض EAE
ملاحظة: إجراء تحريض EAE بعد أسبوعين من حقن shRNA أو CRE-TATrecombinase 11.
- قم بإنشاء محلول مائي عن طريق خلط 2.5 ملغ من البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG35-55) مع 2 مل من PBS. قم بإعداد محلول زيت فرويندز المساعد (CFA) الكامل عن طريق خلط المتفطرة السلية (H37Ra) مع مساعد فرويندز غير المكتمل (IFA).
- امزج المحاليل المائية والزيتية بنسبة 1: 1. استخدم أنبوب الإنطلاق لخفق الخليط في حالة الزيت في الماء.
ملاحظة: يسمى أنبوب نقطة الإنطلاق أيضا أنبوبا ثلاثي الاتجاهات. إنه أنبوب بلاستيكي يمكنه التحكم في اتجاه المحلول المتدفق لخلط MOG35-55 و CFA بالكامل. - استخدم خالط عالي السرعة لصنع مستحلب مستضد MOG لنموذج EAE في ظل ظروف حمام الجليد.
- تخدير الفئران داخل الصفاق ب 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 6-8 مل / كجم تعادل 60-80 مجم / كجم بنتوباربيتال.
- حقن مستحلب مستضد MOG تحت الجلد في أربع نقاط مختلفة (الرقبة والظهر والوركين الأيسر والأيمن) بحجم 10 مل / كجم لما مجموعه أربع حقن لكل منهما.
ملاحظة: من المهم اختيار موقع الحقن بعناية ، حيث قد يكون للمواقع المختلفة تأثيرات متفاوتة على مراضة الفئران ووفياتها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي حقن MOG المتكررة إلى تحمل المناعة ، لذلك اختار فريق البحث طريقة حقن واحدة لمنع هذه المشكلة المحتملة. - يحقن فورا 500 نانوغرام/مل من سم السعال الديكي (PT) داخل الصفاق بجرعة 5 ملغ/كغ بعد حقن MOG.
ملاحظة: يزيد PT من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ويسهل تسلل الخلايا التائية إلى الدماغ. - بعد 48 ساعة ، قم بحقن محلول PT داخل الصفاق بنفس الحجم.
7. درجة العجز العصبي
- تقييم وتصنيف الفئران يوميا باستخدام مقياس تصنيف 16 يتراوح من 0 إلى15 لتقييم حدوث وشدة EAE وفقا للعجز العصبي التالي:
الذيل: 0 يشير إلى عدم وجود علامات ، 1 يمثل ذيلا نصف مشلول ، و 2 يشير إلى ذيل مشلول تماما.
الأطراف: 0 تشير إلى عدم وجود علامات ، 1 تمثل مشية ضعيفة أو متغيرة ، 2 تشير إلى شلل جزئي ، و 3 تمثل طرفا مشلولا تماما. - تعيين مصاب بالشلل الرباعي المصاب بالشلل التام بدرجة 12 ، وتعيين معدل وفيات بدرجة 15.
8. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H&E)
- خذ دماغ الفأر المجفف وقم بتضمينه في البارافين المنصهر. اترك كتلة البارافين لتبرد وتتصلب لاستخدامها لاحقا.
ملاحظة: يجب أن تكون كتلة البارافين جافة تماما وباردة لتجنب تلف الأنسجة. - قطع كتلة البارافين الدماغ الفأر إلى شرائح 5 ميكرومتر. ضع قسم دماغ فأر البارافين على شريحة زجاجية وجففه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- اغمر الشرائح بالتتابع في محلول الزيلين I لمدة 10 دقائق ، ومحلول الزيلين II لمدة 10 دقائق ، والكحول 100٪ I لمدة 3 دقائق ، والكحول 100٪ II لمدة 3 دقائق ، والكحول 95٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول 90٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول بنسبة 80٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول بنسبة 70٪ لمدة 3 دقائق ، والماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
9. تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)
- بعد تعطير الفئران مع PBS ، قم بإزالة ChP من البطينين واستخراج الحمض النووي الريبي مع Trizol. توليف cDNA باستخدام أول مجموعة توليف cDNA ستراند.
- قم بإجراء تحليل qPCR باستخدام بريمكس Ex Taq SYBR-green ونظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. استخدم البادئاتA 2AR التالية: إلى الأمام - GCCATCCCATTCGCCATCA ؛ عكس - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ضربة قاضية A2AR خاصة ب ChP عن طريق حقن ICV ل AAV2 / 5-shRNA أو CRE-TAT
لا يزال دور A2AR في ChP كمنظم قوي للمعلومات العصبية في التسبب في EAE غير واضح. يمكن أن يؤدي هدم تعبير A 2A R الخاص ب ChP إلى إلقاء الضوء على التأثيرات التنظيمية A2AR على الجهاز المناعي المركزي في EAE والتهابات الجهاز العصبي الأخرى. استخدمت هذه الدراسة حقن ICV من CRE-TAT لتقليل تعبيرA2A R في ChP للفئرانA 2AR flox/ flox. لضمان خصوصية ChP ، قمنا أولا بحقن CRE-TAT في البطينين الجانبيين لفئران Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox) -tdTomato (Ai9). تشير الصور إلى أن مضان الطماطم tdTomato العفوي كان مقصورا على أنسجة ChP (الشكل 2). وبالمثل ، أعطت الدراسة AAV2 / 5-CMV-A2AR-shRNA-CMV بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) في الفئران C57BL / 6 ووجدت أن مضان EGFP كان مقصورا على طبقة الخلايا الظهارية ل ChP ولم يصيب الخلايا المتنية المحيطة بالقرب من البطينين الجانبيين (الشكل 3).
تحريض EAE مع MOG35-55
للحث على EAE المستقر ، تم حقن الفئران تحت الجلد بمستحلب يتكون من MOG35-55 و CFA ، يليه الحقن داخل الصفاق من PT في اليومين 0 و 2 بعد التحصين (الشكل 4). تم استخدام مقياس الأعراض السريرية لتقييم درجات EAE يوميا ، بناء على حالة الذيل والأطراف. تم تعريف بداية EAE على أنها اليوم الأول بدرجة EAE ≥1 ، بينما كانت المدة بين بداية وذروة درجات EAE تسمى المرحلة التقدمية.
ضربة قاضية A2AR خاصة ب ChP تخفف من أمراض EAE
للتحقيق في تورط إشارة A 2A R في علم أمراض EAE ، استخدمت الدراسة ضربة قاضية A2AR خاصةب ChP. قامت الدراسة على وجه التحديد بإسقاطA 2A R في ChP باستخدام حقن ICV من CRE-TAT أو AAV2 / 5-A2AR-shRNA. في 2 أسابيع بعد ضربة قاضية ، تم تحفيز EAE بواسطة التحصينMOG 35-55. أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، طورت الفئران المصابة بضربة قاضيةA 2AR أمراضا EAE أكثر اعتدالا ، كما يتضح من انخفاض الدرجات وانخفاض تسلل الخلايا المناعية في الحبل الشوكي (الشكل 5A ، B ، E ، F). بالإضافة إلى ذلك ، تم اختيار خمسة فئران مستحثة ب EAE من كل مجموعة في اليوم 20 بعد التحصينMOG 35-55 عشوائيا. بعد التروية باستخدام PBS ، تم عزل ChPs لاستخراج الحمض النووي الريبي و qPCR. أظهر تحليل qPCR أن مستويات mRNA لA2A R قد انخفضت بشكل واضح في مجموعات AAV2 / 5-shRNA (A2AR-Kd) و CRE-TAT ، مقارنة بكل عنصر تحكم (الشكل 5C ، D).
الشكل 1: التوطين التشريحي لموقع حقن البطين الجانبي. أ: شكل تخطيطي يوضح نقطة حقن الفيروس. (ب) يقع موقع حقن البطين الجانبي على بعد 0.58 مم أسفل البريغما، و1.1 مم من جانب الدرز السهمي، كما هو موضح بالنقطة الحمراء. ج: صورة توضح موقع حقن الفيروس على الفأر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توطين مضان الطماطم tdTomato في ChP . (A,B) صورة تمثيلية لفئران Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato المعالجة بحقن ICV من CRETAT. في 2 أسابيع في وقت لاحق ، تم توطين tdTomato autofluorescence على وجه التحديد إلى أنسجة ChP (n = 3 / مجموعة). (ج، د) الصور المدمجة ل tdTomato autofluorescence و DAPI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية للفئران C57BL / 6 مأخوذة بعد أسبوعين من حقن ICV ل AAV2 / 5-scramble-EGFP أو AAV2 / 5-shRNA-EGFP. (أ ، ب) الصور التمثيلية للفئران المحقونة ب AAV2 / 5-scramble-EGFP (ن = 3 / مجموعة). (ج، د) الصور التمثيلية للفئران المحقونة ب AAV2 / 5-shRNA-EGFP (n = 3 / مجموعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحريض نموذج EAE. (أ) أولا ، يتم حقن مستحلب مستضد MOG تحت الجلد في أربعة مواقع مختلفة (الرقبة والظهر والوركين الأيسر والأيمن) ، والتي يشار إليها بنقاط حمراء. (ب) يتم حقن PT داخل الصفاق في وقت التحصين ويتكرر بعد 2 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A 2A R خففت من أمراض EAE. (أ) أدت ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A 2A R في فئران A2AR flox /flox ، والتي تم تحقيقها من خلال حقن ICV من CRE-TAT ، إلى انخفاض الدرجات السريرية EAE (n = 6-7 / مجموعة). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام RM ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنة المتعددة ل Sidak. (ب) ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2AR في الفئران من النوع البري (WT) ، والتي تحققت مع حقن ICV من AAV2 / 5-shRNA ، انخفضت الدرجات السريرية EAE (ن = 7-8 / مجموعة). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام RM ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنة المتعددة ل Sidak. (ج، د) نتائج تحليل qPCR لمستويات A2AR mRNA في أنسجة ChP (n = 5 / مجموعة). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. (ه، و) تلطيخ H& E. أدت ضربة قاضية A2AR الخاصة ب ChP إلى إضعاف تسلل الخلايا المناعية إلى الحبل الشوكي. يتم تمثيل الدلالة الإحصائية على النحو التالي: ###p < 0.001 و ** p < 0.01 و ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدم البحث نهجين متميزين للضربة القاضية المستهدفة لجينات ChP. تضمن النهج الأول حقن ICV ل CRE-TAT ، الذي يحتوي على Cre recombinase ، في الفئرانA 2AR flox/ flox. أما النهج الثاني فينطوي على حقن القيمة المحلية ل AAV2/5 الذي يحمل الحمض النووي الريبوزي الريبي منA 2AR. من خلال استخدام هاتين الاستراتيجيتين ، حقق العمل ضربة قاضية انتقائية ل A 2A R داخل ChP وكان قادرا على إظهار الآثار الوقائية لتثبيط إشاراتA 2AR في ChP على أمراض EAE. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يتضمن خطوتين حاسمتين. أولا ، تعد عملية التوطين التجسيمي ضرورية ، وقد يؤدي الانحراف الكبير عن الإحداثيات المقترحة إلى فشل عشوائي. ثانيا ، يعد حجم الفيروس المحقون أمرا بالغ الأهمية ، حيث وجد أن حقن أقل من 1 ميكرولتر من الفيروس (~ 6 × 1012) لديه أيضا فرصة معينة للفشل. ربما يرجع ذلك إلى الحاجة إلى كمية كافية من جزيئات الفيروس للعدوى الكافية.
لم يسمح استخدام نظام Cre / LoxP بمراقبة التوزيع الدقيق ل CRE-TAT recombinase في الدماغ بعد حقن ICV. نتيجة لذلك ، استخدمت الدراسة فئران Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox) -tdTomato لتتبع توزيع CRE-TAT باستخدام التألق الذاتي لبروتين tdTomato . كان مضان tdTomato موجودا حصريا في أنسجة ChP بعد أسبوعين من حقن CRE-TAT داخل بطانة الرحم ، مما يشير إلى أن إعادة التركيب تم امتصاصها بشكل أساسي بواسطة ChP. بعد ذلك ، تم إعطاء CRE-TAT للفئرانA 2AR flox/ flox ، ولوحظ انخفاض في مستويات A2AR mRNA في أنسجة ChP. تم استخدام استراتيجية الضربة القاضية المستهدفة هذه للتحقيق في دور إشارات الكورتيكوستيرويد في ChP في التوسط في الإجهاد النفسي17. بدلا من ذلك ، استخدم البحث AAV2 / 5 لتوصيل shRNA المصمم لاستهداف جينات ChP. قامت الدراسات السابقة بتقييم قدرة العدوى للأنماط المصلية المختلفة من AAVs والفيروسات العدسية في أنسجة ChP ووجدت أن AAV2 / 5 و AAV2 / 8 كانا الأكثر فعالية14. كشفت الدراسة أن AAV2 / 5 كان قادرا على إصابة ChP على وجه التحديد دون التسبب في التهابات واضحة في مناطق الدماغ الأخرى. هاتان الطريقتان أقل شاقة من استراتيجيات خروج المغلوب الكلاسيكية التي تتطلب خطين معدلين وراثيا (خطوط Cre و Flox)6,18. أحد قيود هذه الدراسة هو عدم وجود تجربة كسب الوظيفة مع الإفراط في التعبير الجيني. ومع ذلك ، فإن النهج المحتمل لتحقيق ذلك هو استنساخ cDNA الكامل وتعبئته في فيروس AAV2 / 5 ، والذي سيتم إعطاؤه عن طريق عدوى ICV. في دراسة سابقة ، تم العثور على الإفراط في التعبير عن NKCC1 في ChP باستخدام AAV2 / 5 لتعزيز إزالة السائل الدماغي النخاعي وتقليل تضخم البطين في الجسم الحي9. من المهم ملاحظة أن استراتيجية AAV2 / 5 أو Cre / LoxP لها ميزتها الخاصة. يضمن حقن ICV ل CRE-TAT في الفئران المعدلة وراثيا كفاءة عالية في الضربة القاضية ، حيث يتم حذف الجين المستهدف مباشرة من الحمض النووي للخلايا. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطريقة على إنتاج وتربية الفئران المتخبطة. من ناحية أخرى ، فإن حقن ICV ل AAV2/5 يتجنب العملية التي تستغرق وقتا طويلا لتربية الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك ، فإن كفاءة ضربة قاضية لهذه الطريقة تعتمد إلى حد كبير على أداء shRNA المصمم. لذلك ، يمكن للباحثين اختيار طريقة مناسبة بناء على ظروفهم التجريبية.
التصلب المتعدد (MS) هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي تسبب التهاب وإزالة الميالين من المادة البيضاء في الجهاز العصبي المركزي19. لدراسة الآليات المرضية لمرض التصلب العصبي المتعدد ، استخدم الباحثون نموذج EAE الذي يحاكي أعراض المرض ، مثل إزالة الميالين وتسلل المناعة. يعتبر هذا النموذج مثاليا لفهم مرض التصلب العصبي المتعدد. في عام 2009 ، تم اكتشاف أن الخلايا المناعية تتسلل إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال ChP ، وهو طريق رئيسي لدخول الخلايا المناعية في أمراض التصلب العصبي المتعدد. تدخل "الموجة الأولى" من الخلايا المناعية السائل الدماغي النخاعي من خلال ChP ، تليها "الموجة الثانية" ، التي تدخل حمة الدماغ من خلال BBB20. تعزز "الموجة الأولى" من الخلايا المناعية الالتهاب وتسرع تسرب BBB ، لذا فإن تثبيط التسلل المناعي في ChP يمكن أن يكون مفيدا للتدخل المبكر في مرض التصلب العصبي المتعدد. تنظم الكيموكينات وجزيئات الالتصاق نشاط بوابة ChP ، وتتحكم في قدرة الخلايا الليمفاوية على التسلل عبرها21،22،23.
استخدمت الدراسات السابقة الضربة القاضية لكامل الجسم أو التكنولوجيا الدوائية (مثل تحييد الأجسام المضادة) للتحقيق في جزيئات الإشارات في ChP ، لكن هذه الطرق لم تحدد بدقة وظيفتها البيولوجية في العملية المرضية لمرض التصلب العصبي المتعدد. في دراسة حديثة ، قام الباحثون بإسقاط A 2A R ، الموجود في ChP للفئرانA 2AR flox/ flox ، ووجدوا أن درجات EAE والتسلل المناعي قد انخفضت بشكل كبير11. تؤكد هذه الدراسة دور إشاراتA 2AR في ChP أثناء علم أمراض EAE وتوضح أن طرق الضربة القاضية الخاصة ب ChP هي أدوات مفيدة لدراسة وظيفة ChP في أمراض الجهاز العصبي المركزي.
في الختام ، يعد بروتوكول التلاعب الخاص ب ChP أداة مثالية لاستكشاف الوظيفة البيولوجية ل ChP المشاركة في الأمراض التنكسية في الجهاز العصبي المركزي ، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر ومرض التصلب العصبي المتعدد وما إلى ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويذكر صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة أو إفصاحات أخرى يعلنان عنها.
Acknowledgments
ونعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31800903، الممنوحة ل W. Zheng) ومشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم Y2020426، الذي منح إلى Y. Y. Weng) لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P.
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
