Summary
Här beskriver vi en metod för att selektivt förändra genuttryck i plexus choroid samtidigt som man undviker påverkan i andra områden i hjärnan.
Abstract
Plexus choroidum (ChP) fungerar som en kritisk inkörsport för immuncellsinfiltration i centrala nervsystemet (CNS) under både fysiologiska och patologiska förhållanden. Ny forskning har visat att reglering av ChP-aktivitet kan ge skydd mot CNS-störningar. Att studera ChP:s biologiska funktion utan att påverka andra hjärnregioner är dock utmanande på grund av dess känsliga struktur. Denna studie presenterar en ny metod för genknockdown i ChP-vävnad med hjälp av adenoassocierade virus (AAV) eller cykliseringsrekombinationsenzym (Cre) rekombinasprotein bestående av TAT-sekvens (CRE-TAT). Resultaten visar att efter injektion av AAV eller CRE-TAT i den laterala ventrikeln var fluorescensen uteslutande koncentrerad i CHP. Med hjälp av detta tillvägagångssätt slog studien framgångsrikt ner adenosin A2A-receptorn (A2AR) i ChP med hjälp av RNA-interferens (RNAi) eller Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) system, och visade att denna knockdown kunde lindra patologin för experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE). Denna teknik kan få viktiga implikationer för framtida forskning om CHP:s roll vid CNS-sjukdomar.
Introduction
Plexus choroidus (ChP) ansågs ofta hjälpa till att upprätthålla hjärnans funktionella homeostas genom att utsöndra cerebrospinalvätska (CSF) och hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF)1,2. Ökad forskning under de senaste tre decennierna har visat att ChP representerar en distinkt väg för immuncellsinfiltration i det centrala nervsystemet (CNS).
De täta korsningarna (TJ) i ChP, som består av ett monolager ChP-epitel, upprätthåller immunologisk homeostas genom att förhindra makromolekyler och immunceller från att komma in i hjärnan3. Under vissa patologiska tillstånd detekterar och reagerar ChP-vävnaden dock på faroassocierade molekylära mönster (DAMP) i cerebrospinalvätskan och blodet, vilket leder till onormal immuninfiltration och hjärndysfunktion 4,5. Trots sin avgörande roll gör CHP:s ringa storlek och unika placering i hjärnan det svårt att studera dess funktion utan att påverka andra hjärnregioner. Att manipulera genuttryck specifikt i ChP är därför ett idealiskt tillvägagångssätt för att förstå dess funktion.
Till en början användes transgena linjer med cykliseringsrekombinationsenzym (Cre), som uttrycker Cre under kontroll av promotorer som är specifika för gener som uttrycks i CHP, för att ta bort målgener genom att avla med floxade kandidatgener 6,7,8. Till exempel uttrycks transkriptionsfaktorn Forkhead box J1 (FoxJ1) uteslutande i ChP-epitelet i den prenatala mushjärnan7. Således användes FoxJ1-Cre-linjen ofta för att ta bort gener som finns i ChP 6,9. Framgången för denna strategi beror dock i hög grad på promotorns specificitet. Det upptäcktes gradvis att FoxJ1-uttrycksmönstret inte var tillräckligt utmärkande, eftersom FoxJ1 också fanns i cilierade epitelceller i andra delar av hjärnan och det periferasystemet. För att övervinna denna begränsning utfördes intracerebroventrikulär (ICV) injektion av Cre-rekombinas för att leverera rekombinas in i kamrarna i floxade transgena linjer. Denna strategi uppvisade hög specificitet, vilket framgår av närvaron av tdTomatfluorescens enbart i ChP-vävnaden10,11. Denna metod är dock fortfarande begränsad av tillgången på floxade transgena muslinjer. För att ta itu med detta problem har forskare använt ICV-injektion av adenoassocierat virus (AAV) för att uppnå ChP-specifik knockdown eller överuttryck av målgener12,13. En omfattande utvärdering av olika AAV-serotyper för ChP-infektion visade att AAV2/5 och AAV2/8 uppvisar starka infektionsförmågor i CHP, samtidigt som de inte infekterar andra hjärnregioner. AAV2/8 visade sig dock infektera ependymet som omger ventriklarna, medan AAV2/5-gruppen inte visade någon infektion14. Fördelen med denna metod är att den övervinner begränsningarna med att skaffa floxade transgena djur.
Denna artikel beskriver ett steg-för-steg-protokoll för genknockdown i ChP med hjälp av två metoder: ICV av AAV2/5 som bär shRNA från adenosin A2A-receptorn (A 2A R) och Cre-rekombinasprotein bestående av TAT-sekvens (CRE-TAT) rekombinas för att uppnå ChP-specifik knockdown av A2A R. Studiens resultat tyder på att man genom att slå ner A2AR i CHP kan lindra experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE). Detta detaljerade protokoll ger användbar vägledning för ChP-funktionsstudier och den specifika knockdownen av gener i CHP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer som beskrivs i denna studie utfördes i enlighet med de riktlinjer som beskrivs i NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur och godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Wenzhou Medical University.
1. Djur
- Köp hanmöss av C57BL/6 ålder 8-12 veckor och väger 20-22 g.
- Skaffa den transgena muslinjen Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) och hanmöss av typen A2A Rflox/flox.
- Tilldela slumpmässigt mössen till två grupper och håll dem i burar, med högst fem möss per bur, under en standardcykel på 12 timmar ljus/12 timmar mörker i 1 vecka.
- Ge mössen tillräckligt med mat och vatten och håll dem vid en konstant temperatur vid 25 °C.
2. ChP-specifik knockdown av A 2ARs med AAV2/5-shRNA
- Väg varje mus och skriv ner värdena.
- Bedöva mössen intraperitonealt med 1 % pentobarbitalnatrium i en dos på 6-8 ml/kg motsvarande 60-80 mg/kg pentobarbital, och placera musen på en värmedyna för att hålla den varm.
OBS: Det är viktigt att administrera rätt dos av pentobarbitalnatrium i enlighet med musens vikt för att säkerställa en lyckad operation. Bedövningen bör inte vara för djup, eftersom den kan leda till dödlighet, men bör inte vara för ytlig, eftersom musen kan vakna under ingreppet, vilket kan påverka virusinjektionens effektivitet. Kontrollera om det finns rätt anestesidos genom att nypa ihop tårna och se till att mössen inte svarar. - Använd en specialiserad musrakapparat för att trimma det övre håret på de sövda mössen.
- Applicera ögonsalva på båda ögonen för att förhindra att de torkar ut, och fäst mössen på en stereotaktisk apparat för att immobilisera hjärnan. Täck djuret med ett sterilt draperi.
- Sterilisera huden på mössens huvud och hals noggrant med tre omgångar jodofordesinfektionsmedel och 75 % alkohol för att minska postoperativ infektion. Applicera sedan 1 % lidokain lokalt på mössens hårbotten och gör ett litet snitt för att helt exponera skallen under ett mikroskop.
OBS: Använd sterila instrument under hela proceduren. - Bered två 10 μL-sprutor: en med köpt AAV2/5-A2AR-shRNA (titer: 6,27 × 10 9 vg/μL) och den andra med köpt AAV2/5-Scramble (titer: 6,21 × 109 vg/μL).
OBS: När du använder sprutan måste den främre änden anslutas till en glaskapillär, och ett intervall på 10 μL kan erhållas genom att kontrollera längden på glaskapillären. - Använd mikroskopet för att lokalisera bregma och lambda och ställ in koordinatpunkten (AP: -0.58; ML: ±1,10; DL: -2,20) på 10 μL-sprutan (figur 1). Koordinatpunkten är baserad på mushjärnans stereotaktiska atlas15.
- Borra ett litet hål i skallen vid den justerade koordinatpunkten.
OBS: Under mikroskopet utförs borrning med en steril mikroborr mot skallens yta. Efter borrning, genom att ta bort hjärnhinnorna som täcker hjärnan och exponera det underliggande hjärnparenkymet, förhindras skador på blodkärlen. Detta steg förhindrar att spetsen på glaskapillären bryts av av hjärnhinnorna. Diametern på det borrade hålet ska vara tillräcklig för att nålspetsen ska kunna komma in i hjärnvävnaden. - Administrera 2 μL AAV2/5-A2AR-shRNA-virus i hjärnkammaren via lateral injektion med en jämn hastighet av 100 nL/min. Håll nålen på plats i 10 minuter innan du drar ut den. Observera att viruset administrerades med en ensidig injektion.
- Försegla den skadade huden med medicinskt biofibrinlim omedelbart för att förhindra virusförlust, som kan sköljas ur med cerebrospinalvätska efter att nålen tagits bort om limmet inte appliceras snabbt. Använd inte heller bomullspinnar för att torka av CSF, eftersom det också kan orsaka virusförlust.
- För att underlätta återhämtningen, placera musen på en värmedyna för att hålla kroppstemperaturen på 37,0 ± 0,5 °C och applicera 1 % lidokain lokalt på musens hårbotten. Låt mössen återhämta sig i 2 veckor innan EAE-modellen induceras, eftersom denna period är nödvändig för AAV2/5-A 2A R-shRNA-virusuttryck och efterföljandeA 2AR-knockdown.
3. ChP-specifik knockdown av A2AR med ett Cre/locus av X-overP1 (Cre/LoxP) system
OBS: Följande procedurer kan uppnås med den metod som beskrivits tidigare. Se steg 2.1-2.11 för detaljerade injektionsmetoder.
- Injicera 2 μl CRE-TAT-rekombinas i varje lateral ventrikel på en Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-mus som experimentgrupp och 2 μl steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som kontrollgrupp. Använd samma protokoll som ovan (avsnitt 2) och injicera 2 μl CRE-TAT-rekombinas i var och en av de laterala ventriklarna hos A2A Rflox/flox-möss tillsammans med 2 μl steril PBS som kontrollgrupp.
- Förbered frysta vävnadssnitt och utför nukleär färgning 2 veckor efter CRE-TAT-rekombinasinjektionen. Se steg 4.1-4.3 för mer information.
4. Transkardiell perfusion hos möss
- Administrera 60-80 mg/kg pentobarbitalnatrium för att djupt bedöva mössen. Bekräfta anestesiplanet med en tånyp och utför transkardiell perfusion med 40 ml steril PBS-lösning följt av 20 ml 4 % paraformaldehyd (PFA).
OBS: Framgångsrik perfusion indikeras av en vit färg i levern, medan närvaron av förstorade lungor eller PBS-utflöde från munnen under perfusion tyder på ett misslyckande av proceduren. - Extrahera snabbt mushjärnan, vilket säkerställer minimal proteinnedbrytning.
- Sänk ner mushjärnan i 4 % PFA/PBS över natten för efterfixering, följt av ersättning med 30 % sackaros PB-lösning i 72 timmar.
OBS: Det är viktigt att undvika överdriven uttorkning av hjärnvävnaden, så hjärnan bör inte lämnas i sackaros PB-lösningen för länge.
5. Sektionering och färgning av fryst vävnad
- Bädda in den tidigare uttorkade mushjärnan i lim för optimal skärtemperatur (OCT), frys den inbäddade hjärnan och använd en glidande mikrotom för att skära koronasektioner med en tjocklek på 20 μm.
- Placera hjärnsektionerna på glasskivan. När hjärnsektionerna är torra, förvara dem i ett kylskåp på -20 °C för efterföljande experiment.
- Placera varje glasglas i ett ramfodral och sänk ner ramen i en behållare fylld med PBS för att skölja glaset noggrant. Skölj försiktigt hjärnglasen med PBS-lösning tre gånger, i 10 minuter varje gång.
OBS: Försiktighet bör iakttas för att förhindra att hjärnsektionerna faller av glasskivan. - Färga hjärnglasen med 4′,6-diamidino-2-fenylindollösning (DAPI) i 10 minuter.
- Skölj hjärnglasen med PBS-lösning i 5 min.
- Applicera en droppe antifade mounting medium på hjärnsektionerna.
- Placera ett täckglas på hjärnsektionerna, försegla täckglaset med nagellack och analysera snitten med ett konventionellt fluorescensmikroskop.
6. EAE-induktion
OBS: Utför EAE-induktion efter 2 veckor efter shRNA- eller CRE-TAT-rekombinasinjektionen11.
- Skapa en vattenlösning genom att blanda 2,5 mg myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) med 2 ml PBS. Bered en komplett Freunds adjuvant (CFA) oljelösning genom att blanda M. tuberculosis (H37Ra) med ofullständig Freunds adjuvans (IFA).
- Blanda vatten- och oljelösningarna i förhållandet 1:1. Använd ett tee-rör för att vispa blandningen till olja-i-vatten-tillstånd.
OBS: T-pipan kallas också för ett trevägsrör. Det är ett plaströr som kan styra riktningen på den flytande lösningen för att helt blanda MOG35-55 och CFA. - Använd en höghastighetshomogenisator för att göra MOG-antigenemulsionen för EAE-modellen under isbadsförhållanden.
- Bedöva mössen intraperitonealt med 1 % pentobarbitalnatrium i en dos på 6-8 ml/kg motsvarande 60-80 mg/kg pentobarbital.
- Injicera MOG-antigenemulsionen subkutant i fyra olika punkter (nacke, rygg, vänster och höger höft) med en volym av 10 ml/kg för totalt fyra injektioner vardera.
Det är viktigt att noggrant välja injektionsställe, eftersom olika injektionsställen kan ha olika effekter på morbiditet och mortalitet hos möss. Dessutom kan upprepade MOG-injektioner leda till immuntolerans, så forskargruppen valde en enda injektionsmetod för att förhindra detta potentiella problem. - Injicera omedelbart 500 ng/ml kikhostetoxin (PT) intraperitonealt i en dos av 5 mg/kg efter MOG-injektion.
OBS: PT ökar permeabiliteten i blod-hjärnbarriären (BBB) och underlättar infiltrationen av T-celler i hjärnan. - Efter 48 timmar injiceras PT-lösningen intraperitonealt med samma volym.
7. Poäng för neurologiskt underskott
- Utvärdera och gradera mössen dagligen med hjälp av en betygsskala 16 som sträcker sig från 0 till15 för att bedöma förekomsten och svårighetsgraden av EAE enligt följande neurologiska brister:
Svans: 0 indikerar inga tecken, 1 representerar en halvförlamad svans och 2 indikerar en helt förlamad svans.
Extremiteter: 0 indikerar inga tecken, 1 representerar en svag eller förändrad gång, 2 indikerar pares och 3 representerar en helt förlamad lem. - Tilldela ett tetraplegikerdjur som har fullständig förlamning en poäng på 12 och tilldela dödlighet en poäng på 15.
8. Färgning av hematoxylin-eosin (H&E)
- Ta den uttorkade mushjärnan och bädda in den i smält paraffin. Låt paraffinblocket svalna och stelna för senare användning.
OBS: Paraffinblocket ska vara helt torrt och svalt för att undvika vävnadsskador. - Skär mushjärnans paraffinblock i 5 μm tjocka objektglas. Lägg paraffinmusens hjärnsektion på en glasskiva och torka den i en 60 °C ugn i 3 timmar.
- Sänk ner objektglasen sekventiellt i xylenlösning I i 10 min, xylenlösning II i 10 min, 100 % alkohol I i 3 min, 100 % alkohol II i 3 min, 95 % alkohol i 3 min, 90 % alkohol i 3 min, 80 % alkohol i 3 min, 70 % alkohol i 3 min och destillerat vatten i 1 min.
9. Kvantitativ analys av polymeraskedjereaktion (qPCR)
- Efter att ha perfunderat mössen med PBS, ta bort ChP från kamrarna och extrahera RNA med Trizol. Syntetisera cDNA med hjälp av det första Strand cDNA Synthesis Kit.
- Utför qPCR-analys med hjälp av Ex Taq SYBR-green premix och ett realtids-PCR-system. Använd följande A2A R-primers: framåt - GCCATCCCATTCGCCATCA; omvänd - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ChP-specifik A2A R-knockdowngenom ICV-injektion av AAV2/5-shRNA eller CRE-TAT
Rollen för A2AR i ChP som en kraftfull regulator av neural information i EAE-patogenes är fortfarande oklar. Att slå ner ChP-specifikt A 2AR-uttryckskulle kunna kasta ljus över de A2AR-reglerande effekterna på det centrala immunsystemet vid EAE och andra inflammationer i nervsystemet. Denna studie använde ICV-injektion av CRE-TAT för att minska A 2AR-uttrycketi ChP hos A2A Rflox/flox-möss . För att säkerställa ChP-specificitet injicerade vi först CRE-TAT i de laterala ventriklarna hos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9)-möss. Bilderna indikerar att den spontana tdTomatfluorescensen var begränsad till ChP-vävnaden (Figur 2). På samma sätt administrerade studien AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) i C57BL/6-möss och fann att EGFP-fluorescensen var begränsad till epitelcelskiktet i ChP och inte infekterade de omgivande parenkymala cellerna nära de laterala ventriklarna (Figur 3).
EAE-induktion med MOG35-55
För att inducera stabil EAE injicerades möss subkutant med en emulsion bestående av MOG35-55 och CFA, följt av intraperitoneal injektion av PT dag 0 och 2 efter immunisering (Figur 4). Den kliniska symtomskalan användes för att utvärdera EAE-poäng dagligen, baserat på svansens och extremiteternas tillstånd. Debuten av EAE definierades som den första dagen med en EAE-poäng ≥1, medan varaktigheten mellan debut och topp EAE-poäng kallades det progressiva stadiet.
ChP-specifik A2A R-knockdownlindrar EAE-patologi
För att undersöka inblandningen av A 2A R-signalen i EAE-patologi använde studien en ChP-specifikA 2A R-knockdown. Studien slog specifikt ner A2AR i ChP med hjälp av ICV-injektion av CRE-TAT eller AAV2/5-A2AR-shRNA. 2 veckor efter knockdown inducerades EAE av MOG35-55-immunisering. Resultaten visade att möss med A2A R-knockdownutvecklade mildare EAE-patologi jämfört med kontrollgruppen, vilket framgår av lägre poäng och en minskad infiltration av immunceller i ryggmärgen (Figur 5A,B,E,F). Dessutom valdes fem EAE-inducerade möss från varje grupp vid dag 20 efter MOG35-55-immunisering slumpmässigt. Efter perfusion med PBS isolerades CHP:erna för RNA-extraktion och qPCR. qPCR-analysen visade att mRNA-nivåerna av A 2A R var tydligt minskade i AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) och CRE-TAT-grupperna, jämfört med varje kontroll (Figur 5C,D).
Figur 1: Anatomisk lokalisering av injektionsstället för den laterala ventrikeln. (A) Ett schematiskt diagram som visar platsen för virusinjektionen. (B) Injektionsstället i den laterala ventrikeln är beläget 0,58 mm under bregma och 1,1 mm lateralt om sagittalsuturen, vilket indikeras av den röda pricken. (C) En bild som visar platsen för virusinjektion på en mus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Lokalisering av tdTomatfluorescens i ChP . (A,B) Representativ bild av Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomatmöss behandlade med ICV-injektion av CRETAT. Vid 2 veckor senare var tdTomato-autofluorescensen specifikt lokaliserad till ChP-vävnaden (n = 3/grupp). (C,D) De sammanslagna bilderna av tdTomatautofluorescens och DAPI. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av C57BL/6-möss tagna 2 veckor efter ICV-injektion av AAV2/5-scramble-EGFP eller AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) Representativa bilder av möss som injicerats med AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/grupp). (C,D) Representativa bilder av möss injicerade med AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/grupp). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Induktion av EAE-modellen. (A) För det första injiceras MOL-antigenemulsionen subkutant på fyra olika ställen (nacke, rygg, vänster och höger höft), vilka betecknas med röda prickar. (B) PT injiceras intraperitonealt vid tidpunkten för immunisering och upprepas 2 dagar senare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: ChP-specifik knockdown av A 2A R lindrade EAE-patologin. (A) ChP-specifik knockdown av A 2A R i A2A R flox/flox-möss, uppnådd genom ICV-injektion av CRE-TAT, ledde till minskade EAE-kliniska poäng (n = 6-7/grupp). Statistisk analys utfördes med hjälp av tvåvägs RM ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelsetest. (B) ChP-specifik knockdown av A2AR i vildtypsmöss (WT), uppnådd med ICV-injektion av AAV2/5-shRNA, minskade EAE kliniska poäng (n = 7-8/grupp). Statistisk analys utfördes med hjälp av tvåvägs RM ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelsetest. (C,D) Resultat av qPCR-analysen av A2A RmRNA-nivåer i ChP-vävnad (n = 5/grupp). Statistisk analys utfördes med hjälp av ett oparat t-test. (E,F) H&E färgning. ChP-specifik A2A R-knockdowndämpade immuncellernas infiltration i ryggmärgen. Statistisk signifikans representeras som ###p < 0,001, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskningen presenterade två distinkta tillvägagångssätt för riktad knockdown av ChP-gener. Det första tillvägagångssättet innebar ICV-injektion av CRE-TAT, som innehåller Cre-rekombinas, i A2A Rflox/flox-möss. Den andra metoden innebar ICV-injektion av AAV2/5 som bär shRNA av A2A R. Genom att använda dessa två strategier uppnådde arbetet den selektiva knockdownen av A 2A R inom ChP och kunde visa de skyddande effekterna av att hämma A2AR-signaleringi ChP på EAE-patologi. Observera att detta protokoll innehåller två viktiga steg. För det första är den stereotaktiska lokaliseringsåtgärden viktig, och betydande avvikelser från de föreslagna koordinaterna kan resultera i slumpmässiga fel. För det andra är volymen av det injicerade viruset kritisk, eftersom det har visat sig att injektion av mindre än 1 μL virus (~6 x 1012) också har en viss risk att misslyckas. Detta beror möjligen på att det behövs en tillräcklig mängd viruspartiklar för tillräcklig infektion.
Användning av Cre/LoxP-systemet gjorde det inte möjligt att observera den exakta fördelningen av CRE-TAT-rekombinas i hjärnan efter ICV-injektion. Som ett resultat av detta använde studien Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-möss för att spåra distributionen av CRE-TAT med hjälp av autofluorescensen av tdTomato-proteinet. Fluorescensen i tdTomato var uteslutande lokaliserad i ChP-vävnader 2 veckor efter injektion av CRE-TAT intracerebroventrikelmässigt, vilket tyder på att rekombinasen främst absorberades av CHP. Därefter administrerades CRE-TAT till A 2A Rflox/flox möss, och en minskning av A2A RmRNA-nivåernaobserverades i ChP-vävnaden. Denna riktade knockdown-strategi användes för att undersöka vilken roll kortikosteroidsignalering i ChP spelar för att mediera psykologisk stress17. Alternativt använde forskningen AAV2/5 för att leverera shRNA som är utformade för att rikta in sig på ChP-gener. Tidigare studier har utvärderat infektionsförmågan hos olika serotyper av AAVs och lentivirus i ChP-vävnad och funnit att AAV2/5 och AAV2/8 var de mest effektiva14. Studien visade att AAV2/5 kunde infektera ChP specifikt utan att orsaka uppenbara infektioner i andra hjärnregioner. Dessa två metoder är mindre mödosamma än klassiska knockout-strategier som kräver två transgena linjer (Cre- och Flox-linjer)6,18. En begränsning med denna studie är frånvaron av ett gain-of-function-experiment med överuttryck av gener. Ett möjligt tillvägagångssätt för att uppnå detta skulle dock vara att klona hela cDNA och paketera det i AAV2/5-viruset, som skulle administreras via ICV-infektion. I en tidigare studie visade sig överuttryck av NKCC1 i CHP med AAV2/5 främja clearance av cerebrospinalvätska och minska ventrikulomegali in vivo9. Det är viktigt att notera att antingen AAV2/5- eller Cre/LoxP-strategin har sin egen fördel. ICV-injektionen av CRE-TAT i transgena möss säkerställer hög knockdown-effektivitet, eftersom målgenen raderas direkt från cellernas DNA. Denna metod är dock beroende av produktion och avel av floxade möss. Å andra sidan undviker ICV-injektionen av AAV2/5 den tidskrävande processen att föda upp transgena möss. Knockdown-effektiviteten för denna metod beror dock till stor del på prestandan hos det designade shRNA:t. Därför kan forskare välja en lämplig metod baserat på deras experimentella förhållanden.
Multipel skleros (MS) är en autoimmun sjukdom som orsakar inflammation och demyelinisering av vit substans i CNS19. För att studera de patologiska mekanismerna vid MS har forskare använt en EAE-modell som simulerar sjukdomens symtom, såsom demyelinisering och immuninfiltration. Denna modell anses vara idealisk för att förstå MS. År 2009 upptäcktes det att immunceller infiltrerar CNS genom CHP, vilket är en nyckelväg för immuncellers inträde i MS-patologi. Den "första vågen" av immunceller kommer in i cerebrospinalvätskan genom CHP, följt av den "andra vågen", som går in i hjärnans parenkym genom BBB20. Den "första vågen" av immunceller främjar inflammation och påskyndar BBB-läckage, så att hämma immuninfiltration vid ChP kan vara användbart för tidig intervention vid MS. Kemokiner och adhesionsmolekyler reglerar ChP:s regleringsaktivitet och kontrollerar lymfocyternas förmåga att infiltrera över den21,22,23.
Tidigare studier använde helkroppsknockout eller farmakologisk teknik (såsom neutraliserande antikroppar) för att undersöka signalmolekyler i CHP, men dessa metoder definierade inte exakt deras biologiska funktion i MS-patologiska processen. I en nyligen genomförd studie slog forskare ner A 2AR, som ligger i ChP hos A2A Rflox/flox-möss , och fann att EAE-poäng och immuninfiltration minskade signifikant11. Denna studie bekräftar rollen av A2AR-signalering i ChP under EAE-patologi och visar att ChP-specifika knockdown-metoder är användbara verktyg för att studera ChP-funktion i CNS-patologier.
Sammanfattningsvis är det ChP-specifika manipulationsprotokollet ett idealiskt verktyg för att utforska den biologiska funktionen hos ChP som är involverad i degenerativa sjukdomar i CNS, såsom Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, MS och så vidare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna uppger att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen eller andra upplysningar att deklarera.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för stödet från National Natural Science Foundation of China (anslag nr 31800903, tilldelat W. Zheng) och Wenzhou Science and Technology Project (nr Y2020426, tilldelat Y. Y. Weng) för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P.
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
