Summary
Her beskriver vi en metode til selektivt at ændre genekspressioner i choroid plexus og samtidig undgå enhver påvirkning i andre hjerneområder.
Abstract
Choroid plexus (ChP) tjener som en kritisk gateway for immuncelleinfiltration i centralnervesystemet (CNS) under både fysiologiske og patologiske tilstande. Nyere forskning har vist, at regulering af ChP-aktivitet kan tilbyde beskyttelse mod CNS-lidelser. Imidlertid er det udfordrende at studere den biologiske funktion af ChP uden at påvirke andre hjerneområder på grund af dens sarte struktur. Denne undersøgelse præsenterer en ny metode til genknockdown i ChP-væv ved hjælp af adeno-associerede vira (AAV'er) eller cykliseringsrekombinationsenzym (Cre) rekombinaseprotein bestående af TAT-sekvens (CRE-TAT). Resultaterne viser, at fluorescensen efter injektion af AAV eller CRE-TAT i den laterale ventrikel udelukkende var koncentreret i ChP. Ved hjælp af denne tilgang slog undersøgelsen med succes adenosin A 2A-receptoren (A2A R) ned i ChP ved hjælp af RNA-interferens (RNAi) eller Cre / locus af X-overP1 (Cre / LoxP) systemer og viste, at denne knockdown kunne lindre patologien for eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE). Denne teknik kan have vigtige konsekvenser for fremtidig forskning i ChP's rolle i CNS-lidelser.
Introduction
Choroid plexus (ChP) blev ofte anset for at hjælpe med at opretholde hjernens funktionelle homeostase ved at udskille cerebrospinalvæske (CSF) og hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF)1,2. Stigende forskning i løbet af de sidste tre årtier har afsløret, at ChP repræsenterer en særskilt vej til immuncelleinfiltration i centralnervesystemet (CNS).
De tætte kryds (TJ'er) af ChP, der består af et monolags ChP-epitel, opretholder immunologisk homeostase ved at forhindre makromolekyler og immunceller i at komme ind i hjernen3. Under visse patologiske tilstande registrerer og reagerer ChP-vævet imidlertid på fareassocierede molekylære mønstre (DAMP'er) i CSF og blod, hvilket fører til unormal immuninfiltration og hjernedysfunktion 4,5. På trods af sin kritiske rolle gør ChP's lille størrelse og unikke placering i hjernen det vanskeligt at studere dens funktion uden at påvirke andre hjerneområder. Derfor er manipulation af genekspression specifikt i ChP en ideel tilgang til at forstå dens funktion.
Indledningsvis blev cykliseringsrekombinationsenzym (Cre) transgene linjer, som udtrykker Cre under kontrol af promotorer, der er specifikke for gener udtrykt i ChP, almindeligt anvendt til at slette målgener ved avl med floxede kandidatgener 6,7,8. For eksempel udtrykkes transkriptionsfaktoren Gaffelhovedboks J1 (FoxJ1) udelukkende i ChP-epitelet i den prænatale musehjerne7. Således blev FoxJ1-Cre-linjen ofte brugt til at slette gener placeret i ChP 6,9. Denne strategis succes afhænger imidlertid i høj grad af initiativtagerens specificitet. Det blev gradvist opdaget, at FoxJ1-ekspressionsmønsteret ikke var karakteristisk nok, da FoxJ1 også var til stede i cilierede epitelceller i andre dele af hjernen og det perifere system7. For at overvinde denne begrænsning blev intracerebroventrikulær (ICV) injektion af Cre rekombinase udført for at levere rekombinase i ventriklerne i floxede transgene linjer. Denne strategi viste høj specificitet, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af tdTomatfluorescens udelukkende i ChP-vævet10,11. Denne metode er dog stadig begrænset af tilgængeligheden af floxed transgene muselinjer. For at løse dette problem har forskere anvendt ICV-injektion af adeno-associeret virus (AAV) for at opnå ChP-specifik knockdown eller overekspression af målgener12,13. En omfattende evaluering af forskellige AAV-serotyper for ChP-infektion afslørede, at AAV2/5 og AAV2/8 udviser stærke infektionsevner i ChP, mens de ikke inficerer andre hjerneområder. AAV2/8 viste sig imidlertid at inficere ependyma omkring ventrikler, mens AAV2/5-gruppen ikke viste nogen infektion14. Denne metode har den fordel, at den overvinder begrænsningerne ved at erhverve floxed transgene dyr.
Denne artikel beskriver en trin-for-trin protokol for gen-knockdown i ChP ved hjælp af to metoder: ICV af AAV2/5, der bærer shRNA af adenosin A 2A-receptoren (A 2A R) og Cre-rekombinaseprotein bestående af TAT-sekvens (CRE-TAT) rekombinase for at opnå ChP-specifik knockdown af A2A R. Undersøgelsesresultaterne tyder på, at knocking ned A2AR i ChP kan lindre eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE). Denne detaljerede protokol giver nyttig vejledning til ChP-funktionsundersøgelser og den specifikke knockdown af gener i ChP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Wenzhou Medical University.
1. Dyr
- Køb C57BL/6-hanmus i alderen 8-12 uger og med en vægt på 20-22 g.
- Få den transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) muselinje og han A2ARfloks / flox mus.
- Tildel musene tilfældigt til to grupper og hus i bure med maksimalt fem mus pr. bur under en standard 12 timers lys / 12 timers mørk cyklus i 1 uge.
- Giv musene tilstrækkeligt foder og vand, og hold dem ved en konstant temperatur på 25 °C.
2. ChP-specifik knockdown af A2ARs med AAV2/5-shRNA
- Vej hver mus og skriv værdierne ned.
- Bedøv musene intraperitonealt med 1% pentobarbitalnatrium i en dosis på 6-8 ml / kg svarende til 60-80 mg / kg pentobarbital, og læg musen på en varmepude for at holde den varm.
BEMÆRK: Det er afgørende at administrere den korrekte dosis af pentobarbitalnatrium i henhold til musens vægt for at sikre en vellykket operation. Anæstesien bør ikke være for dyb, da det kan resultere i dødelighed, men bør ikke være for lavt, da musen kan vågne op under proceduren, hvilket potentielt påvirker effektiviteten af virusinjektionen. Kontroller for den korrekte anæstesidosis ved tåspids og sørg for, at mus ikke reagerer. - Brug en specialiseret musebarbermaskine til at trimme det øverste hår på de bedøvede mus.
- Påfør øjensalve på begge øjne for at forhindre tørring, og fastgør musene på et stereotaksisk apparat for at immobilisere hjernen. Dæk dyret med en steril drapering.
- Steriliser grundigt huden på musens hoved og hals med tre runder iodophor desinfektionsmiddel og 75% alkohol for at reducere postoperativ infektion. Påfør derefter 1% lidokain topisk på musens hovedbund og lav et lille snit for fuldt ud at udsætte kraniet under et mikroskop.
BEMÆRK: Brug sterile instrumenter under hele proceduren. - Klargør to 10 μL sprøjter: en med købt AAV2/5-A 2A R-shRNA (titer: 6,27 × 109 vg/μL) og den anden med købt AAV2/5-Scramble (titer:6,21× 109 vg/μL).
BEMÆRK: Når sprøjten bruges, skal forenden tilsluttes en glaskapillær, og der kan opnås en rækkevidde på 10 μL ved at kontrollere længden af glaskapillærrøret. - Brug mikroskopet til at lokalisere bregma og lambda og indstil koordinatpunktet (AP: -0,58; ML: ±1.10; DL: -2,20) på 10 μL sprøjten (figur 1). Koordinatpunktet er baseret på musens stereotaksiske atlas15.
- Bor et lille hul i kraniet ved det justerede koordinatpunkt.
BEMÆRK: Under mikroskopet udføres boringen ved hjælp af en steril mikrobor mod kraniets overflade. Efter boring, ved at fjerne meninges, der dækker hjernen og udsætte den underliggende hjerneparenchyma, forhindres skade på blodkarrene. Dette trin forhindrer spidsen af glaskapillæret i at blive brudt af meninges. Diameteren af det borede hul skal være tilstrækkelig til, at nålespidsen kan komme ind i hjernevævet. - Administrer 2 μL AAV2/5-A2AR-shRNA-virus i hjernens ventrikel via lateral injektion med en stabil hastighed på 100 nL/min. Hold nålen på plads i 10 minutter, før du trækker den ud. Bemærk, at virussen blev administreret med ensidig injektion.
- Forsegl den skadede hud ved hjælp af medicinsk biofibrinlim straks for at forhindre virustab, som kan skylles ud med CSF efter fjernelse af nålen, hvis limen ikke påføres hurtigt. Brug heller ikke bomuldsknopper til at tørre CSF, da det også kan forårsage virustab.
- For at lette restitutionen skal du placere musen på en varmepude for at holde kropstemperaturen på 37,0 ± 0,5 °C og påføre 1% lidokain topisk på musens hovedbund. Lad musene komme sig i 2 uger, før EAE-modellen induceres, da denne periode er nødvendig for AAV2/5-A 2A R-shRNA-virusekspression og efterfølgende A2AR-knockdown.
3. ChP-specifik knockdown af A2AR med et Cre/locus af X-overP1 (Cre/LoxP) system
BEMÆRK: Følgende procedurer kan opnås ved hjælp af den tidligere beskrevne metode. Se trin 2.1-2.11 for detaljerede injektionsmetoder.
- Der injiceres 2 μL CRE-TAT rekombinas i hver lateral ventrikel i en Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomat mus som forsøgsgruppe og 2 μL sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) som kontrolgruppe. Brug samme protokol som ovenfor (punkt 2) til at injicere 2 μL CRE-TAT rekombinase i hver af de laterale ventrikler hos A2ARfloks/flox-mus sammen med 2 μL steril PBS som kontrolgruppe.
- Forbered frosne vævssektioner og udfør nuklear farvning 2 uger efter CRE-TAT rekombinaseinjektionen. Se trin 4.1-4.3 for at få flere oplysninger.
4. Transkardial perfusion hos mus
- Administrer 60-80 mg / kg pentobarbitalnatrium for at bedøve musene dybt. Bekræft anæstesiplanet med en tåklemme og udfør transkardieperfusion ved hjælp af 40 ml steril PBS-opløsning efterfulgt af 20 ml 4% paraformaldehyd (PFA).
BEMÆRK: Vellykket perfusion er indikeret med en hvid farve i leveren, mens tilstedeværelsen af forstørrede lunger eller PBS-udstrømning fra munden under perfusion tyder på en fejl i proceduren. - Udtræk hurtigt musehjernen, hvilket sikrer minimal proteinnedbrydning.
- Nedsænk musehjernen i 4% PFA/PBS natten over til postfiksering, efterfulgt af udskiftning med 30% saccharose PB-opløsning i 72 timer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå overdreven dehydrering af hjernevævet, så hjernen bør ikke efterlades i saccharose PB-opløsningen for længe.
5. Sektionering og farvning af frosset væv
- Integrer den tidligere dehydrerede musehjerne i optimal skæretemperatur (OCT) lim, frys den indlejrede hjerne, og brug et glidende mikrotomt til at skære koronale sektioner med en tykkelse på 20 μm.
- Placer hjernesektionerne på glasrutschebanen. Når hjernesektionerne er tørre, opbevares de i et køleskab på -20 °C til efterfølgende forsøg.
- Placer hvert glasglas i en rammekasse og nedsænk rammen i en beholder fyldt med PBS for at skylle objektglasset grundigt. Skyl forsigtigt hjernerutsjebanerne med PBS-opløsning tre gange i 10 minutter hver gang.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at forhindre, at hjernesektionerne falder af glasglasset. - Plet hjernen glider med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) opløsning i 10 min.
- Skyl hjernerutsjebanerne med PBS-opløsning i 5 min.
- Påfør en dråbe antifade monteringsmedium til hjernesektionerne.
- Placer en coverslip på hjernesektionerne, forsegl dæksedlen med neglelak, og analyser sektionerne ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop.
6. EAE-induktion
BEMÆRK: Udfør EAE-induktion efter 2 uger efter shRNA- eller CRE-TAT-rekombinaseinjektion11.
- Der skabes en vandig opløsning ved at blande 2,5 mg myelinoligodendrocytglycoprotein (MOG35-55) med 2 ml PBS. Forbered en komplet Freunds adjuvans (CFA) olieopløsning ved at blande M. tuberculosis (H37Ra) med ufuldstændig Freunds adjuvans (IFA).
- Bland de vandige opløsninger og olieopløsningerne i forholdet 1: 1. Brug et tee-rør til at piske blandingen i olie-i-vand-tilstand.
BEMÆRK: Tee-røret kaldes også et trevejsrør. Det er et plastrør, der kan styre retningen af flydende opløsning for fuldt ud at blande MOG35-55 og CFA. - Brug en højhastighedshomogenisator til at fremstille MOG-antigenemulsionen til EAE-modellen under isbadsforhold.
- Bedøv musene intraperitonealt med 1% pentobarbitalnatrium i en dosis på 6-8 ml / kg svarende til 60-80 mg / kg pentobarbital.
- Subkutant injiceres MOG-antigenemulsionen i fire forskellige punkter (nakke, ryg, venstre og højre hofter) med et volumen på 10 ml/kg til i alt fire injektioner hver.
BEMÆRK: Det er vigtigt omhyggeligt at vælge injektionssted, da forskellige steder kan have varierende indvirkning på musens sygelighed og dødelighed. Derudover kan gentagne MOG-injektioner føre til immuntolerance, så forskerholdet valgte en enkelt injektionsmetode for at forhindre dette potentielle problem. - Injicer straks 500 ng / ml kighostetoksin (PT) intraperitonealt i en dosis på 5 mg / kg efter MOG-injektion.
BEMÆRK: PT øger permeabiliteten af blod-hjerne-barrieren (BBB) og letter infiltrationen af T-celler i hjernen. - Efter 48 timer injiceres PT-opløsningen intraperitonealt med samme volumen.
7. Neurologisk underskud score
- Evaluer og bedøm musene dagligt ved hjælp af en vurderingsskala 16, der spænder fra 0 til15 for at vurdere forekomsten og sværhedsgraden af EAE i henhold til følgende neurologiske underskud:
Hale: 0 angiver ingen tegn, 1 repræsenterer en halvlammet hale, og 2 angiver en fuldt lammet hale.
Lemmer: 0 angiver ingen tegn, 1 repræsenterer en svag eller ændret gang, 2 angiver parese og 3 repræsenterer et fuldt lammet lem. - Tildel et quadriplegisk dyr med fuldstændig lammelse en score på 12, og tildel dødeligheden en score på 15.
8. Hæmatoxylin-eosin (H&E) farvning
- Tag den dehydrerede musehjerne og indlejr den i smeltet paraffin. Lad paraffinblokken afkøle og størkne til senere brug.
BEMÆRK: Paraffinblokken skal være helt tør og kølig for at undgå vævsskade. - Skær musehjerneparaffinblokken i 5 μm tykke dias. Paraffinmusens hjernesektion anbringes på et glasglas og tørres i en 60 °C ovn i 3 timer.
- Nedsænk diasene sekventielt i xylenopløsning I i 10 min, xylenopløsning II i 10 min, 100% alkohol I i 3 min, 100% alkohol II i 3 min, 95% alkohol i 3 min, 90% alkohol i 3 min, 80% alkohol i 3 min, 70% alkohol i 3 minutter og destilleret vand i 1 min.
9. Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) analyse
- Efter perfusering af musene med PBS fjernes ChP fra ventriklerne og ekstraheres RNA med Trizol. Syntetiser cDNA'et ved hjælp af det første Strand cDNA-syntesesæt.
- Udfør qPCR-analyse ved hjælp af Ex Taq SYBR-grøn premix og et PCR-system i realtid. Brug følgende A2AR-primere: fremad - GCCATCCCATTCGCCATCA; omvendt - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ChP-specifik A2AR-knockdown ved ICV-injektion af AAV2/5-shRNA eller CRE-TAT
A2AR's rolle i ChP som en stærk regulator af neurale oplysninger i EAE-patogenese forbliver uklar. Knocking ned ChP-specifik A 2A R-ekspression kunne kaste lys over A2AR-regulatoriske virkninger på det centrale immunsystem i EAE og andre nervesystembetændelser. Denne undersøgelse brugte ICV-injektion af CRE-TAT til at reducere A 2A R-ekspression i ChP hos A2AR flox/flox-mus. For at sikre ChP-specificitet injicerede vi først CRE-TAT i laterale ventrikler hos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) mus. Billederne indikerer, at den spontane tdTomat-fluorescens var begrænset til ChP-vævet (figur 2). Tilsvarende administrerede undersøgelsen AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) i C57BL/6-mus og fandt, at EGFP-fluorescensen var begrænset til epitelcellelaget i ChP og ikke inficerede de omgivende parenkymale celler nær de laterale ventrikler (figur 3).
EAE induktion med MOG35-55
For at inducere stabil EAE blev mus subkutant injiceret med en emulsion bestående af MOG35-55 og CFA, efterfulgt af intraperitoneal injektion af PT på dag 0 og 2 efter immunisering (figur 4). Den kliniske symptomskala blev brugt til at evaluere EAE-score dagligt baseret på hale- og lemmernes tilstand. Begyndelsen af EAE blev defineret som den første dag med en EAE-score ≥1, mens varigheden mellem debut og top EAE-score blev kaldt det progressive stadium.
ChP-specifik A2AR knockdown lindrer EAE-patologi
For at undersøge involveringen af A 2A R-signalet i EAE-patologi anvendte undersøgelsen en ChP-specifik A2AR-knockdown. Undersøgelsen slog specifikt A2AR ned i ChP ved hjælp af ICV-injektion af CRE-TAT eller AAV2/5-A2AR-shRNA. 2 uger efter knockdown blev EAE induceret af MOG35-55 immunisering. Resultaterne viste, at mus med A2AR-knockdown sammenlignet med kontrolgruppen udviklede mildere EAE-patologi, hvilket fremgår af lavere score og en reduceret infiltration af immunceller i rygmarven (figur 5A, B, E, F). Derudover blev fem EAE-inducerede mus fra hver gruppe på dag 20 efter MOG35-55 immunisering tilfældigt udvalgt. Efter perfusion med PBS blev ChP'erne isoleret til RNA-ekstraktion og qPCR. qPCR-analysen viste, at mRNA-niveauerne af A 2A R tydeligvis blev reduceret i AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) og CRE-TAT-grupperne sammenlignet med hver kontrol (figur 5C, D).
Figur 1: Anatomisk lokalisering af injektionsstedet for lateral ventrikel. A) Et skematisk diagram, der viser tidspunktet for virusinjektionen. (B) Injektionsstedet for lateral ventrikel er placeret 0,58 mm under bregma og 1,1 mm lateralt til sagittal sutur, som angivet med den røde prik. (C) Et billede, der viser stedet for virusinjektion på en mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Lokalisering af tdTomatfluorescens i ChP . (A,B) Repræsentativt billede af Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomatmus behandlet med ICV-injektion af CRETAT. Ved 2 uger senere blev tdTomat autofluorescens specifikt lokaliseret til ChP-vævet (n = 3/gruppe). (C,D) De fusionerede billeder af tdTomato autofluorescens og DAPI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af C57BL/6-mus taget 2 uger efter ICV-injektion af AAV2/5-scramble-EGFP eller AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) De repræsentative billeder af mus injiceret med AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/gruppe). (C,D) De repræsentative billeder af mus injiceret med AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/gruppe). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Induktion af EAE-modellen. (A) For det første injiceres MOG-antigenemulsionen subkutant på fire forskellige steder (nakke, ryg, venstre og højre hofter), som betegnes med røde prikker. (B) PT injiceres intraperitonealt på immuniseringstidspunktet og gentages 2 dage senere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: ChP-specifik knockdown af A 2A R lindrede EAE-patologi. (A) ChP-specifik knockdown af A 2A R i A 2ARfloks/flox-mus, opnået ved ICV-injektion af CRE-TAT, førte til nedsat EAE klinisk score (n = 6-7/gruppe). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af tovejs RM ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligningstest. (B) ChP-specifik knockdown af A2AR i vildtypemus (WT), opnået med ICV-injektion af AAV2/5-shRNA, reducerede EAE-kliniske scorer (n = 7-8/gruppe). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af tovejs RM ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligningstest. (C,D) Resultater af qPCR-analysen af A2AR mRNA-niveauer i ChP-væv (n = 5/gruppe). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en uparret t-test. (E,F) H &E farvning. ChP-specifik A2AR knockdown svækket immuncelleinfiltration i rygmarven. Statistisk signifikans er repræsenteret som ###p < 0,001, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskningen præsenterede to forskellige tilgange til målrettet knockdown af ChP-gener. Den første fremgangsmåde involverede ICV-injektion af CRE-TAT, som indeholder Cre-rekombinase, i A2AR-floks/flox-mus. Den anden fremgangsmåde indebar ICV-injektion af AAV2/5, der bærer shRNA af A2AR. Ved at udnytte disse to strategier opnåede arbejdet den selektive knockdown af A 2A R inden for ChP og var i stand til at demonstrere de beskyttende virkninger af at hæmme A2AR-signalering i ChP på EAE-patologi. Bemærk, at denne protokol indeholder to afgørende trin. For det første er den stereotaxiske lokaliseringsoperation afgørende, og signifikant afvigelse fra de foreslåede koordinater kan resultere i tilfældige fejl. For det andet er mængden af den injicerede virus kritisk, da det har vist sig, at injektion af mindre end 1 μL virus (~ 6 x 1012) også har en vis chance for fiasko. Dette skyldes muligvis behovet for en tilstrækkelig mængde viruspartikler til tilstrækkelig infektion.
Brug af Cre/LoxP-systemet tillod ikke observation af den præcise fordeling af CRE-TAT-rekombinase i hjernen efter ICV-injektion. Som et resultat brugte undersøgelsen Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-mus til at spore fordelingen af CRE-TAT ved hjælp af autofluorescensen af tdTomato-proteinet. tdTomatfluorescensen var udelukkende placeret i ChP-væv 2 uger efter injektion af CRE-TAT intracerebroventricularly, hvilket indikerer, at rekombinasen primært blev absorberet af ChP. Derefter blev CRE-TAT administreret til A 2A Rflox/flox mus, og et fald i A2AR mRNA niveauer blev observeret i ChP vævet. Denne målrettede knockdown-strategi blev brugt til at undersøge kortikosteroidsignaleringens rolle i ChP i formidling af psykologisk stress17. Alternativt brugte forskningen AAV2/5 til at levere shRNA designet til at målrette ChP-gener. Tidligere undersøgelser har evalueret infektionsevnen hos forskellige serotyper af AAV'er og lentivirus i ChP-væv og fundet, at AAV2/5 og AAV2/8 var de mest effektive14. Undersøgelsen afslørede, at AAV2/5 var i stand til at inficere ChP specifikt uden at forårsage åbenlyse infektioner i andre hjerneområder. Disse to metoder er mindre besværlige end klassiske knockout-strategier, der kræver to transgene linjer (Cre- og Flox-linjer)6,18. En begrænsning ved denne undersøgelse er fraværet af et gain-of-function-eksperiment med genoverekspression. En mulig tilgang til at opnå dette ville imidlertid være at klone det fulde cDNA og pakke det ind i AAV2/5-virussen, som ville blive administreret via ICV-infektion. I en tidligere undersøgelse viste overekspression af NKCC1 i ChP ved anvendelse af AAV2/5 sig at fremme CSF-clearance og reducere ventrikulomegali in vivo9. Det er vigtigt at bemærke, at enten AAV2/5- eller Cre/LoxP-strategien har deres egen fordel. ICV-injektionen af CRE-TAT i transgene mus sikrer høj knockdown-effektivitet, da målgenet slettes direkte fra cellernes DNA. Denne metode afhænger dog af produktion og avl af floxede mus. På den anden side undgår ICV-injektionen af AAV2/5 den tidskrævende proces med opdræt af transgene mus. Imidlertid afhænger knockdown-effektiviteten af denne metode i vid udstrækning af ydeevnen af det designede shRNA. Derfor kan forskere vælge en passende metode baseret på deres eksperimentelle forhold.
Multipel sklerose (MS) er en autoimmun sygdom, der forårsager betændelse og demyelinering af hvidt stof i CNS19. For at studere de patologiske mekanismer ved MS har forskere brugt en EAE-model, der simulerer sygdommens symptomer, såsom demyelinering og immuninfiltration. Denne model anses for ideel til forståelse af MS. I 2009 blev det opdaget, at immunceller infiltrerer CNS gennem ChP, som er en vigtig rute for immuncelleindgang i MS-patologi. Den "første bølge" af immunceller går ind i CSF gennem ChP, efterfulgt af den "anden bølge", som kommer ind i hjernens parenchyma gennem BBB20. Den "første bølge" af immunceller fremmer inflammation og fremskynder BBB-lækage, så hæmning af immuninfiltration ved ChP kan være nyttig til tidlig indgriben i MS. Kemokiner og vedhæftningsmolekyler regulerer ChP's gatingaktivitet og styrer lymfocytternes evne til at infiltrere over det21,22,23.
Tidligere undersøgelser brugte helkropsknockout eller farmakologisk teknologi (såsom neutraliserende antistoffer) til at undersøge signalmolekyler i ChP, men disse metoder definerede ikke nøjagtigt deres biologiske funktion i MS-patologisk proces. I en nylig undersøgelse slog forskere A 2A R, der ligger i ChP hos A2ARfloks / flox-mus, og fandt ud af, at EAE-score og immuninfiltration blev signifikant reduceret11. Denne undersøgelse bekræfter rollen som A2AR-signalering i ChP under EAE-patologi og demonstrerer, at ChP-specifikke knockdown-metoder er nyttige værktøjer til at studere ChP-funktion i CNS-patologier.
Afslutningsvis er den ChP-specifikke manipulationsprotokol et ideelt værktøj til at udforske biologifunktionen af ChP, der er involveret i degenerative sygdomme i CNS, såsom Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, MS og så videre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser eller andre oplysninger at erklære.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt støtten fra National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 31800903, tildelt W. Zheng) og Wenzhou Science and Technology Project (nr. Y2020426, tildelt Y. Y. Weng) til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P.
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
