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Neuroscience

कोरॉइड प्लेक्सस में जीन का लक्षित वध

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65555
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 3,4
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Rehabilitation Medicine Center, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4Integrative & Optimized Medicine Research Center, China-USA Institute for Acupuncture and Rehabilitation, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में किसी भी प्रभाव से बचने के दौरान कोरॉयड प्लेक्सस में जीन अभिव्यक्तियों को चुनिंदा रूप से बदलने की एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

कोरॉयड प्लेक्सस (सीएचपी) शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के लिए एक महत्वपूर्ण प्रवेश द्वार के रूप में कार्य करता है। हाल के शोध से पता चला है कि सीएचपी गतिविधि को विनियमित करने से सीएनएस विकारों के खिलाफ सुरक्षा मिल सकती है। हालांकि, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को प्रभावित किए बिना सीएचपी के जैविक कार्य का अध्ययन करना इसकी नाजुक संरचना के कारण चुनौतीपूर्ण है। यह अध्ययन एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) या साइक्लाइजेशन रिकॉम्बिनेशन एंजाइम (सीआरई) रिकॉम्बिनेस प्रोटीन का उपयोग करके सीएचपी ऊतक में जीन वध के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करता है जिसमें टीएटी अनुक्रम (सीआरई-टीएटी) शामिल है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, अध्ययन ने आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) या एक्स-ओवरपी 1 (सीआरई / लॉक्सपी) सिस्टम के सीआरई / लोकस का उपयोग करके सीएचपी में एडेनोसिन ए 2 ए रिसेप्टर (ए2 ए आर) को सफलतापूर्वक गिरा दिया, और दिखाया कि यह वध प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस (ईएई) की विकृति को कम कर सकता है। सीएनएस विकारों में सीएचपी की भूमिका पर भविष्य के शोध के लिए इस तकनीक के महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकते हैं।

Introduction

कोरॉयड प्लेक्सस (सीएचपी) को अक्सर मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ) 1,2 को स्रावित करके मस्तिष्क कार्यात्मक होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में मदद करने के लिए सोचा गया था। पिछले तीन दशकों में बढ़ते शोध से पता चला है कि सीएचपी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के लिए एक अलग मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है।

सीएचपी के तंग जंक्शन (टीजे), एक मोनोलेयर सीएचपी एपिथेलियम से बने होते हैं, मैक्रोमोलेक्यूल्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मस्तिष्कमें प्रवेश करने से रोककर इम्यूनोलॉजिकल होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं। हालांकि, कुछ रोग स्थितियों के तहत, सीएचपी ऊतक सीएसएफ और रक्त में खतरे से जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी) का पता लगाता है और प्रतिक्रिया करता है, जिससे असामान्य प्रतिरक्षा घुसपैठ और मस्तिष्क की शिथिलता 4,5 हो जाती है। इसकी महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, मस्तिष्क में सीएचपी का छोटा आकार और अद्वितीय स्थान अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को प्रभावित किए बिना इसके कार्य का अध्ययन करना मुश्किल बनाता है। इसलिए, विशेष रूप से सीएचपी में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करना इसके कार्य को समझने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है।

प्रारंभ में, साइक्लाइजेशन पुनर्संयोजन एंजाइम (सीआरई) ट्रांसजेनिक लाइनें, जो सीएचपी में व्यक्त जीन के लिए विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में सीआरई को व्यक्त करती हैं, आमतौर पर फ्लोक्स्ड उम्मीदवार जीन 6,7,8 के साथ प्रजनन करके लक्ष्य जीन को हटाने के लिए उपयोग की जाती थीं। उदाहरण के लिए, प्रतिलेखन कारक फोर्कहेड बॉक्स जे 1 (फॉक्सजे 1) विशेष रूप से प्रसवपूर्व माउस मस्तिष्क7 के सीएचपी उपकला में व्यक्त किया जाता है। इस प्रकार, फॉक्सजे 1-क्रे लाइन का उपयोग अक्सर सीएचपी 6,9 में स्थित जीन को हटाने के लिए किया जाता था। हालांकि, इस रणनीति की सफलता प्रमोटर की विशिष्टता पर बहुत अधिक निर्भर करती है। धीरे-धीरे यह पता चला कि फॉक्सजे 1 अभिव्यक्ति पैटर्न पर्याप्त विशिष्ट नहीं था, क्योंकि फॉक्सजे 1 मस्तिष्क और परिधीय प्रणाली7 के अन्य हिस्सों में सिलिएटेड उपकला कोशिकाओं में भी मौजूद था। इस सीमा को दूर करने के लिए, फ्लोक्स्ड ट्रांसजेनिक लाइनों के वेंट्रिकल्स में रिकॉम्बिनेस पहुंचाने के लिए क्रे रेकोम्बिनेस का इंट्रा-सेरेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) इंजेक्शन किया गया था। इस रणनीति ने उच्च विशिष्टता दिखाई, जैसा कि सीएचपी ऊतक10,11 में पूरी तरह से टीडीटोमेटो फ्लोरेसेंस की उपस्थिति से स्पष्ट है। हालांकि, यह विधि अभी भी फ्लोक्सेड ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की उपलब्धता से सीमित है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, शोधकर्ताओं ने सीएचपी-विशिष्ट वध या लक्ष्य जीन12,13 के ओवरएक्प्रेशन को प्राप्त करने के लिए एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के आईसीवी इंजेक्शन को नियोजित किया है। सीएचपी संक्रमण के लिए विभिन्न एएवी सीरोटाइप के व्यापक मूल्यांकन से पता चला है कि एएवी 2/5 और एएवी 2/8 सीएचपी में मजबूत संक्रमण क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं, जबकि अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को संक्रमित नहीं करते हैं। हालांकि, एएवी 2/8 को वेंट्रिकल्स के आसपास एपेंडिमा को संक्रमित करने के लिए पाया गया था, जबकि एएवी 2/5 समूह ने कोई संक्रमण नहीं दिखायाथा। इस विधि में फ्लोक्स्ड ट्रांसजेनिक जानवरों को प्राप्त करने की सीमाओं पर काबू पाने का लाभ है।

यह लेख दो तरीकों का उपयोग करके सीएचपी में जीन वध के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है: एडेनोसिन ए 2 ए रिसेप्टर (ए 2 ए आर) के एसएचआरएनए को ले जाने वाले एएवी 2/5 का आईसीवी और ए 2 एआर के सीएचपी-विशिष्ट वध को प्राप्त करने के लिए टीएटी अनुक्रम (सीआरई-टीएटी) रिकॉम्बिनेस सेयुक्त क्रे रेकोम्बिनेस प्रोटीन। अध्ययन के निष्कर्षों से पता चलता है कि सीएचपी में ए2 एआर को खटखटाने से प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) को कम किया जा सकता है। यह विस्तृत प्रोटोकॉल सीएचपी फ़ंक्शन अध्ययन और सीएचपी में जीन के विशिष्ट वध के लिए उपयोगी मार्गदर्शन प्रदान करता है।

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Protocol

इस अध्ययन में वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और वेनझोउ मेडिकल यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. जानवर

  1. 8-12 सप्ताह की आयु के नर सी 57बीएल / 6 चूहों को खरीदें और 20-22 ग्राम वजन करें।
  2. ट्रांसजेनिक रोजा-एलएसएल (लॉक्स-एसटीओपी-लॉक्स)-टीडीटोमेटो (एआई 9) माउस लाइन, और पुरुष ए2 एआरफ्लोक्स / फ्लोक्स चूहों को प्राप्त करें।
  3. यादृच्छिक रूप से चूहों को दो समूहों में असाइन करें और पिंजरों में रखें, जिसमें प्रति पिंजरे में अधिकतम पांच चूहे हों, 1 सप्ताह के लिए मानक 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे चक्र के तहत।
  4. चूहों को पर्याप्त भोजन और पानी प्रदान करें और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर तापमान पर बनाए रखें।

2. एएवी 2/5-एसएचआरएनए के साथ ए 2 ए आर का सीएचपी-विशिष्ट वध।

  1. प्रत्येक माउस का वजन करें और मूल्यों को लिखें।
  2. चूहों को इंट्रापरिटोनियल रूप से 60-80 मिलीग्राम / किलोग्राम पेंटोबार्बिटल के बराबर 6-8 एमएल / किलोग्राम की खुराक पर 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम के साथ एनेस्थेटाइज्ड करें, और माउस को गर्म रखने के लिए हीटिंग पैड पर रखें।
    नोट: सफल सर्जरी सुनिश्चित करने के लिए माउस के वजन के अनुसार पेंटोबार्बिटल सोडियम की सही खुराक का प्रशासन करना महत्वपूर्ण है। संज्ञाहरण बहुत गहरा नहीं होना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर हो सकती है, लेकिन बहुत उथला नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्रक्रिया के दौरान माउस जाग सकता है, संभावित रूप से वायरस इंजेक्शन की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकता है। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा उचित संज्ञाहरण खुराक की जांच करें और सुनिश्चित करें कि चूहे प्रतिक्रिया नहीं देते हैं।
  3. एनेस्थेटाइज्ड चूहों के शीर्ष बालों को ट्रिम करने के लिए एक विशेष माउस शेवर का उपयोग करें।
  4. सूखने से बचाने के लिए दोनों आंखों पर आंखों का मरहम लगाएं, और मस्तिष्क को गतिहीन करने के लिए चूहों को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर ठीक करें। जानवर को बाँझ ड्रेप के साथ कवर करें।
  5. पोस्टऑपरेटिव संक्रमण को कम करने के लिए आयोडोफोर कीटाणुनाशक के तीन राउंड और 75% अल्कोहल के साथ चूहों के सिर और गर्दन की त्वचा को अच्छी तरह से निष्फल करें। फिर चूहों की खोपड़ी पर 1% लिडोकेन शीर्ष पर लागू करें और माइक्रोस्कोप के तहत खोपड़ी को पूरी तरह से उजागर करने के लिए एक छोटा चीरा लगाएं।
    नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान बाँझ उपकरणों का उपयोग करें।
  6. दो 10 μL सिरिंज तैयार करें: एक खरीदे गए AAV2/5-A2A R-shRNA(टिटर: 6.27 × 10 9 vg/μL) के साथ और दूसरा खरीदा गया AAV2/5-स्क्रैम्बल (टिटर: 6.21 × 109 vg/μL) के साथ।
    नोट: सिरिंज का उपयोग करते समय, सामने के छोर को ग्लास केशिका से जोड़ा जाना चाहिए, और ग्लास केशिका की लंबाई को नियंत्रित करके 10 μL की सीमा प्राप्त की जा सकती है।
  7. ब्रेग्मा और लैम्ब्डा का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और समन्वय बिंदु सेट करें (एपी: -0.58; एमएल: ±1.10; डीएल: -2.20) 10 μL सिरिंज पर (चित्रा 1)। समन्वय बिंदु माउस मस्तिष्क स्टीरियोटैक्सिक एटलस15 पर आधारित है।
  8. समायोजित समन्वय बिंदु पर खोपड़ी में एक छोटा छेद ड्रिल करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप के तहत, खोपड़ी की सतह के खिलाफ एक बाँझ माइक्रोड्रिल का उपयोग करके ड्रिलिंग की जाती है। ड्रिलिंग के बाद, मस्तिष्क को कवर करने वाले मेनिंगेस को हटाकर और अंतर्निहित मस्तिष्क पैरेन्काइमा को उजागर करके, रक्त वाहिकाओं को चोट से रोका जाता है। यह कदम ग्लास केशिका की नोक को मेनिंगेस द्वारा टूटने से रोकता है। ड्रिल किए गए छेद का व्यास सुई की नोक को मस्तिष्क के ऊतकों में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  9. एएवी 2/5-ए 2ए आर-एसएचआरएनएवायरस के 2 μL को 100 nL / min की स्थिर दर पर पार्श्व इंजेक्शन के माध्यम से मस्तिष्क वेंट्रिकल में प्रशासित करें। निकालने से पहले सुई को 10 मिनट के लिए रखें। ध्यान दें कि वायरस को एकतरफा इंजेक्शन के साथ प्रशासित किया गया था।
  10. वायरस के नुकसान को रोकने के लिए तुरंत मेडिकल बायोफिब्रिन गोंद का उपयोग करके घायल त्वचा को सील करें, जिसे सुई को हटाने के बाद सीएसएफ से धोया जा सकता है यदि गोंद जल्दी से लागू नहीं होता है। इसके अलावा, सीएसएफ को पोंछने के लिए कपास की कलियों का उपयोग न करें, क्योंकि इससे वायरस का नुकसान भी हो सकता है।
  11. वसूली की सुविधा के लिए, शरीर के तापमान को 37.0 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए माउस को हीटिंग पैड पर रखें, और माउस की खोपड़ी पर 1% लिडोकेन लागू करें। ईएई मॉडल को प्रेरित करने से पहले चूहों को 2 सप्ताह तक ठीक होने की अनुमति दें, क्योंकि यह अवधि एएवी 2/5-ए 2 ए आर-एसएचआरएनए वायरस अभिव्यक्ति और बाद में ए2 ए आरवध केलिए आवश्यक है।

3. एक्स-ओवरपी1 (सीआरई/लॉक्सपी) प्रणाली के सीआरई/लोकस के साथ ए 2 ए आर का सीएचपी-विशिष्ट वध।

नोट: पहले वर्णित विधि का उपयोग करके निम्नलिखित प्रक्रियाओं को प्राप्त किया जा सकता है। विस्तृत इंजेक्शन विधियों के लिए चरण 2.1-2.11 देखें।

  1. प्रायोगिक समूह के रूप में रोजा-एलएसएल (लॉक्स-स्टोप-लॉक्स)-टीडीटोमैटो माउस के प्रत्येक पार्श्व वेंट्रिकल में सीआरई-टीएटी रिकोम्बिनेस के 2 μL और नियंत्रण समूह के रूप में बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 2 μL इंजेक्ट करें। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल (खंड 2) का उपयोग करते हुए, नियंत्रण समूह के रूप में बाँझ पीबीएस के 2 μL के साथ A2AR फ्लोक्स/ फ्लोक्स चूहों के पार्श्व वेंट्रिकल्स में से प्रत्येक में सीआरई-टीएटी रिकोम्बिनेस के 2 μL इंजेक्ट करें।
  2. जमे हुए ऊतक अनुभाग तैयार करें और सीआरई-टीएटी रिकॉम्बिनेस इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद परमाणु धुंधलापन करें। अधिक जानकारी के लिए चरण 4.1-4.3 देखें।

4. चूहों में ट्रांसकार्डियल छिड़काव।

  1. चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज करने के लिए 60-80 मिलीग्राम / किग्रा पेंटोबार्बिटल सोडियम का उपयोग करें। पैर की अंगुली की चुटकी द्वारा संज्ञाहरण के विमान की पुष्टि करें और 40 एमएल बाँझ पीबीएस समाधान का उपयोग करके ट्रांसकार्डियल छिड़काव करें, इसके बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 20 एमएल का उपयोग करें।
    नोट: सफल छिड़काव यकृत में एक सफेद रंग द्वारा इंगित किया जाता है, जबकि छिड़काव के दौरान बढ़े हुए फेफड़ों या मुंह से पीबीएस बहिर्वाह की उपस्थिति प्रक्रिया की विफलता का सुझाव देती है।
  2. माउस मस्तिष्क को जल्दी से निकालें, न्यूनतम प्रोटीन क्षरण सुनिश्चित करें।
  3. पोस्ट-फिक्सेशन के लिए माउस मस्तिष्क को रात भर 4% पीएफए / पीबीएस में डुबोएं, इसके बाद 72 घंटे के लिए 30% सुक्रोज पीबी समाधान के साथ प्रतिस्थापन करें।
    नोट: मस्तिष्क के ऊतकों के अत्यधिक निर्जलीकरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए मस्तिष्क को सुक्रोज पीबी समाधान में बहुत लंबे समय तक नहीं छोड़ा जाना चाहिए।

5. जमे हुए ऊतक विभाजन और धुंधलापन

  1. इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) गोंद में पहले निर्जलित माउस मस्तिष्क को एम्बेड करें, एम्बेडेड मस्तिष्क को फ्रीज करें, और 20 μm की मोटाई के साथ कोरोनल वर्गों को काटने के लिए एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम का उपयोग करें।
  2. मस्तिष्क के अनुभागों को ग्लास स्लाइड पर रखें। एक बार जब मस्तिष्क अनुभाग सूख जाते हैं, तो उन्हें बाद के प्रयोगों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
  3. प्रत्येक ग्लास स्लाइड को एक फ्रेम केस में रखें और स्लाइड को अच्छी तरह से कुल्ला करने के लिए फ्रेम को पीबीएस से भरे कंटेनर में डुबोएं। धीरे-धीरे पीबीएस समाधान के साथ मस्तिष्क स्लाइड को तीन बार कुल्ला करें, हर बार 10 मिनट के लिए।
    नोट: मस्तिष्क के वर्गों को ग्लास स्लाइड से गिरने से रोकने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए।
  4. 10 मिनट के लिए 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल (DAPI) घोल के साथ मस्तिष्क स्लाइड को दाग दें।
  5. 5 मिनट के लिए पीबीएस समाधान के साथ मस्तिष्क स्लाइड को कुल्ला करें।
  6. मस्तिष्क वर्गों में एंटीफैड माउंटिंग माध्यम की एक बूंद लागू करें।
  7. मस्तिष्क वर्गों पर एक कवरस्लिप रखें, नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें, और पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अनुभागों का विश्लेषण करें।

6. ईएई प्रेरण

नोट: एसएचआरएनए या सीआरई-टीएटी रिकॉम्बिनेस इंजेक्शन11 के 2 सप्ताह के बाद ईएई प्रेरण करें।

  1. 2 एमएल पीबीएस के साथ 2.5 मिलीग्राम माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी35-55) को मिलाकर एक जलीय घोल बनाएं। अपूर्ण फ्रायंड्स एडजुवेंट (आईएफए) के साथ एम. ट्यूबरकुलोसिस (एच 37 आरए) को मिलाकर एक पूर्ण फ्रायंड्स एडजुवेंट (सीएफए) तेल समाधान तैयार करें।
  2. जलीय और तेल के घोल को 1: 1 के अनुपात में मिलाएं। मिश्रण को तेल-इन-पानी की स्थिति में घुमाने के लिए एक टी पाइप का उपयोग करें।
    नोट: टी पाइप को तीन-तरफा पाइप भी कहा जाता है। यह एक प्लास्टिक ट्यूब है जो एमओजी35-55 और सीएफए को पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए बहने वाले समाधान की दिशा को नियंत्रित कर सकता है।
  3. बर्फ स्नान की स्थिति के तहत ईएई मॉडल के लिए एमओजी एंटीजन इमल्शन बनाने के लिए एक उच्च गति होमोजिनाइज़र का उपयोग करें।
  4. चूहों को इंट्रापरिटोनियल रूप से 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम के साथ 6-8 एमएल / किलोग्राम की खुराक पर 60-80 मिलीग्राम / किलोग्राम पेंटोबार्बिटल के बराबर एनेस्थेटाइज करें।
  5. कुल चार इंजेक्शन के लिए 10 एमएल / किलोग्राम की मात्रा पर एमओजी एंटीजन इमल्शन को चार अलग-अलग बिंदुओं (गर्दन, पीठ, बाएं और दाएं कूल्हों) में इंजेक्ट करें।
    नोट: इंजेक्शन साइट का सावधानीपूर्वक चयन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि विभिन्न साइटों का चूहों की रुग्णता और मृत्यु दर पर अलग-अलग प्रभाव पड़ सकता है। इसके अतिरिक्त, बार-बार एमओजी इंजेक्शन प्रतिरक्षा सहिष्णुता का कारण बन सकता है, इसलिए शोध टीम ने इस संभावित मुद्दे को रोकने के लिए एक एकल इंजेक्शन विधि चुनी।
  6. एमओजी इंजेक्शन के बाद 5 मिलीग्राम / किलोग्राम की खुराक पर तुरंत 500 एनजी / एमएल पर्टुसिस टॉक्सिन (पीटी) इंट्रापरिटोनियल इंजेक्ट करें।
    नोट: पीटी रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की पारगम्यता को बढ़ाता है और मस्तिष्क में टी कोशिकाओं की घुसपैठ की सुविधा प्रदान करता है।
  7. 48 घंटे के बाद, इंट्रापरिटोनियल रूप से पीटी समाधान को उसी मात्रा में इंजेक्ट करें।

7. न्यूरोलॉजिकल डेफिसिट स्कोर

  1. निम्नलिखित न्यूरोलॉजिकल घाटे के अनुसार ईएई की घटनाओं और गंभीरता का आकलन करने के लिए 0 से 15 तक के रेटिंग स्केल16 का उपयोग करके रोजाना चूहों का मूल्यांकन और ग्रेड करें:
    पूंछ: 0 कोई संकेत नहीं दर्शाता है, 1 एक अर्ध-लकवाग्रस्त पूंछ का प्रतिनिधित्व करता है, और 2 पूरी तरह से लकवाग्रस्त पूंछ को इंगित करता है।
    अंग: 0 कोई संकेत नहीं दर्शाता है, 1 एक कमजोर या परिवर्तित चाल का प्रतिनिधित्व करता है, 2 पैरेसिस को इंगित करता है, और 3 पूरी तरह से लकवाग्रस्त अंग का प्रतिनिधित्व करता है।
  2. पूर्ण पक्षाघात वाले क्वाड्रीप्लेजिक जानवर को 12 का स्कोर दें, और मृत्यु दर को 15 का स्कोर दें।

8. हेमटोक्सिलिन-ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होना।

  1. निर्जलित माउस मस्तिष्क लें और इसे पिघले हुए पैराफिन में एम्बेड करें। पैराफिन ब्लॉक को ठंडा होने दें और बाद में उपयोग के लिए जम जाएं।
    नोट: ऊतक क्षति से बचने के लिए पैराफिन ब्लॉक पूरी तरह से सूखा और ठंडा होना चाहिए।
  2. माउस मस्तिष्क पैराफिन ब्लॉक को 5 μm मोटी स्लाइड में काटें। पैराफिन माउस मस्तिष्क अनुभाग को एक ग्लास स्लाइड पर रखें और इसे 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में सुखाएं।
  3. स्लाइड्स को क्रमिक रूप से जाइलीन घोल I में 10 मिनट के लिए, जाइलीन घोल II में 10 मिनट के लिए, 100% अल्कोहल I 3 मिनट के लिए, 100% अल्कोहल II 3 मिनट के लिए, 95% अल्कोहल 3 मिनट के लिए, 90% अल्कोहल 3 मिनट के लिए, 80% अल्कोहल 3 मिनट के लिए, और आसुत जल 1 मिनट के लिए डुबोएं।

9. मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) विश्लेषण

  1. पीबीएस के साथ चूहों को संक्रमित करने के बाद, वेंट्रिकल्स से सीएचपी को हटा दें और ट्राइज़ोल के साथ आरएनए निकालें। पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करें।
  2. एक्स टैक एसवाईबीआर-ग्रीन प्रीमिक्स और एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली का उपयोग करके क्यूपीसीआर विश्लेषण करें। निम्नलिखित ए2 एआर प्राइमरों का उपयोग करें: फॉरवर्ड - जीसीसीएटीसीसीएटीसीजीसीसीएटीसीए; रिवर्स - जीसीएएटीएजीसीएएजीएजीएजीएजी।

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Representative Results

एएवी2/5-एसएचआरएनए या सीआरई-टीएटी के आईसीवी इंजेक्शन द्वारा सीएचपी-विशिष्ट ए2 एआर का वध
ईएई रोगजनन में तंत्रिका जानकारी के एक शक्तिशाली नियामक के रूप में सीएचपी में ए2 एआर की भूमिका स्पष्ट नहीं है। सीएचपी-विशिष्ट ए 2 एआरअभिव्यक्ति को खटखटाने से ईएई और अन्य तंत्रिका तंत्र की सूजन में केंद्रीय प्रतिरक्षा प्रणाली पर ए2 एआर नियामक प्रभावों पर प्रकाश पड़ सकता है। इस अध्ययन ने ए 2 ए आर फ्लोक्स/ फ्लोक्स चूहों के सीएचपी में ए2 एआर अभिव्यक्ति को कम करने केलिए सीआरई-टीएटी के आईसीवी इंजेक्शन का उपयोग किया। सीएचपी विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, हमने पहले रोजा-एलएसएल (लॉक्स-एसटीओपी-लॉक्स)-टीडीटोमेटो (एआई 9) चूहों के पार्श्व वेंट्रिकल्स में सीआरई-टीएटी इंजेक्ट किया। छवियों से संकेत मिलता है कि सहज टीडीटोमेटो प्रतिदीप्ति सीएचपी ऊतक (चित्रा 2) तक ही सीमित थी। इसी तरह, अध्ययन ने एएवी 2/5-सीएमवी-ए2 एआर-एसएचआरएनए-सीएमवी-एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को सी 57बीएल/6 चूहों में प्रशासित किया और पाया कि ईजीएफपी फ्लोरेसेंस सीएचपी की उपकला कोशिका परत तक सीमित था और पार्श्व वेंट्रिकल्स के पास आसपास के पैरेन्काइमल कोशिकाओं को संक्रमित नहीं करता था (चित्रा 3)।

एमओजी35-55 के साथ ईएई प्रेरण।
स्थिर ईएई को प्रेरित करने के लिए, चूहों को एमओजी35-55 और सीएफए से युक्त एक इमल्शन के साथ इंजेक्शन दिया गया था, इसके बाद टीकाकरण के बाद 0 और 2 दिनों में पीटी का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन दिया गया था (चित्रा 4)। नैदानिक लक्षण पैमाने का उपयोग पूंछ और अंग की स्थिति के आधार पर दैनिक ईएई स्कोर का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। ईएई की शुरुआत को ईएई स्कोर ≥1 के साथ पहले दिन के रूप में परिभाषित किया गया था, जबकि शुरुआत और पीक ईएई स्कोर के बीच की अवधि को प्रगतिशील चरण कहा जाता था।

सीएचपी-विशिष्ट ए2 एआर वध ईएई पैथोलॉजी को कम करता है।
ईएई पैथोलॉजी में ए 2 ए आर सिग्नल की भागीदारी की जांच करने के लिए, अध्ययन ने सीएचपी-विशिष्ट ए2 एआर वध को नियोजित किया। अध्ययन ने विशेष रूप से सीआरई-टीएटी या एएवी 2/5-ए 2 ए आर-एसएचआरएनए के आईसीवी इंजेक्शन का उपयोग करके सीएचपी में ए2 एआर को गिरा दिया। वध के 2 सप्ताह बाद, ईएई को एमओजी35-55 टीकाकरण द्वारा प्रेरित किया गया था। परिणामों से पता चला है कि, नियंत्रण समूह की तुलना में, ए2ए आर वध वाले चूहों ने हल्के ईएई पैथोलॉजी विकसित की, जैसा कि कम स्कोर और रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कम घुसपैठ से स्पष्ट है (चित्रा 5 ए, बी, ई, एफ)। इसके अलावा, एमओजी35-55 टीकाकरण के बाद 20 वें दिन प्रत्येक समूह से पांच ईएई-प्रेरित चूहों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। पीबीएस के साथ छिड़काव के बाद, सीएचपी को आरएनए निष्कर्षण और क्यूपीसीआर के लिए अलग किया गया था। क्यूपीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि प्रत्येक नियंत्रण (चित्रा 5 सी, डी) की तुलना में एएवी 2/5-एसएचआरएनए (ए 2 ए आर-केडी) और सीआरई-टीएटी समूहों में ए2 एआर के एमआरएनए स्तर स्पष्ट रूप से कम हो गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: पार्श्व वेंट्रिकल इंजेक्शन साइट का शारीरिक स्थानीयकरण। (ए) वायरस इंजेक्शन के बिंदु को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध आरेख। (बी) पार्श्व वेंट्रिकल का इंजेक्शन साइट ब्रेग्मा से 0.58 मिमी नीचे और 1.1 मिमी पार्श्व में स्थित है, जैसा कि लाल बिंदु द्वारा इंगित किया गया है। (सी) माउस पर वायरस इंजेक्शन की साइट को दिखाने वाली एक छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
(ए, बी) रोजा-एलएसएल (लॉक्स-एसटीओपी-लॉक्स) -टीडीटमाटर चूहों की प्रतिनिधि छवि को क्रेटट के आईसीवी इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया। 2 सप्ताह बाद, टीडीटोमेटो ऑटोफ्लोरेसेंस को विशेष रूप से सीएचपी ऊतक (एन = 3 / समूह) के लिए स्थानीयकृत किया गया था। (C, D) टीडीटोमेटो ऑटोफ्लोरेसेंस और डीएपीआई की विलय की गई छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एएवी 2/5-स्क्रैम्बल-ईजीएफपी या एएवी 2/5-एसएचआरएनए-ईजीएफपी के आईसीवी इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद ली गई सी 57बीएल /6 चूहों की प्रतिनिधि छवियां। (ए, बी) एएवी 2/5-स्क्रैम्बल-ईजीएफपी (एन = 3/समूह) के साथ इंजेक्शन दिए गए चूहों की प्रतिनिधि छवियां। (C, D) चूहों की प्रतिनिधि छवियों को एएवी 2/5-एसएचआरएनए-ईजीएफपी (एन = 3/समूह) के साथ इंजेक्ट किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईएई मॉडल का प्रेरण। (ए) सबसे पहले, एमओजी एंटीजन इमल्शन को चमड़े के नीचे चार अलग-अलग स्थानों (गर्दन, पीठ, बाएं और दाएं कूल्हों) में इंजेक्ट किया जाता है, जिन्हें लाल बिंदुओं द्वारा निरूपित किया जाता है। (बी) पीटी को टीकाकरण के समय इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है और 2 दिन बाद दोहराया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ए 2 ए आर के सीएचपी-विशिष्ट वध ने ईएई पैथोलॉजी को कम कर दिया। (ए) सीआरई-टीएटी के आईसीवी इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त ए 2 ए आर फ्लोक्स/फ्लोक्स चूहों में ए 2 एआर के सीएचपी-विशिष्ट वध से ईएई नैदानिक स्कोर (एन = 6-7 / समूह) में कमी आई। सांख्यिकीय विश्लेषण दोतरफा आरएम एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद सिदक का कई तुलना परीक्षण किया गया था। (बी) जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों में ए 2 ए आर के सीएचपी-विशिष्ट वध, एएवी2/5-एसएचआरएनए के आईसीवी इंजेक्शन के साथ हासिल किया गया, ईएई नैदानिक स्कोर (एन = 7-8 / समूह) में कमी आई। सांख्यिकीय विश्लेषण दोतरफा आरएम एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद सिदक का कई तुलना परीक्षण किया गया था। (C, D) सीएचपी ऊतक (एन = 5 / समूह) में ए2 एआर एमआरएनए स्तरों के क्यूपीसीआर विश्लेषण के परिणाम। सांख्यिकीय विश्लेषण एक अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। (E, F) एच एंड ई धुंधला होना। सीएचपी-विशिष्ट ए2 एआर रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ को क्षीण करता है। सांख्यिकीय महत्व को ###p < 0.001, *p < 0.01, और **p < 0.001 के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

शोध ने सीएचपी जीन के लक्षित वध के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोण प्रस्तुत किए। पहले दृष्टिकोण में सीआरई-टीएटी का आईसीवी इंजेक्शन शामिल था, जिसमें ए2 एआर फ्लोक्स/ फ्लोक्स चूहों में क्रे रेकोम्बिनेस शामिल है। दूसरे दृष्टिकोण में एएवी 2/5 के आईसीवी इंजेक्शन को शामिल किया गया जिसमें ए2 एआर का एसएचआरएनए था। इन दो रणनीतियों का उपयोग करके, काम ने सीएचपी के भीतर ए 2 ए आर के चयनात्मक वध को हासिल किया और ईएई पैथोलॉजी पर सीएचपी में ए2 एआर सिग्नलिंगको बाधित करने के सुरक्षात्मक प्रभावों को प्रदर्शित करने में सक्षम था। ध्यान दें, इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। सबसे पहले, स्टीरियोटैक्सिक स्थानीयकरण ऑपरेशन आवश्यक है, और सुझाए गए निर्देशांक से महत्वपूर्ण विचलन के परिणामस्वरूप यादृच्छिक विफलताएं हो सकती हैं। दूसरे, इंजेक्शन वाले वायरस की मात्रा महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह पाया गया है कि वायरस के 1 μL (~ 6 x 1012) से कम इंजेक्ट करने से विफलता की एक निश्चित संभावना भी है। यह संभवतः पर्याप्त संक्रमण के लिए वायरस कणों की पर्याप्त मात्रा की आवश्यकता के कारण है।

Cre/LoxP प्रणाली का उपयोग करने से आईसीवी इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क में सीआरई-टीएटी रिकोम्बिनेस के सटीक वितरण के अवलोकन की अनुमति नहीं मिली। नतीजतन, अध्ययन ने टीडीटमाटर प्रोटीन के ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके सीआरई-टीएटी के वितरण को ट्रैक करने के लिए रोजा-एलएसएल (लॉक्स-एसटीओपी-लॉक्स)-टीडीटोमैटो चूहों का उपयोग किया। टीडीटोमेटो फ्लोरेसेंस विशेष रूप से सीआरई-टीएटी इनट्रेसेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद सीएचपी ऊतकों में स्थित था, यह दर्शाता है कि रिकोम्बिनेस मुख्य रूप से सीएचपी द्वारा अवशोषित किया गया था। इसके बाद, सीआरई-टीएटी को ए 2 ए आर फ्लोक्स/ फ्लोक्स चूहों को प्रशासित किया गया था, और सीएचपी ऊतक में ए2 एआर एमआरएनए स्तरों में कमी देखी गई थी। इस लक्षित वध रणनीति का उपयोग मनोवैज्ञानिक तनाव17 की मध्यस्थता में सीएचपी में कॉर्टिकोस्टेरॉइड सिग्नलिंग की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। वैकल्पिक रूप से, शोध ने सीएचपी जीन को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए एसएचआरएनए को वितरित करने के लिए एएवी 2/5 का उपयोग किया। पिछले अध्ययनों ने सीएचपी ऊतक में एएवी और लेंटिवायरस के विभिन्न सीरोटाइप की संक्रमण क्षमता का मूल्यांकन किया है और पाया है कि एएवी 2/5 और एएवी 2/8 सबसे प्रभावी14 थे। अध्ययन से पता चला है कि एएवी 2/5 अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में स्पष्ट संक्रमण पैदा किए बिना विशेष रूप से सीएचपी को संक्रमित करने में सक्षम था। ये दो विधियां शास्त्रीय नॉकआउट रणनीतियों की तुलना में कम श्रमसाध्य हैं जिनके लिए दो ट्रांसजेनिक लाइनों (सीआरई और फ्लोक्स लाइनों) 6,18 की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन की एक सीमा जीन ओवरएक्प्रेशन के साथ गेन-ऑफ-फंक्शन प्रयोग की अनुपस्थिति है। हालांकि, इसे प्राप्त करने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण पूर्ण सीडीएनए को क्लोन करना और इसे एएवी 2/5 वायरस में पैकेज करना होगा, जिसे आईसीवी संक्रमण के माध्यम से प्रशासित किया जाएगा। पिछले अध्ययन में, एएवी 2/5 का उपयोग करके सीएचपी में एनकेसीसी 1 के ओवरएक्प्रेशन को सीएसएफ निकासी को बढ़ावा देने और विवो9 में वेंट्रिकुलोमेगाली को कम करने के लिए पाया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि या तो AAV2/5 या Cre / LoxP रणनीति का अपना लाभ है। ट्रांसजेनिक चूहों में सीआरई-टीएटी का आईसीवी इंजेक्शन उच्च वध दक्षता सुनिश्चित करता है, क्योंकि लक्ष्य जीन सीधे कोशिकाओं के डीएनए से हटा दिया जाता है। हालांकि, यह विधि फ्लोक्स्ड चूहों के उत्पादन और प्रजनन पर निर्भर करती है। दूसरी ओर, एएवी 2/5 का आईसीवी इंजेक्शन ट्रांसजेनिक चूहों के प्रजनन की समय लेने वाली प्रक्रिया से बचता है। हालांकि, इस विधि की वध दक्षता काफी हद तक डिज़ाइन किए गए एसएचआरएनए के प्रदर्शन पर निर्भर करती है। इसलिए, शोधकर्ता अपनी प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर एक उपयुक्त विधि चुन सकते हैं।

मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) एक ऑटोइम्यून बीमारी है जो सीएनएस19 में सफेद पदार्थ की सूजन और विघटन का कारण बनती है। एमएस के पैथोलॉजिकल तंत्र का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने एक ईएई मॉडल का उपयोग किया है जो रोग के लक्षणों का अनुकरण करता है, जैसे कि डिमाइलिनेशन और प्रतिरक्षा घुसपैठ। एमएस को समझने के लिए इस मॉडल को आदर्श माना जाता है। 2009 में, यह पता चला कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं सीएचपी के माध्यम से सीएनएस में घुसपैठ करती हैं, जो एमएस पैथोलॉजी में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवेश के लिए एक महत्वपूर्ण मार्ग है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं की "पहली लहर" सीएचपी के माध्यम से सीएसएफ में प्रवेश करती है, इसके बाद "दूसरी लहर" होती है, जो बीबीबी20 के माध्यम से मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रवेश करती है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं की "पहली लहर" सूजन को बढ़ावा देती है और बीबीबी रिसाव को तेज करती है, इसलिए सीएचपी में प्रतिरक्षा घुसपैठ को रोकना एमएस में शुरुआती हस्तक्षेप के लिए उपयोगी हो सकता है।

पिछले अध्ययनों ने सीएचपी में सिग्नलिंग अणुओं की जांच के लिए पूरे शरीर के नॉकआउट या औषधीय तकनीक (जैसे एंटीबॉडी को बेअसर करना) का उपयोग किया था, लेकिन इन तरीकों ने एमएस पैथोलॉजिकल प्रक्रिया में उनके जैविक कार्य को सटीक रूप से परिभाषित नहीं किया था। हाल के एक अध्ययन में, शोधकर्ताओं ने ए2 एआर फ्लोक्स/ फ्लोक्स चूहों के सीएचपी में स्थित ए2 एआर को गिरा दिया, और पाया कि ईएई स्कोर और प्रतिरक्षा घुसपैठमें काफी कमी आई थी। यह अध्ययन ईएई पैथोलॉजी के दौरान सीएचपी में ए2 एआर सिग्नलिंग की भूमिका की पुष्टि करता है और दर्शाता है कि सीएचपी-विशिष्ट वध विधियां सीएनएस विकृति में सीएचपी फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं।

अंत में, सीएचपी-विशिष्ट हेरफेर प्रोटोकॉल सीएनएस में अपक्षयी रोगों में शामिल सीएचपी के जीव विज्ञान समारोह का पता लगाने के लिए एक आदर्श उपकरण है, जैसे पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, एमएस, और इतने पर।

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Disclosures

लेखकों का कहना है कि उनके पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या अन्य प्रकटीकरण नहीं हैं।

Acknowledgments

हम इस काम के लिए चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31800903, डब्ल्यू झेंग को सम्मानित) और वेनझोउ विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (नंबर Y2020426, वाई वाई वेंग को सम्मानित) के समर्थन को कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2ARflox/flox mice State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD pt-4828
antifade mounting medium Beyotime Biotechnology 0100-01
borosilicate glass capillary Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd B100-50-10
brain stereotaxic apparatus RWD, Shenzhen 69100
C57BL/6 mice Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase Millipore SCR508
DAPI Absin B25A031
frozen slicing machine Leica CM1950
H37Ra Becton Dickinson and company 231141
Hamilton syringe Hamilton, American P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant Sigma F5506
Laser confocal microscope Zeiss LSM900
MOG35-55 Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD 4010006243
OCT glue Epredia 6502p
paraformaldehyde Chengdu Kelong Chemical Reagent Company 30525-89-4
pentobarbital sodium Boyun Biotech PC13003
Pipette gun Eppendorf N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit Takara  6110A
Real- Time PCR System BioRad CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice Jackson Laboratory
sucrose Sangon Biotech A502792-0500
super high speed homogenizer IKA 3737025
Trizol Invitrogen 15596026
xylene solution Chengdu Kelong Chemical Reagent Company 1330-20-7

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References

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कोरॉइड प्लेक्सस में जीन का लक्षित वध
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Yang, Y., Qi, C., Hu, L., Zheng, C., Li, X., Zheng, W., Weng, Y., Lin, H. Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (196), e65555, doi:10.3791/65555 (2023).

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