Summary
Aquí, describimos un método para alterar selectivamente las expresiones génicas en el plexo coroideo mientras se evita cualquier impacto en otras áreas del cerebro.
Abstract
El plexo coroideo (ChP) sirve como una puerta de entrada crítica para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Investigaciones recientes han demostrado que la regulación de la actividad de la CHP puede ofrecer protección contra los trastornos del SNC. Sin embargo, estudiar la función biológica de la ChP sin afectar a otras regiones cerebrales es un reto debido a su delicada estructura. Este estudio presenta un método novedoso para la eliminación de genes en el tejido ChP utilizando virus adenoasociados (AAV) o proteína recombinasa de la enzima de recombinación de ciclación (Cre) que consiste en la secuencia TAT (CRE-TAT). Los resultados demuestran que después de inyectar AAV o CRE-TAT en el ventrículo lateral, la fluorescencia se concentró exclusivamente en la ChP. Utilizando este enfoque, el estudio eliminó con éxito el receptor de adenosina A 2A (A2A R) en la ChP utilizando sistemas de ARN de interferencia (ARNi) o Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP), y demostró que esta eliminación podría aliviar la patología de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Esta técnica puede tener implicaciones importantes para futuras investigaciones sobre el papel de la ChP en los trastornos del SNC.
Introduction
A menudo se pensaba que el plexo coroideo (ChP) ayudaba a mantener la homeostasis funcional del cerebro mediante la secreción de líquido cefalorraquídeo (LCR) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)1,2. El aumento de la investigación en las últimas tres décadas ha revelado que la ChP representa una vía distinta para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC).
Las uniones estrechas (TJs) de la ChP, compuestas por un epitelio ChP monocapa, mantienen la homeostasis inmunológica impidiendo que las macromoléculas y las células inmunitarias entren en el cerebro3. Sin embargo, bajo ciertas condiciones patológicas, el tejido ChP detecta y responde a patrones moleculares asociados al peligro (DAMPs) en el LCR y la sangre, lo que conduce a una infiltración inmune anormal y a una disfunción cerebral 4,5. A pesar de su papel crítico, el pequeño tamaño de la ChP y su ubicación única en el cerebro dificultan el estudio de su función sin afectar a otras regiones cerebrales. Por lo tanto, la manipulación de la expresión génica específicamente en la ChP es un enfoque ideal para comprender su función.
Inicialmente, las líneas transgénicas de enzimas de recombinación de ciclación (Cre), que expresan Cre bajo el control de promotores específicos de genes expresados en la ChP, se utilizaron comúnmente para eliminar genes diana mediante la cría con genes candidatos floxados 6,7,8. Por ejemplo, el factor de transcripción Forkhead box J1 (FoxJ1) se expresa exclusivamente en el epitelio ChP del cerebro prenatal del ratón7. Por lo tanto, la línea FoxJ1-Cre se utilizó a menudo para eliminar genes localizados en la ChP 6,9. Sin embargo, el éxito de esta estrategia depende en gran medida de la especificidad del promotor. Poco a poco se descubrió que el patrón de expresión de FoxJ1 no era lo suficientemente distintivo, ya que FoxJ1 también estaba presente en células epiteliales ciliadas en otras partes del cerebro y del sistema periférico7. Para superar esta limitación, se realizó una inyección intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinasa para administrar recombinasa en los ventrículos de las líneas transgénicas floxadas. Esta estrategia mostró una alta especificidad, como lo demuestra la presencia de fluorescencia de tdTomato únicamente en el tejido ChP10,11. Sin embargo, este método todavía está limitado por la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos floxed. Para abordar este problema, los investigadores han empleado la inyección de virus adenoasociados (AAV) en ICV para lograr la eliminación específica de ChP o la sobreexpresión de genes diana12,13. Una evaluación exhaustiva de diferentes serotipos de AAV para la infección por ChP reveló que AAV2/5 y AAV2/8 exhiben una fuerte capacidad de infección en la ChP, mientras que no infectan otras regiones cerebrales. Sin embargo, se encontró que AAV2/8 infectaba el epéndimo que rodea a los ventrículos, mientras que el grupo AAV2/5 no mostró infección14. Este método tiene la ventaja de superar las limitaciones de la adquisición de animales transgénicos floxados.
Este artículo describe un protocolo paso a paso para la eliminación de genes en la ChP utilizando dos métodos: ICV de AAV2/5 portador de shRNA del receptor de adenosina A 2A (A 2A R) y proteína recombinasa Cre que consiste en la recombinasa de secuencia TAT (CRE-TAT) para lograr la eliminación específica de ChP de A2A R. Los hallazgos del estudio sugieren que la reducción de A2AR en la ChP puede aliviar la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo detallado proporciona una guía útil para los estudios de la función de ChP y la eliminación específica de genes en ChP.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou.
1. Animales
- Compre ratones machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad y con un peso de 20 a 22 g.
- Obtener la línea de ratones transgénicos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) y ratones machos A2AR flox/flox .
- Asigne aleatoriamente a los ratones a dos grupos y los aloje en jaulas, con un máximo de cinco ratones por jaula, bajo un ciclo estándar de 12 h de luz/12 h de oscuridad durante 1 semana.
- Proporcione a los ratones suficiente comida y agua y manténgalos a una temperatura constante a 25 °C.
2. Eliminación específica de ChP de A 2ARs con AAV2/5-shRNA
- Pesa cada ratón y anota los valores.
- Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 6-8 ml/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital, y colocar el ratón sobre una almohadilla térmica para mantenerlo caliente.
NOTA: Es crucial administrar la dosis correcta de pentobarbital sódico de acuerdo con el peso del ratón para garantizar el éxito de la cirugía. La anestesia no debe ser demasiado profunda, ya que puede provocar la mortalidad, pero no debe ser demasiado superficial, ya que el ratón puede despertarse durante el procedimiento, lo que podría afectar la eficacia de la inyección del virus. Verifique la dosis adecuada de anestesia pellizcando los dedos de los pies y asegurándose de que los ratones no respondan. - Usa una afeitadora de ratón especializada para recortar el vello superior de los ratones anestesiados.
- Aplique ungüento ocular en ambos ojos para evitar que se sequen y fije a los ratones en un aparato estereotáxico para inmovilizar el cerebro. Cubra al animal con una cortina estéril.
- Esterilizar a fondo la piel de la cabeza y el cuello de los ratones con tres rondas de desinfectante yodóforo y alcohol al 75% para reducir la infección postoperatoria. A continuación, aplique lidocaína al 1% por vía tópica en el cuero cabelludo de ratones y haga una pequeña incisión para exponer completamente el cráneo bajo un microscopio.
NOTA: Utilice instrumentos estériles durante todo el procedimiento. - Prepare dos jeringas de 10 μL: una con AAV2/5-A2AR-shRNA comprado (título: 6,27 × 10 9 vg/μL) y la otra con AAV2/5-Scramble comprado (título: 6,21 × 109 vg/μL).
NOTA: Cuando se usa la jeringa, el extremo frontal debe conectarse a un capilar de vidrio, y se puede obtener un rango de 10 μL controlando la longitud del capilar de vidrio. - Utilice el microscopio para localizar el bregma y la lambda y establezca el punto de coordenadas (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) en la jeringa de 10 μL (Figura 1). El punto de coordenadas se basa en el atlas estereotáxico15 del cerebro del ratón.
- Perfora un pequeño agujero en el cráneo en el punto de coordenadas ajustado.
NOTA: Bajo el microscopio, la perforación se realiza con un microtaladro estéril contra la superficie del cráneo. Después de la perforación, al extirpar las meninges que cubren el cerebro y exponer el parénquima cerebral subyacente, se previene la lesión de los vasos sanguíneos. Este paso evita que la punta del capilar de vidrio se rompa por las meninges. El diámetro del orificio perforado debe ser suficiente para permitir que la punta de la aguja entre en el tejido cerebral. - Administrar 2 μL de virus AAV2/5-A2AR-shRNA en el ventrículo cerebral mediante inyección lateral a una velocidad constante de 100 nL/min. Mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos antes de retirarla. Hay que tener en cuenta que el virus se administró con inyección unilateral.
- Selle la piel lesionada con pegamento médico de biofibrina rápidamente para evitar la pérdida de virus, que se puede enjuagar con líquido cefalorraquídeo después de quitar la aguja si el pegamento no se aplica rápidamente. Además, no use bastoncillos de algodón para limpiar el líquido cefalorraquídeo, ya que también puede causar la pérdida del virus.
- Para facilitar la recuperación, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal entre 37,0 ± 0,5 °C, y aplique lidocaína al 1% por vía tópica en el cuero cabelludo del ratón. Dejar que los ratones se recuperen durante 2 semanas antes de inducir el modelo EAE, ya que este período es necesario para la expresión del virus AAV2/5-A 2A R-shRNA y la posterior eliminación de A2AR.
3. Derribo específico de ChP de A 2AR con un sistema Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP)
NOTA: Los siguientes procedimientos se pueden lograr utilizando el método descrito anteriormente. Consulte los pasos 2.1-2.11 para conocer los métodos de inyección detallados.
- Inyectar 2 μL de CRE-TAT recombinasa en cada ventrículo lateral de un ratón Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato como grupo experimental y 2 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) como grupo de control. Utilizando el mismo protocolo anterior (sección 2), inyectar 2 μL de CRE-TAT recombinasa en cada uno de los ventrículos laterales de ratones A2AR flox/flox junto con 2 μL de PBS estéril como grupo de control.
- Preparar secciones de tejido congelado y realizar la tinción nuclear 2 semanas después de la inyección de recombinasa CRE-TAT. Consulte los pasos 4.1-4.3 para obtener más información.
4. Perfusión transcárdica en ratones
- Administrar 60-80 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar profundamente a los ratones. Confirme el plano de anestesia con un pellizco en el dedo del pie y realice la perfusión transcardíaca con 40 ml de solución estéril de PBS seguida de 20 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%.
NOTA: El éxito de la perfusión se indica por un color blanco en el hígado, mientras que la presencia de pulmones agrandados o de salida de PBS de la boca durante la perfusión sugiere un fracaso del procedimiento. - Extrae rápidamente el cerebro del ratón, asegurando una degradación mínima de las proteínas.
- Sumergir el cerebro del ratón en PFA/PBS al 4% durante la noche para la postfijación, seguido de la sustitución con una solución de PB de sacarosa al 30% durante 72 h.
NOTA: Es fundamental evitar la deshidratación excesiva del tejido cerebral, por lo que el cerebro no debe dejarse en la solución de sacarosa PB durante demasiado tiempo.
5. Corte y tinción de tejido congelado
- Incruste el cerebro de ratón previamente deshidratado en pegamento de temperatura óptima de corte (OCT), congele el cerebro incrustado y use un micrótomo deslizante para cortar secciones coronales con un grosor de 20 μm.
- Coloque las secciones del cerebro en el portaobjetos de vidrio. Una vez que las secciones del cerebro estén secas, guárdelas en un refrigerador a -20 ° C para experimentos posteriores.
- Coloque cada portaobjetos de vidrio en una caja con marco y sumérjalo en un recipiente lleno de PBS para enjuagar bien el portaobjetos. Enjuague suavemente los portaobjetos cerebrales con la solución de PBS tres veces, durante 10 minutos cada vez.
NOTA: Se debe tener precaución para evitar que las secciones del cerebro se caigan del portaobjetos de vidrio. - Tiñe los portaobjetos cerebrales con una solución de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min.
- Enjuague los portaobjetos cerebrales con una solución de PBS durante 5 minutos.
- Aplique una gota de medio de montaje antidecoloración en las secciones del cerebro.
- Coloque un cubreobjetos en las secciones del cerebro, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y analice las secciones con un microscopio de fluorescencia convencional.
6. Inducción EAE
NOTA: Realizar la inducción de EAE después de 2 semanas de la inyección de recombinasa de shRNA o CRE-TAT11.
- Cree una solución acuosa mezclando 2,5 mg de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) con 2 ml de PBS. Prepare una solución completa de aceite de adyuvante de Freunds (CFA) mezclando M. tuberculosis (H37Ra) con adyuvante de Freunds incompleto (IFA).
- Mezcle las soluciones acuosa y oleosa en una proporción de 1:1. Use un tubo en T para batir la mezcla a un estado de aceite en agua.
NOTA: La tubería en T también se denomina tubería de tres vías. Es un tubo de plástico que puede controlar la dirección de flujo de la solución para mezclar completamente el MOG35-55 y el CFA. - Utilizar un homogeneizador de alta velocidad para hacer la emulsión de antígeno MOG para el modelo EAE en condiciones de baño de hielo.
- Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital.
- Inyectar por vía subcutánea la emulsión de antígeno MOG en cuatro puntos diferentes (cuello, espalda, caderas izquierda y derecha) a un volumen de 10 ml/kg para un total de cuatro inyecciones cada uno.
NOTA: Es importante seleccionar cuidadosamente el lugar de inyección, ya que los diferentes sitios pueden tener efectos variables en la morbilidad y mortalidad de los ratones. Además, las inyecciones repetidas de MOG pueden provocar tolerancia inmunitaria, por lo que el equipo de investigación eligió un solo método de inyección para prevenir este posible problema. - Inyectar inmediatamente 500 ng/ml de toxina pertussis (TP) por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg después de la inyección de MOG.
NOTA: La TP aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) y facilita la infiltración de células T en el cerebro. - Después de 48 h, inyectar intraperitonealmente la solución de TP al mismo volumen.
7. Puntuación de déficit neurológico
- Evaluar y calificar diariamente a los ratones mediante una escala de valoración16 de 0 a 15 para valorar la incidencia y gravedad de la EAE en función de los siguientes déficits neurológicos:
Cola: 0 indica que no hay signos, 1 representa una cola medio paralizada y 2 indica una cola completamente paralizada.
Extremidades: 0 indica que no hay signos, 1 representa una marcha débil o alterada, 2 indica paresia y 3 representa una extremidad completamente paralizada. - Asigne a un animal tetrapléjico que tenga parálisis completa una puntuación de 12 y asigne a la mortalidad una puntuación de 15.
8. Tinción de hematoxilina-eosina (H&E)
- Tome el cerebro de ratón deshidratado e insértelo en parafina fundida. Deje que el bloque de parafina se enfríe y solidifique para su uso posterior.
NOTA: El bloque de parafina debe estar completamente seco y frío para evitar daños en los tejidos. - Corta el bloque de parafina cerebral de ratón en portaobjetos de 5 μm de grosor. Coloque la sección de cerebro de ratón de parafina en un portaobjetos de vidrio y séquelo en un horno a 60 °C durante 3 h.
- Sumerja los portaobjetos secuencialmente en la solución de xileno I durante 10 minutos, la solución de xileno II durante 10 minutos, el 100 % de alcohol I durante 3 minutos, el 100 % de alcohol II durante 3 minutos, el 95 % de alcohol durante 3 minutos, el 90 % de alcohol durante 3 minutos, el 80 % de alcohol durante 3 minutos, el 70 % de alcohol durante 3 minutos y el agua destilada durante 1 minuto.
9. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR)
- Después de perfundir a los ratones con PBS, retire la ChP de los ventrículos y extraiga el ARN con Trizol. Sintetiza el ADNc con el primer kit de síntesis de ADNc de hebras.
- Realice análisis de qPCR utilizando la premezcla Ex Taq SYBR-green y un sistema de PCR en tiempo real. Utilice los siguientes cebadores A2AR: adelante - GCCATCCCATTCGCCATCA; reverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
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Representative Results
Eliminación de A2AR específica de ChP mediante inyección ICV de AAV2/5-shRNA o CRE-TAT
El papel de A2AR en la ChP como un potente regulador de la información neuronal en la patogénesis de EAE sigue sin estar claro. La reducción de la expresión de A2AR específica de ChP podría arrojar luz sobre los efectos reguladores de A2AR sobre el sistema inmune central en EAE y otras inflamaciones del sistema nervioso. En este estudio se utilizó la inyección de CRE-TAT por ICV para disminuir la expresión de A 2A R en la ChP de ratonesA 2AR flox/flox. Para garantizar la especificidad de ChP, primero inyectamos CRE-TAT en los ventrículos laterales de ratones Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9). Las imágenes indican que la fluorescencia espontánea de tdTomato estaba restringida al tejido ChP (Figura 2). De manera similar, el estudio administró la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) mejorada con AAV2/5-CMV-CMV-CMV2AR-shRNA-CMV en ratones C57BL/6 y encontró que la fluorescencia de EGFP se limitaba a la capa de células epiteliales de la ChP y no infectaba las células parenquimatosas circundantes cerca de los ventrículos laterales (Figura 3).
Inducción EAE con MOG35-55
Para inducir EAE estable, los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con una emulsión compuesta por MOG35-55 y CFA, seguida de una inyección intraperitoneal de TP en los días 0 y 2 después de la inmunización (Figura 4). Se utilizó la Escala de Síntomas Clínicos para evaluar diariamente las puntuaciones de EAE, en función del estado de la cola y las extremidades. El inicio de la EAE se definió como el primer día con una puntuación EAE ≥1, mientras que la duración entre el inicio y el pico de las puntuaciones de EAE se denominó etapa progresiva.
La reducción de A2A Respecífica de ChP alivia la patología EAE
Para investigar la implicación de la señal A2AR en la patología EAE, el estudio empleó un knockdown A2AR específico de ChP. El estudio eliminó específicamente A2AR en el ChP utilizando la inyección ICV de CRE-TAT o AAV2/5-A2AR-shRNA. A las 2 semanas después del derribo, EAE fue inducida por la inmunización MOG35-55. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo control, los ratones con A2AR knockdown desarrollaron una patología EAE más leve, como lo demuestran las puntuaciones más bajas y una menor infiltración de células inmunitarias en la médula espinal (Figura 5A, B, E, F). Además, se seleccionaron aleatoriamente cinco ratones inducidos por EAE de cada grupo en el día 20 después de la inmunización con MOG35-55. Después de la perfusión con PBS, las ChP se aislaron para la extracción de ARN y qPCR. El análisis de qPCR mostró que los niveles de ARNm de A 2A R estaban obviamente disminuidos en los grupos AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) y CRE-TAT, en comparación con cada control (Figura 5C,D).
Figura 1: Localización anatómica del lugar de inyección del ventrículo lateral. (A) Un diagrama esquemático que muestre el punto de inyección del virus. (B) El lugar de inyección del ventrículo lateral se encuentra 0,58 mm por debajo del bregma y 1,1 mm lateral a la sutura sagital, como indica el punto rojo. (C) Una imagen que muestre el sitio de inyección del virus en un ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Localización de la fluorescencia de tdTomato en el ChP. (A,B) Imagen representativa de ratones Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato tratados con inyección ICV de CRETAT. A las 2 semanas después, la autofluorescencia de tdTomato se localizó específicamente en el tejido ChP (n = 3/grupo). (C,D) Las imágenes fusionadas de la autofluorescencia tdTomato y DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de ratones C57BL/6 tomadas 2 semanas después de la inyección de AAV2/5-scramble-EGFP o AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) Las imágenes representativas de ratones inyectados con AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/grupo). (C,D) Las imágenes representativas de ratones inyectados con AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inducción del modelo EAE. (A) En primer lugar, la emulsión de antígeno MOG se inyecta por vía subcutánea en cuatro lugares diferentes (cuello, espalda, caderas izquierda y derecha), que se indican con puntos rojos. (B) El TP se inyecta por vía intraperitoneal en el momento de la inmunización y se repite 2 días después. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La reducción específica de ChP de A 2AR alivió la patología EAE. (A) La reducción específica de ChP de A 2A R en ratones A2AR flox/flox, lograda mediante la inyección de CRE-TAT en ICV, condujo a una disminución de las puntuaciones clínicas de EAE (n = 6-7/grupo). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de RM de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. (B) La reducción específica de ChP de A2AR en ratones de tipo salvaje (WT), lograda con la inyección de AAV2/5-shRNA en ICV, disminuyó las puntuaciones clínicas de EAE (n = 7-8/grupo). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de RM de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. (C,D) Resultados del análisis de qPCR de los niveles de ARNm de A2AR en tejido ChP (n = 5/grupo). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareada. (E,F) Tinción de H&E. La infiltración atenuada de células inmunitarias en la médula espinal A2AR específica de ChP. La significación estadística se representa como ###p < 0,001, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La investigación presentó dos enfoques distintos para la eliminación dirigida de los genes ChP. El primer enfoque consistió en la inyección ICV de CRE-TAT, que contiene Cre recombinasa, en ratones A2AR flox/flox. El segundo abordaje consistió en la inyección de AAV2/5 portadora de ARNh de A2AR. Mediante la utilización de estas dos estrategias, el trabajo logró la eliminación selectiva de A 2A R dentro de la ChP y pudo demostrar los efectos protectores de la inhibición de la señalización deA 2AR en la ChP en la patología EAE. Cabe destacar que este protocolo incluye dos pasos cruciales. En primer lugar, la operación de localización estereotáxica es esencial, y una desviación significativa de las coordenadas sugeridas puede dar lugar a fallos aleatorios. En segundo lugar, el volumen del virus inyectado es crítico, ya que se ha descubierto que inyectar menos de 1 μL de virus (~6 x 1012) también tiene cierta probabilidad de fallo. Esto se debe posiblemente a la necesidad de una cantidad adecuada de partículas de virus para una infección suficiente.
El uso del sistema Cre/LoxP no permitió observar la distribución precisa de la recombinasa CRE-TAT en el cerebro después de la inyección de ICV. Como resultado, el estudio utilizó ratones Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato para rastrear la distribución de CRE-TAT utilizando la autofluorescencia de la proteína tdTomato. La fluorescencia de tdTomato se localizó exclusivamente en los tejidos de ChP 2 semanas después de la inyección de CRE-TAT por vía intracerebroventricular, lo que indica que la recombinasa fue absorbida principalmente por la ChP. A continuación, se administró CRE-TAT a ratones A 2A R flox/flox, y se observó una disminución en los niveles de ARNm A2AR en el tejido ChP. Esta estrategia de knockdown dirigida se utilizó para investigar el papel de la señalización de corticosteroides en la ChP en la mediación del estrés psicológico17. Alternativamente, la investigación utilizó AAV2/5 para administrar shRNA diseñado para dirigirse a los genes ChP. Estudios previos han evaluado la capacidad de infección de diferentes serotipos de AAVs y lentivirus en el tejido de ChP y encontraron que AAV2/5 y AAV2/8 fueron los más efectivos14. El estudio reveló que AAV2/5 era capaz de infectar la ChP específicamente sin causar infecciones obvias en otras regiones del cerebro. Estos dos métodos son menos laboriosos que las estrategias clásicas de knockout que requieren dos líneas transgénicas (líneas Cre y Flox)6,18. Una limitación de este estudio es la ausencia de un experimento de ganancia de función con sobreexpresión génica. Sin embargo, un posible enfoque para lograrlo sería clonar el ADNc completo y empaquetarlo en el virus AAV2/5, que se administraría a través de la infección por ICV. En un estudio previo, se encontró que la sobreexpresión de NKCC1 en la ChP usando AAV2/5 promueve el aclaramiento del LCR y reduce la ventriculomegalia in vivo9. Es importante tener en cuenta que tanto la estrategia AAV2/5 como la Cre/LoxP tienen su propia ventaja. La inyección de CRE-TAT en ratones transgénicos por ICV garantiza una alta eficiencia de eliminación, ya que el gen diana se elimina directamente del ADN de las células. Sin embargo, este método depende de la producción y reproducción de ratones floxados. Por otro lado, la inyección de AAV2/5 en ICV evita el largo proceso de cría de ratones transgénicos. Sin embargo, la eficiencia de derribo de este método depende en gran medida del rendimiento del shRNA diseñado. Por lo tanto, los investigadores pueden elegir un método adecuado en función de sus condiciones experimentales.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune que causa inflamación y desmielinización de la sustancia blanca en el SNC19. Para estudiar los mecanismos patológicos de la EM, los investigadores han utilizado un modelo EAE que simula los síntomas de la enfermedad, como la desmielinización y la infiltración inmunitaria. Este modelo se considera ideal para la comprensión de la EM. En 2009, se descubrió que las células inmunitarias se infiltran en el SNC a través de la ChP, que es una vía clave para la entrada de células inmunitarias en la patología de la EM. La "primera ola" de células inmunitarias entra en el LCR a través de la CHP, seguida de la "segunda ola", que entra en el parénquima cerebral a través de la BHE20. La "primera ola" de células inmunitarias promueve la inflamación y acelera la fuga de BBB, por lo que la inhibición de la infiltración inmunitaria en la CHP podría ser útil para la intervención temprana en la EM. Las quimiocinas y las moléculas de adhesión regulan la actividad de activación de la CHP, controlando la capacidad de los linfocitos para infiltrarse a través de ella21,22,23.
Estudios anteriores utilizaron tecnología farmacológica o de knockout de cuerpo entero (como anticuerpos neutralizantes) para investigar las moléculas de señalización en la CHP, pero estos métodos no definieron con precisión su función biológica en el proceso patológico de la EM. En un estudio reciente, los investigadores derribaron A 2A R, ubicado en el ChP de ratones A2AR flox/flox, y encontraron que las puntuaciones de EAE y la infiltración inmune se redujeron significativamente11. Este estudio confirma el papel de la señalización A2AR en la ChP durante la patología EAE y demuestra que los métodos de knockdown específicos de ChP son herramientas útiles para estudiar la función de ChP en patologías del SNC.
En conclusión, el protocolo de manipulación específico de ChP es una herramienta ideal para explorar la función biológica de la ChP implicada en enfermedades degenerativas del SNC, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la EM, etc.
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Disclosures
Los autores afirman que no tienen intereses financieros contrapuestos ni otras revelaciones que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 31800903, otorgada a W. Zheng) y del Proyecto de Ciencia y Tecnología de Wenzhou (Nº Y2020426, otorgado a Y. Y. Weng) para este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
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