Summary
Burada, diğer beyin bölgelerinde herhangi bir etkiden kaçınırken koroid pleksustaki gen ekspresyonlarını seçici olarak değiştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Koroid pleksus (ChP), hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında merkezi sinir sistemine (MSS) immün hücre infiltrasyonu için kritik bir geçit görevi görür. Son araştırmalar, ChP aktivitesinin düzenlenmesinin CNS bozukluklarına karşı koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerini etkilemeden ChP'nin biyolojik işlevini incelemek, hassas yapısı nedeniyle zordur. Bu çalışma, adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler) veya TAT dizisinden (CRE-TAT) oluşan siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) rekombinaz proteini kullanılarak ChP dokusunda gen yıkımı için yeni bir yöntem sunmaktadır. Sonuçlar, lateral ventriküle AAV veya CRE-TAT enjekte edildikten sonra, floresansın sadece ChP'de yoğunlaştığını göstermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, çalışma, RNA interferansı (RNAi) veya X-overP1 (Cre / LoxP) sistemlerinin Cre / lokusu kullanılarak ChP'deki adenozin A2A reseptörünü (A2AR) başarılı bir şekilde yıktı ve bu yıkımın deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) patolojisini hafifletebileceğini gösterdi. Bu teknik, ChP'nin CNS bozukluklarındaki rolü üzerine gelecekteki araştırmalar için önemli etkilere sahip olabilir.
Introduction
Koroid pleksusun (ChP) genellikle beyin omurilik sıvısı (BOS) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) salgılayarak beyin fonksiyonel homeostazının korunmasına yardımcı olduğu düşünülüyordu1,2. Son otuz yılda artan araştırmalar, CHP'nin merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu için farklı bir yolu temsil ettiğini ortaya koymuştur.
Tek katmanlı bir ChP epitelinden oluşan ChP'nin sıkı bağlantıları (TJ'ler), makromoleküllerin ve bağışıklık hücrelerinin beyne girmesini önleyerek immünolojik homeostazı korur3. Bununla birlikte, belirli patolojik koşullar altında, ChP dokusu, BOS ve kandaki tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP'ler) algılar ve bunlara yanıt verir, bu da anormal bağışıklık infiltrasyonuna ve beyin işlev bozukluğunayol açar 4,5. Kritik rolüne rağmen, ChP'nin küçük boyutu ve beyindeki benzersiz konumu, diğer beyin bölgelerini etkilemeden işlevini incelemeyi zorlaştırır. Bu nedenle, özellikle ChP'de gen ekspresyonunu manipüle etmek, işlevini anlamak için ideal bir yaklaşımdır.
Başlangıçta, ChP'de eksprese edilen genlere özgü promotörlerin kontrolü altında Cre'yi eksprese eden siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) transgenik hatları, floklanmış aday genlerleüreme yoluyla hedef genleri silmek için yaygın olarak kullanıldı 6,7,8. Örneğin, transkripsiyon faktörü Forkhead kutusu J1 (FoxJ1), yalnızca doğum öncesi fare beyninin7 ChP epitelinde eksprese edilir. Bu nedenle, FoxJ1-Cre çizgisi genellikle ChP 6,9'da bulunan genleri silmek için kullanıldı. Bununla birlikte, bu stratejinin başarısı büyük ölçüde destekleyicinin özgüllüğüne bağlıdır. FoxJ1'in beynin diğer bölümlerindeki ve periferik sistemdeki kirpikli epitel hücrelerinde de mevcut olması nedeniyle, FoxJ1 ekspresyon modelinin yeterince ayırt edici olmadığı yavaş yavaş keşfedildi7. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, floklanmış transgenik hatların ventriküllerine rekombinaz vermek için intraserebroventriküler (ICV) Cre rekombinaz enjeksiyonu yapıldı. Bu strateji, yalnızca ChP dokusunda tdTomato floresansının varlığı ile kanıtlandığı gibi yüksek özgüllük göstermiştir10,11. Bununla birlikte, bu yöntem hala floklanmış transgenik fare hatlarının mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bu sorunu çözmek için araştırmacılar, ChP'ye özgü yıkımı veya hedef genlerin aşırı ekspresyonunu elde etmek için adeno-ilişkili virüsün (AAV) ICV enjeksiyonunu kullandılar12,13. ChP enfeksiyonu için farklı AAV serotiplerinin kapsamlı bir değerlendirmesi, AAV2/5 ve AAV2/8'in diğer beyin bölgelerini enfekte etmemekle birlikte CHP'de güçlü enfeksiyon yetenekleri sergilediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, AAV2/8'in ventrikülleri çevreleyen ependimayı enfekte ettiği bulunurken, AAV2/5 grubunda enfeksiyon görülmedi14. Bu yöntem, floklanmış transgenik hayvanları edinme sınırlamalarının üstesinden gelme avantajına sahiptir.
Bu makale, iki yöntem kullanarak ChP'de gen yıkımı için adım adım bir protokolü açıklamaktadır: adenozin A2A reseptörünün (A 2A R) shRNA'sını taşıyan AAV2/5'in ICV'si ve A2AR'nin ChP'ye özgü yıkımını elde etmek için TAT dizisi (CRE-TAT) rekombinazından oluşan Cre rekombinaz proteini. Çalışma bulguları, CHP'de A2AR'nin yıkılmasının deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) hafifletebileceğini düşündürmektedir. Bu ayrıntılı protokol, ChP fonksiyon çalışmaları ve ChP'deki genlerin spesifik yıkımı için yararlı rehberlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunda belirtilen ve Wenzhou Tıp Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Hayvanlar
- 8-12 haftalık ve 20-22 g ağırlığındaki erkek C57BL/6 fareleri satın alın.
- Transgenik Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) fare serisini ve erkek A2AR flox/flox farelerini edinin.
- Fareleri rastgele iki gruba atayın ve 1 hafta boyunca standart 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında kafes başına en fazla beş fare olacak şekilde kafeslerde barındırın.
- Farelere yeterli yiyecek ve su sağlayın ve onları 25 °C'de sabit bir sıcaklıkta tutun.
2. AAV2/5-shRNA ile A 2A R'nin ChP'ye özgü yıkımı
- Her fareyi tartın ve değerleri not edin.
- Fareleri intraperitoneal olarak 60-80 mg/kg pentobarbital'e eşdeğer 6-8 mL/kg'lık bir dozda %1 pentobarbital sodyum ile uyuşturun ve fareyi sıcak tutmak için bir ısıtma yastığına yerleştirin.
NOT: Başarılı bir ameliyat sağlamak için farenin ağırlığına göre doğru dozda pentobarbital sodyum uygulamak çok önemlidir. Anestezi, mortaliteye neden olabileceğinden çok derin olmamalıdır, ancak işlem sırasında fare uyanabileceğinden ve potansiyel olarak virüs enjeksiyonunun etkinliğini etkileyebileceğinden çok sığ olmamalıdır. Uygun anestezi dozunu ayak parmağını sıkıştırarak kontrol edin ve farelerin yanıt vermediğinden emin olun. - Anestezi uygulanmış farelerin üst kıllarını kesmek için özel bir fare tıraş makinesi kullanın.
- Kurumasını önlemek için her iki göze de göz merhemi sürün ve beyni hareketsiz hale getirmek için fareleri stereotaksik bir aparata sabitleyin. Hayvanı steril bir örtü ile örtün.
- Postoperatif enfeksiyonu azaltmak için farelerin baş ve boyun derisini üç tur iyodofor dezenfektan ve% 75 alkol ile iyice sterilize edin. Daha sonra farelerin kafa derisine topikal olarak% 1 lidokain uygulayın ve kafatasını mikroskop altında tamamen ortaya çıkarmak için küçük bir kesi yapın.
NOT: Prosedür boyunca steril aletler kullanın. - İki adet 10 μL'lik şırınga hazırlayın: biri satın alınan AAV2/5-A2AR-shRNA (titre: 6.27 × 10 9 vg/μL) ve diğeri satın alınan AAV2/5-Scramble (titre: 6.21 × 109 vg/μL).
NOT: Şırıngayı kullanırken, ön ucun bir cam kılcal damara bağlanması gerekir ve cam kılcal damarın uzunluğu kontrol edilerek 10 μL'lik bir aralık elde edilebilir. - Bregma ve lambdayı bulmak için mikroskobu kullanın ve koordinat noktasını ayarlayın (AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20) 10 μL şırınga üzerinde (Şekil 1). Koordinat noktası, fare beyni stereotaksik atlas15'e dayanmaktadır.
- Ayarlanan koordinat noktasında kafatasında küçük bir delik açın.
NOT: Mikroskop altında, kafatasının yüzeyine karşı steril bir mikro matkap kullanılarak delme işlemi gerçekleştirilir. Sondajdan sonra, beyni kaplayan meninksler çıkarılarak ve altta yatan beyin parankimini açığa çıkararak, kan damarlarının yaralanması önlenir. Bu adım, cam kılcal damarın ucunun meninksler tarafından kırılmasını önler. Açılan deliğin çapı, iğne ucunun beyin dokusuna girmesine izin verecek kadar yeterli olmalıdır. - 2 μL AAV2/5-A2AR-shRNA virüsünü 100 nL/dk'lık sabit bir hızda lateral enjeksiyon yoluyla beyin ventrikülüne uygulayın. Geri çekmeden önce iğneyi 10 dakika yerinde tutun. Virüsün tek taraflı enjeksiyonla uygulandığını unutmayın.
- Yapıştırıcı hızlı bir şekilde uygulanmazsa iğneyi çıkardıktan sonra BOS ile durulanabilen virüs kaybını önlemek için tıbbi biyofibrin yapıştırıcı kullanarak yaralı cildi derhal kapatın. Ayrıca, virüs kaybına da neden olabileceğinden, BOS'u silmek için pamuklu çubuk kullanmayın.
- İyileşmeyi kolaylaştırmak için, vücut ısısını 37.0 ± 0.5 °C'de tutmak için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin ve farenin kafa derisine topikal olarak %1 lidokain uygulayın. EAE modelini indüklemeden önce farelerin 2 hafta iyileşmesine izin verin, çünkü bu süre AAV2 / 5-A 2A R-shRNA virüs ekspresyonu ve ardındanA 2AR yıkımı için gereklidir.
3. X-overP1 (Cre/LoxP) sisteminin Cre/lokusu ile A 2A R'nin ChP'ye özgü yıkımı
NOT: Aşağıdaki prosedürler daha önce açıklanan yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıntılı enjeksiyon yöntemleri için 2.1-2.11 adımlarına bakın.
- Deney grubu olarak bir Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato faresinin her bir lateral ventrikülüne 2 μL CRE-TAT rekombinaz ve kontrol grubu olarak 2 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin. Yukarıdakiyle aynı protokolü kullanarak (bölüm 2), kontrol grubu olarak 2 μL steril PBS ile birlikte A2A Rflox/ flox farelerinin lateral ventriküllerinin her birine 2 μL CRE-TAT rekombinaz enjekte edin.
- Donmuş doku kesitleri hazırlayın ve CRE-TAT rekombinaz enjeksiyonundan 2 hafta sonra nükleer boyama yapın. Daha fazla bilgi için 4.1-4.3 arasındaki adımlara bakın.
4. Farelerde transkardiyal perfüzyon
- Fareleri derinlemesine uyuşturmak için 60-80 mg / kg pentobarbital sodyum uygulayın. Anestezi düzlemini bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın ve 40 mL steril PBS solüsyonu ve ardından 20 mL% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin.
NOT: Başarılı perfüzyon karaciğerde beyaz bir renkle gösterilirken, perfüzyon sırasında genişlemiş akciğerlerin veya ağızdan PBS çıkışının varlığı prosedürün başarısız olduğunu gösterir. - Minimum protein bozulmasını sağlayarak fare beynini hızla çıkarın.
- Fare beynini gece boyunca %4 PFA/PBS'ye batırın, ardından 72 saat boyunca %30 sükroz PB çözeltisi ile değiştirin.
NOT: Beyin dokusunun aşırı dehidrasyonundan kaçınmak çok önemlidir, bu nedenle beyin sükroz PB çözeltisinde çok uzun süre bırakılmamalıdır.
5. Donmuş doku kesiti ve boyama
- Daha önce susuz kalmış fare beynini optimum kesme sıcaklığı (OCT) yapıştırıcısına gömün, gömülü beyni dondurun ve 20 μm kalınlığındaki koronal bölümleri kesmek için kayan bir mikrotom kullanın.
- Beyin bölümlerini cam slayta yerleştirin. Beyin bölümleri kuruduktan sonra, sonraki deneyler için -20 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
- Her cam slaytı bir çerçeve kasasına yerleştirin ve slaytı iyice durulamak için çerçeveyi PBS ile dolu bir kaba daldırın. Beyin slaytlarını PBS solüsyonu ile her seferinde 10 dakika boyunca üç kez nazikçe durulayın.
NOT: Beyin bölümlerinin cam kaydıraktan düşmesini önlemek için dikkatli olunmalıdır. - Beyin slaytlarını 4 dakika boyunca 6 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ile boyayın.
- Beyin slaytlarını PBS solüsyonu ile 5 dakika durulayın.
- Beyin bölümlerine bir damla antifade montaj ortamı uygulayın.
- Beyin bölümlerine bir lamel yerleştirin, lameli oje ile kapatın ve geleneksel bir floresan mikroskobu kullanarak bölümleri analiz edin.
6. EAE indüksiyonu
NOT: shRNA veya CRE-TAT rekombinaz enjeksiyonundan 2 hafta sonra EAE indüksiyonu gerçekleştirin11.
- 2.5 mg miyelin oligodendrosit glikoproteinini (MOG35-55) 2 mL PBS ile karıştırarak sulu bir çözelti oluşturun. M. tuberculosis'i (H37Ra) eksik Freunds adjuvanı (IFA) ile karıştırarak tam bir Freunds adjuvanı (CFA) yağ çözeltisi hazırlayın.
- Sulu ve yağ çözeltilerini 1:1 oranında karıştırın. Karışımı su içinde yağ haline getirmek için bir tee borusu kullanın.
NOT: Tee borusuna üç boru da denir. MOG35-55 ve CFA'yı tamamen karıştırmak için akan çözeltinin yönünü kontrol edebilen plastik bir tüptür. - Buz banyosu koşullarında EAE modeli için MOG antijen emülsiyonunu yapmak için yüksek hızlı bir homojenizatör kullanın.
- Fareleri, 60-80 mg / kg pentobarbital'e eşdeğer 6-8 mL / kg'lık bir dozajda% 1 pentobarbital sodyum ile intraperitoneal olarak uyuşturun.
- MOG antijen emülsiyonunu her biri toplam dört enjeksiyon için 10 mL / kg'lık bir hacimde dört farklı noktaya (boyun, sırt, sol ve sağ kalça) deri altından enjekte edin.
NOT: Farklı bölgelerin farelerin morbidite ve mortalitesi üzerinde farklı etkileri olabileceğinden, enjeksiyon bölgesini dikkatlice seçmek önemlidir. Ek olarak, tekrarlanan MOG enjeksiyonları bağışıklık toleransına yol açabilir, bu nedenle araştırma ekibi bu potansiyel sorunu önlemek için tek bir enjeksiyon yöntemi seçti. - MOG enjeksiyonundan hemen sonra 5 mg / kg'lık bir dozajda intraperitoneal olarak 500 ng / mL boğmaca toksini (PT) enjekte edin.
NOT: PT, kan-beyin bariyerinin (BBB) geçirgenliğini arttırır ve T hücrelerinin beyne infiltrasyonunu kolaylaştırır. - 48 saat sonra, PT solüsyonunu intraperitoneal olarak aynı hacimde enjekte edin.
7. Nörolojik defisit skoru
- Aşağıdaki nörolojik eksikliklere göre EAE insidansını ve şiddetini değerlendirmek için 0 ile 15 arasında değişen bir derecelendirme ölçeği16 kullanarak fareleri günlük olarak değerlendirin ve derecelendirin:
Kuyruk: 0 hiçbir belirti olmadığını, 1 yarı felçli bir kuyruğu ve 2 tamamen felçli bir kuyruğu gösterir.
Uzuvlar: 0 belirti olmadığını, 1 zayıf veya değişmiş bir yürüyüşü, 2 parezi ve 3 tamamen felçli bir uzvu temsil eder. - Tam felçli kuadriplejik bir hayvana 12 puan verin ve ölüm oranına 15 puan verin.
8. Hematoksilen-eozin (H & E) boyama
- Susuz kalmış fare beynini alın ve erimiş parafine gömün. Parafin bloğunun daha sonra kullanmak üzere soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.
NOT: Doku hasarını önlemek için parafin bloğu tamamen kuru ve soğuk olmalıdır. - Fare beyni parafin bloğunu 5 μm kalınlığında slaytlar halinde kesin. Parafin fare beyni bölümünü bir cam slayt üzerine yerleştirin ve 60 °C fırında 3 saat kurutun.
- Slaytları sırayla 10 dakika ksilen çözeltisi I, 10 dakika ksilen çözeltisi II, 3 dakika %100 alkol I, 3 dakika %100 alkol II, 3 dakika %95 alkol, 3 dakika %90 alkol, 3 dakika %80 alkol, 3 dakika %70 alkol ve 1 dakika damıtılmış suya batırın.
9. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi
- Fareleri PBS ile perfüze ettikten sonra, ChP'yi ventriküllerden çıkarın ve RNA'yı Trizol ile çıkarın. İlk Strand cDNA Sentez Kitini kullanarak cDNA'yı sentezleyin.
- Ex Taq SYBR-green premiksi ve gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanarak qPCR analizi gerçekleştirin. Aşağıdaki A2AR primerlerini kullanın: ileri - GCCATCCCATTCGCCATCA; ters - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AAV2 / 5-shRNA veya CRE-TAT'ın ICV enjeksiyonu ile ChP'ye özgü A2AR yıkımı
EAE patogenezinde nöral bilginin güçlü bir düzenleyicisi olarak CHP'deki A2AR'nin rolü belirsizliğini korumaktadır. ChP'ye özgü A 2A R ekspresyonunun yıkılması, EAE ve diğer sinir sistemi iltihaplanmalarında A2AR'nin merkezi bağışıklık sistemi üzerindeki düzenleyici etkilerine ışık tutabilir. Bu çalışmada, A 2A R flox/ flox farelerinin CHP'sindeA 2AR ekspresyonunu azaltmak için CRE-TAT'ın ICV enjeksiyonu kullanılmıştır. ChP özgüllüğünü sağlamak için önce Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) farelerinin lateral ventriküllerine CRE-TAT enjekte ettik. Görüntüler, spontan tdTomato floresansının ChP dokusu ile sınırlı olduğunu göstermektedir (Şekil 2). Benzer şekilde, çalışma C57BL / 6 farelerine AAV2 / 5-CMV-A2AR-shRNA-CMV ile geliştirilmiş yeşil floresan proteini (EGFP) uyguladı ve EGFP floresansının ChP'nin epitel hücre tabakası ile sınırlı olduğunu ve lateral ventriküllerin yakınındaki çevredeki parankimal hücreleri enfekte etmediğini buldu (Şekil 3).
MOG35-55 ile EAE indüksiyonu
Stabil EAE'yi indüklemek için, farelere deri altından MOG35-55 ve CFA'dan oluşan bir emülsiyon enjekte edildi, ardından bağışıklamadan sonraki 0. ve 2. günlerde intraperitoneal PT enjeksiyonu yapıldı (Şekil 4). Klinik Semptom Ölçeği, kuyruk ve uzuv durumuna göre EAE skorlarını günlük olarak değerlendirmek için kullanıldı. EAE'nin başlangıcı, EAE skoru ≥1 olan ilk gün olarak tanımlanırken, başlangıç ve pik EAE skorları arasındaki süre progresif evre olarak adlandırıldı.
ChP'ye özgü A2AR knockdown, EAE patolojisini hafifletir
A2AR sinyalinin EAE patolojisine katılımını araştırmak için, çalışmada ChP'ye özgü bir A2AR yıkımı kullanıldı. Çalışma, özellikle CRE-TAT veya AAV2 / 5-A2AR-shRNA'nın ICV enjeksiyonu kullanılarak ChP'deki A2AR'yi düşürdü. Knockdown'dan 2 hafta sonra, EAE MOG35-55 bağışıklaması ile indüklendi. Sonuçlar, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, A2AR yıkımı olan farelerin, daha düşük skorlar ve omurilikteki bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunun azalması ile kanıtlandığı gibi, daha hafif EAE patolojisi geliştirdiğini göstermiştir (Şekil 5A, B, E, F). Ek olarak, MOG35-55 aşılamasını takip eden 20. günde her gruptan EAE ile indüklenen beş fare rastgele seçildi. PBS ile perfüzyondan sonra, RNA ekstraksiyonu ve qPCR için ChP'ler izole edildi. qPCR analizi, AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) ve CRE-TAT gruplarında her bir kontrole kıyasla A2AR'nin mRNA seviyelerinin belirgin bir şekilde azaldığını gösterdi (Şekil 5C,D).
Şekil 1: Lateral ventrikül enjeksiyon bölgesinin anatomik lokalizasyonu. (A) Virüs enjeksiyon noktasını gösteren şematik bir diyagram. (B) Lateral ventrikülün enjeksiyon bölgesi, kırmızı nokta ile gösterildiği gibi, bregmanın 0.58 mm altında ve sagital sütürün 1.1 mm lateralinde bulunur. (C) Fareye virüs bulaşma bölgesini gösteren bir resim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ChP'de tdDomates floresansının lokalizasyonu . (A,B) Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdCRETAT'ın ICV enjeksiyonu ile tedavi edilen domates farelerinin temsili görüntüsü. 2 hafta sonra, tdTomato otofloresansı spesifik olarak ChP dokusuna lokalize edildi (n = 3 / grup). (C,D) tdTomato otofloresan ve DAPI'nin birleştirilmiş görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: AAV2/5-scramble-EGFP veya AAV2/5-shRNA-EGFP'nin ICV enjeksiyonundan 2 hafta sonra alınan C57BL/6 farelerinin temsili görüntüleri. (A,B) AAV2/5-scramble-EGFP enjekte edilen farelerin temsili görüntüleri (n = 3/grup). (C,D) AAV2 / 5-shRNA-EGFP (n = 3 / grup) enjekte edilen farelerin temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EAE modelinin indüksiyonu. (A) İlk olarak, MOG antijen emülsiyonu deri altından kırmızı noktalarla gösterilen dört farklı yere (boyun, sırt, sol ve sağ kalça) enjekte edilir. (B) PT, aşılama sırasında intraperitoneal olarak enjekte edilir ve 2 gün sonra tekrarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: A 2A R'nin ChP'ye özgü yıkımı EAE patolojisini hafifletti. (A) CRE-TAT'ın ICV enjeksiyonu ile elde edilen2AR flox /flox farelerinde A2AR'nin ChP'ye özgü yıkımı, EAE klinik skorlarının azalmasına neden oldu (n = 6-7 / grup). İstatistiksel analiz, iki yönlü RM ANOVA ve ardından Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. (B) AAV2 / 5-shRNA'nın ICV enjeksiyonu ile elde edilen vahşi tip (WT) farelerde A2AR'nin ChP'ye özgü yıkımı, EAE klinik skorlarını düşürdü (n = 7-8 / grup). İstatistiksel analiz, iki yönlü RM ANOVA ve ardından Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. (C,D) ChP dokusunda A2AR mRNA düzeylerinin qPCR analizinin sonuçları (n = 5/grup). İstatistiksel analiz, eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. (E,F) H & E boyama. ChP'ye özgü A2AR knockdown, omuriliğe zayıflatılmış bağışıklık hücresi infiltrasyonu. İstatistiksel anlamlılık ###p < 0.001, **p < 0.01 ve ***p < 0.001 olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Araştırma, ChP genlerinin hedeflenen yıkımı için iki farklı yaklaşım sundu. İlk yaklaşım, Cre rekombinaz içeren CRE-TAT'ın A2AR flox/flox farelerine ICV enjeksiyonunu içeriyordu. İkinci yaklaşım, A2AR'nin shRNA'sını taşıyan AAV2/5'in ICV enjeksiyonunu gerektiriyordu. Bu iki stratejiyi kullanarak, çalışma ChP içinde A 2A R'nin seçici olarak yıkılmasını sağladı ve ChP'de A2AR sinyalini inhibe etmenin EAE patolojisi üzerindeki koruyucuetkilerini gösterebildi. Bu protokolün iki önemli adım içerdiğini unutmayın. İlk olarak, stereotaksik lokalizasyon işlemi esastır ve önerilen koordinatlardan önemli sapmalar rastgele arızalara neden olabilir. İkinci olarak, enjekte edilen virüsün hacmi kritiktir, çünkü 1 μL'den daha az virüs enjekte etmenin (~ 6 x 1012) de belirli bir başarısızlık şansına sahip olduğu bulunmuştur. Bu muhtemelen yeterli enfeksiyon için yeterli miktarda virüs partikülüne ihtiyaç duyulmasından kaynaklanmaktadır.
Cre / LoxP sisteminin kullanılması, ICV enjeksiyonunu takiben beyindeki CRE-TAT rekombinazının kesin dağılımının gözlemlenmesine izin vermedi. Sonuç olarak, çalışma, tdTomato proteininin otofloresansını kullanarak CRE-TAT dağılımını izlemek için Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato farelerini kullandı. tdTomato floresansı, CRE-TAT'ın intraserebroventriküler olarak enjekte edilmesinden 2 hafta sonra sadece ChP dokularında bulundu, bu da rekombinazın öncelikle ChP tarafından emildiğini gösterdi. Daha sonra, A 2A R flox/ flox farelerine CRE-TAT uygulandı ve ChP dokusunda A2AR mRNA seviyelerinde bir azalma gözlendi. Bu hedefli yıkım stratejisi, psikolojik strese aracılık etmede ChP'de kortikosteroid sinyalinin rolünü araştırmak için kullanıldı17. Alternatif olarak, araştırma, ChP genlerini hedeflemek için tasarlanmış shRNA'yı iletmek için AAV2/5'i kullandı. Önceki çalışmalar, ChP dokusunda farklı AAV ve lentivirüs serotiplerinin enfeksiyon yeteneğini değerlendirmiş ve AAV2/5 ve AAV2/8'in en etkili olduğunu bulmuşlardır14. Çalışma, AAV2/5'in diğer beyin bölgelerinde belirgin enfeksiyonlara neden olmadan özellikle CHP'yi enfekte edebildiğini ortaya koydu. Bu iki yöntem, iki transgenik hat (Cre ve Flox hatları) gerektiren klasik nakavt stratejilerinden daha az zahmetlidir6,18. Bu çalışmanın bir sınırlaması, gen aşırı ekspresyonu ile bir fonksiyon kazanımı deneyinin olmamasıdır. Bununla birlikte, bunu başarmak için olası bir yaklaşım, tam cDNA'yı klonlamak ve ICV enfeksiyonu yoluyla uygulanacak olan AAV2/5 virüsüne paketlemek olacaktır. Önceki bir çalışmada, AAV2/5 kullanılarak CHP'de NKCC1'in aşırı ekspresyonunun BOS klerensini desteklediği ve in vivo9'da ventrikülomegaliyi azalttığı bulunmuştur. AAV2/5 veya Cre/LoxP stratejisinin kendi avantajlarına sahip olduğuna dikkat etmek önemlidir. CRE-TAT'ın transgenik farelere ICV enjeksiyonu, hedef gen doğrudan hücrelerin DNA'sından silindiği için yüksek yıkım verimliliği sağlar. Bununla birlikte, bu yöntem floxlanmış farelerin üretimine ve üremesine bağlıdır. Öte yandan, AAV2/5'in ICV enjeksiyonu, transgenik farelerin üremesinin zaman alıcı sürecini önler. Bununla birlikte, bu yöntemin nakavt verimliliği büyük ölçüde tasarlanan shRNA'nın performansına bağlıdır. Bu nedenle, araştırmacılar deney koşullarına göre uygun bir yöntem seçebilirler.
Multipl skleroz (MS), CNS19'da beyaz cevherin iltihaplanmasına ve demiyelinizasyonuna neden olan otoimmün bir hastalıktır. MS'in patolojik mekanizmalarını incelemek için araştırmacılar, demiyelinizasyon ve immün infiltrasyon gibi hastalığın semptomlarını simüle eden bir EAE modeli kullandılar. Bu model MS'i anlamak için ideal olarak kabul edilir. 2009 yılında, bağışıklık hücrelerinin, MS patolojisinde bağışıklık hücresi girişi için önemli bir yol olan ChP yoluyla CNS'ye sızdığı keşfedildi. Bağışıklık hücrelerinin "ilk dalgası" BOS'a ChP yoluyla girer, ardından BBB20 yoluyla beyin parankimine giren "ikinci dalga" gelir. Bağışıklık hücrelerinin "ilk dalgası" iltihabı teşvik eder ve BBB sızıntısını hızlandırır, bu nedenle ChP'de immün infiltrasyonun inhibe edilmesi MS'e erken müdahale için yararlı olabilir. Kemokinler ve adezyon molekülleri, ChP'nin geçit aktivitesini düzenleyerek lenfositlerin içeri sızma yeteneğini kontrol eder21,22,23.
Önceki çalışmalar, ChP'deki sinyal moleküllerini araştırmak için tüm vücut nakavt veya farmakolojik teknolojiyi (nötralize edici antikorlar gibi) kullandı, ancak bu yöntemler MS patolojik sürecindeki biyolojik işlevlerini doğru bir şekilde tanımlamadı. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, araştırmacılar A2AR flox/ flox farelerinin CHP'sinde bulunan A2AR'yi yıktılar ve EAE skorlarının ve bağışıklık infiltrasyonunun önemli ölçüde azaldığını buldular11. Bu çalışma, EAE patolojisi sırasında ChP'de A2AR sinyalinin rolünü doğrulamakta ve ChP'ye özgü knockdown yöntemlerinin SSS patolojilerinde ChP fonksiyonunu incelemek için yararlı araçlar olduğunu göstermektedir.
Sonuç olarak, ChP'ye özgü manipülasyon protokolü, Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, MS vb. gibi CNS'deki dejeneratif hastalıklarda yer alan ChP'nin biyolojik işlevini araştırmak için ideal bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, beyan etmek için rekabet eden mali çıkarları veya başka açıklamaları olmadığını belirtmektedir.
Acknowledgments
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (31800903 No'lu Hibe, W. Zheng'e verildi) ve Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi'nin (No. Y2020426, Y. Y. Weng'e verildi) bu çalışma için desteğini minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P.
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
