Summary
Dette arbejde præsenterer en dyremodel af endotel-til-mesenkymal overgangsinduceret fibrose, som det ses i medfødte hjertefejl såsom kritisk aortastenose eller hypoplastisk venstre hjertesyndrom, som muliggør detaljeret histologisk vævsevaluering, identifikation af regulatoriske signalveje og test af behandlingsmuligheder.
Abstract
Endokardiefibroelastose (EFE), defineret ved akkumulering af subendokardievæv, har stor indflydelse på udviklingen af venstre ventrikel (LV) og udelukker patienter med medfødt kritisk aortastenose og hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) fra helbredende anatomisk biventrikulær kirurgisk reparation. Kirurgisk resektion er i øjeblikket den eneste tilgængelige terapeutiske mulighed, men EFE gentager sig ofte, nogle gange med et endnu mere infiltrativt vækstmønster i det tilstødende myokardium.
For bedre at forstå de underliggende mekanismer i EFE og for at udforske terapeutiske strategier blev der udviklet en dyremodel, der var egnet til præklinisk testning. Dyremodellen tager højde for, at EFE er en sygdom i det umodne hjerte og er forbundet med strømningsforstyrrelser, som understøttet af kliniske observationer. Således er den heterotopiske hjertetransplantation af neonatal rottedonorhjerter grundlaget for denne model.
Et neonatal rottehjerte transplanteres i en ung rottes mave og forbindes med modtagerens infrarenale aorta og ringere vena cava. Mens perfusion af kranspulsårerne bevarer donorhjertets levedygtighed, inducerer strømningsstagnation inden for LV EFE-vækst i det meget umodne hjerte. Den underliggende mekanisme for EFE-dannelse er overgangen af endokardiale endotelceller til mesenkymale celler (EndMT), som er en velbeskrevet mekanisme for tidlig embryonal udvikling af ventiler og septa, men også den førende årsag til fibrose ved hjertesvigt. EFE-dannelse kan observeres makroskopisk inden for dage efter transplantation. Transabdominal ekkokardiografi bruges til at overvåge transplantatets levedygtighed, kontraktilitet og anastomosernes patency. Efter eutanasi høstes EFE-vævet, og det viser de samme histopatologiske egenskaber som humant EFE-væv fra HLHS-patienter.
Denne in vivo-model giver mulighed for at studere mekanismerne for EFE-udvikling i hjertet og teste behandlingsmuligheder for at forhindre denne patologiske vævsdannelse og giver mulighed for en mere generaliseret undersøgelse af EndMT-induceret fibrose.
Introduction
Endokardial fibroelastose (EFE), defineret ved akkumulering af kollagen og elastiske fibre i det subendokardiale væv, præsenterer som et perlemors- eller uigennemsigtigt fortykket endokardium; EFE gennemgår mest aktiv vækst i fosterperioden og den tidlige barndom1. I en obduktionsundersøgelse var 70% af tilfældene med hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) forbundet med tilstedeværelsen af EFE2.
Celler, der udtrykker markører for fibroblaster, er den vigtigste cellepopulation i EFE, men disse celler udtrykker også samtidig endokardiale endotelmarkører, hvilket er en indikation af oprindelsen af disse EFE-celler. Vores gruppe har tidligere fastslået, at den underliggende mekanisme for EFE-dannelse involverer en fænotypisk ændring af endokardiale endotelceller til fibroblaster gennem endotel-til-mesenkymal overgang (EndMT)3. EndMT kan detekteres ved anvendelse af immunhistokemisk dobbeltfarvning til endotelmarkører såsom klynge af differentiering (CD) 31 eller vaskulær endotelial (VE)-cadherin (CD144) og fibroblastmarkører (f.eks. alfa-glat muskelactin, α-SMA). Desuden har vi også tidligere etableret TGF-ß-vejens regulerende rolle i denne proces med aktivering af transkriptionsfaktorerne SLUG, SNAIL og TWIST3.
EndMT er en fysiologisk proces, der opstår under embryonal hjerteudvikling og fører til dannelse af septa og ventiler fra endokardiepuder4, men det forårsager også organfibrose ved hjertesvigt, nyrefibrose eller kræft og spiller en nøglerolle i vaskulær aterosklerose 5,6,7,8. EndMT i hjertefibrose reguleres hovedsageligt gennem TGF-β-vejen, da vi og andre har rapporteret 3,9. Forskellige stimuli er blevet beskrevet for at inducere EndMT: inflammation 10, hypoxi 11, mekaniske ændringer 12 og strømningsforstyrrelser, herunder ændringer i den intracavitære blodgennemstrømning 13, og EndMT kan også være en konsekvens af en genetisk sygdom 14.
Denne dyremodel blev udviklet ved hjælp af nøglekomponenterne i hjerte-EFE-udvikling, som er umodenhed og ændringer i den intracavitær blodgennemstrømning, specifikt strømningsstagnation. Umodenhed blev opfyldt ved at bruge neonatal rottehjerter som donorer, da neonatal rotter vides at være udviklingsmæssigt umodne umiddelbart efter fødslen. Heterotopisk hjertetransplantation tilbød tilvejebringelse af intracavitær strømningsbegrænsning15.
Fra et klinisk synspunkt giver denne dyremodel mulighed for bedre at undersøge virkningen af EndMT på den voksende venstre ventrikel (LV). Vækstbegrænsningen af foster- og neonatalhjertet gennem EndMT-induceret EFE-dannelse16 udelukker patienter med obstruktioner af venstre ventrikulær udstrømning (LVOTO) såsom medfødt kritisk aortastenose og hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) fra helbredende anatomisk biventrikulær kirurgisk reparation17. Denne dyremodel letter undersøgelsen af de cellulære mekanismer og regulering af vævsdannelse gennem EndMT og giver mulighed for test af farmakologiske behandlingsmuligheder 3,18.
Transabdominal ekkokardiografi bruges til at overvåge transplantatets levedygtighed, kontraktilitet og anastomosernes patency. Efter eutanasi kan EFE-dannelse observeres makroskopisk inden for 3 dage efter transplantation. EFE-væv viser de samme histopatologiske egenskaber som humant EFE-væv fra patienter med LVOTO.
Derfor kan denne dyremodel, selvom den er udviklet til pædiatrisk brug i spektret af HLHS, anvendes, når man studerer forskellige sygdomme baseret på den molekylære mekanisme i EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Det Nationale Forskningsråd. 2011. Vejledning i pasning og brug af forsøgsdyr: ottende udgave. Dyreprotokollerne blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Boston Children's Hospital.
Før operationen dampautoklaveres alle kirurgiske instrumenter, og modificeret Krebs-Henseleit-buffer med en slutkoncentration på 22 mmol / L KCl fremstilles som en kardioplegisk opløsning (tabel 1). Opløsningen filtreres og opbevares ved 4 °C natten over. Et kirurgisk mikroskop (12,5x) er påkrævet til den heterotopiske neonatal rotte hjertetransplantationsprocedure.
1. Forberedelse og anæstesi
- Brug Lewis-hanrotter med en vægt på ca. 150 g (5-6 uger) som modtagere.
- For at starte, barber generøst rottens mave med en barbermaskine.
- Anbring rotten i et isoflurankammer, og tænd for iltstrømmen ved 2 l/min med 2% isofluran, indtil dyret er ordentligt bedøvet, men stadig spontant trækker vejret. Der injiceres 45 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin intraperitonealt (IP) samt 300 E/kg heparin. Bekræft korrekt bedøvelse med en tåklemmetest.
BEMÆRK: Overvåg omhyggeligt den spontane vejrtrækning og puls gennem palpering af brystet for at sikre en stabil hæmodynamisk status gennem hele processen. - Ved intubation skal du placere rotten på en skrå hylde (figur 1), fastgøre fortænderne med en snor og placere hovedet vendt mod kirurgen.
- Placer lyset på ydersiden af halsen på stemmebåndets område, tag fat i tungen med to fingre, og skub den let opad og til venstre for at give optimalt syn til intubation. Brug en 18 G, 2 i kanyle til en 100-150 g rotte. Fastgør det intratrakeale rør med tape.
BEMÆRK: Kirurgiske loups med 3,5x forstørrelse anbefales til intubation. - Tilslut intubationskanylen til smådyrsventilatoren, og juster indstillingerne i henhold til producentens anvisninger baseret på dyrets størrelse.
BEMÆRK: Brug følgende indstillinger for en 150 g rotte: lydstyrketilstand; respirationsfrekvens, 55/min; tidevandsvolumen, 1,3 ml 50 % I/E-forhold, men dette kan justeres passende efter behov. Sørg for korrekt bilateral og lige brystbevægelse, og administrer isofluran kontinuerligt ved 0,5%-2% gennem ventilatoren. - Placer rotten på en varmepude (for at opretholde normal kropstemperatur) i liggende stilling med halen vendt mod kirurgen. Steriliser maven tre gange med betadinopløsning og 70% ethanol skiftevis. Administrer øjenglidecreme, og dæk rotten med en steril kirurgisk gardin, så maven efterlades afdækket.
2. Kirurgisk forberedelse og heterotopisk transplantation af det neonatale donorhjerte hos modtagerrotten
- Udfør en midterlinje laparotomi ved hjælp af en 15 bladet skalpel til hudsnittet, og brug en saks til at åbne den forreste abdominalvæg efterfulgt af stump eksponering af retroperitoneal abdominal aorta og ringere vena cava (IVC) med bomuldsspidsapplikatorer.
- Mobiliser tarmene (inklusive den nedadgående tyktarm), og placer dem mod højre øvre kvadrant. Dæk tarmene med varm saltvands-gennemblødt gasbind. Brug retraktorer for at sikre optimal eksponering af IVC og abdominal aorta.
- Udfør stump dissektion af infrarenal IVC og abdominal aorta op mod bifurcationen. Ligate alle de infrarenale forgreningsarterier og vener (fx ringere mesenterisk arterie og lymfeknudearterier) med en 10-0 nylonsutur.
BEMÆRK: Der er stor variation i anatomien af disse sidegrene. Overvåg aortas puls og puls visuelt, når ingen anden hæmodynamisk overvågning er tilgængelig. Vurder den korrekte dybde af anæstesi hvert 15. minut gennem en tåklemmetest. Isoflurankoncentrationen justeres i overensstemmelse hermed. - Når donorhjertet er høstet fra en neonatal rotte, skal det udskårne hjerte leveres under sterile forhold i et kirurgisk bassin indeholdende Krebs-Henseleit buffer til det kirurgiske felt. Skyl donorhjertet intermitterende med iskold kardioplegisk opløsning.
BEMÆRK: Når en anden kirurg er tilgængelig, skal hjertet forberedes på samme tid, da en anden kirurg reducerer modtagerdyrets samlede anæstesitid og donorhjertets iskæmitid. Når en anden kirurg ikke er tilgængelig, skal du dække modtagerens mave med varmt saltvand og overvåge dyret under høstproceduren. - Påfør fire små atraumatiske vaskulære klemmer på de distale og proksimale segmenter af infrarenal aorta og IVC. Hvis det er nødvendigt, skal du midlertidigt udelukke et ugunstigt nyrekar med en 7-0 silkesutur og frigive suturen efter proceduren. Placer en 10-0 nylonsutur lodret på den forreste væg af aorta for at lette aortomien. Udfør en aortotomi med to små vandrette snit (kileformet) med mikrosaks ved let at trække suturen op.
BEMÆRK: For at fjerne blodpropper anbefales skylning af aortaklumen med hepariniseret saltvand. - Placer donorhjertet på venstre side (fra dyrets perspektiv) af aorta og fastgør modtagerens infrarenale aorta og donorens stigende aorta ende-til-side klokken 12 og 6 positioner af aortotomi med suturer. Fortsæt med den tredje og fjerde suturer klokken 3 og 9 positionerne, vend forsigtigt hjertet over til højre side af aorta efter den tredje sutur. Afslut arteriel anastomose ved at tilføje en til to suturer til hvert mellemrum.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at undgå at røre enten donorens stigende aorta eller modtagerens abdominale aorta med tang, når anastomosen oprettes for at undgå vævsskade. - Drej rotten mod uret med hovedet vendt mod kirurgens venstre hånd. Flyt donorens aorta til venstre side af abdominal aorta for at give optimalt syn på IVC.
- Udfør en venotomi på IVC, lidt proksimal til aortaanastomose, ved hjælp af et 11-blad til punktering og mikrosaks til tilstrækkelig størrelsesjustering i henhold til diameteren på donorens lungestamme. Skyl igen intracavallumen med hepariniseret saltvand.
- Start med den venøse anastomose mellem modtagerens IVC og donorens lungestamme, hvilket bedst opnås ved at placere afbrudte 11-0 nylonsuturer på fartøjets bagvæg, startende ved klokken 12 og 6 (relateret til IVC), og placer derefter en kontinuerlig 11-0 nylonsutur på forvæggen (fra klokken 6 mod klokken 12).
- Dæk anastomoserne med små strimler af en absorberbar gelatinesvamp, og fjern de mikrovaskulære klemmer, der starter distalt. Brug en applikator til bomuldsspids til let at komprimere svampene for at opnå optimal hæmostase.
- Overhold transplantatets koronarbeholdere, der fyldes på tidspunktet for frigivelsen af de distale mikrovaskulære klemmer, og sørg for, at donorhjertet begynder at slå straks, når den proksimale klemme frigives.
BEMÆRK: Transplantatets levedygtighed kan scores fra 0 til 4 intraoperativt i henhold til en modificeret Stanford-score19 for at bekræfte tilstrækkelig transplantatfunktion. - Placer tarmene tilbage i maven ved at sikre ikke at forvrænge arteriel og venøs anastomose.
- Administrer meloxicam (1 mg / kg) og ethiqa XR (0,65 mg / kg) subkutant, mens dyret er fuldt bedøvet for at fastslå postoperativ analgesi. Luk derefter abdominalvæggen med en kontinuerlig 5-0 absorberbar vicrylsutur, før du lukker huden med en 6-0 absorberbar vicrylsutur intrakutant.
BEMÆRK: Vejledning vedrørende almindelige fejl og fejlfinding er præsenteret i tabel 2.
3. Høst af neonatal donorhjerte
- Den neonatale donorrotte anbringes i et kammer insuffleret med isofluran (2 %) til sedation. Administrer ketamin (75 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) samt heparin (300 U / kg) intraperitonealt.
- Bekræft dybden af anæstesi ved tåklemme, og placer rotten i liggende stilling med halen vendt mod dig. Steriliser hele thorax og abdominalvæggen med betadin og 70% ethanol tre gange alternativt. Dæk rotten med en steril kirurgisk drapering.
- Brug et 12,5x kirurgisk mikroskop til at fjerne hele den forreste thoraxvæg ved at starte med et vandret snit ved hjælp af en 15-bladet skalpel ved xyphoiden efterfulgt af lodrette snit sideværts op til axillen på begge sider med en saks. Den forreste thoraxvæg kan derefter fjernes ved at fortsætte med et andet vandret snit lige under halsen.
- Disseker IVC, højre og venstre overlegen vena cavae og lungekar med en saks, og omkreds og ligeret derefter alle karrene med en 7-0 silkesutur. Administrer 3 ml iskold Krebs-Henseleit-opløsning med højt kaliumindhold i højre atrium ved at punktere IVC med en 30 G nål og skubbe membranen let ned med pincet.
- Klip IVC, SVC'er, lungekar og aorta med en saks. Transekter lungearterierne så vidt muligt og aorta distal til brachiocephalic bagagerummet for at sikre korrekt længde ved hjælp af en 11 bladet skalpel.
- Adskil lungestammen og stigende aorta med en mikrosaks, og skyl hjertet med iskold kardioplegisk opløsning ved hjælp af en 3 ml sprøjte.
4. Nyttiggørelse af recipienten og transplantatovervågning
- Efter operationen skal du give rotten rigelig tid til at vågne op, hvilket normalt sker i et 15 minutters tidsvindue, og lad den komme sig på en varmepude.
BEMÆRK: Ingen antibiotika er nødvendige på grund af den meget lave risiko for infektion og for ikke at kompromittere forsøgsmodellen, og der anvendes ingen begrænsning for mad eller vand. - Efter transplantation skal transplantatfunktionen overvåges ved palpering af det transplanterede hjerte dagligt, men overvej, at dette undertiden kan være vanskeligt at vurdere på grund af tarmoverlejring.
BEMÆRK: Abdominal ekkokardiografi kan mere præcist måle transplantatets levedygtighed. Til ekkokardiografi bedøves rotten lidt med isofluran (1-2%) inhaleret gennem en næsekegle og placeres på en varmepude. Ekkokardiografi udføres normalt på postoperativ dag (POD) 1, POD 7 og POD 14. For at muliggøre vurdering af puls og kontraktilitet kan man let få visninger med lang akse og kort akse (figur 2A, B). For at evaluere anastomoserne skal du bruge Doppler-ekkokardiografi (figur 3A) og bekræfte dannelsen af EFE-væv som set som et ekko-lyst endokardielag i venstre ventrikelhulrum (figur 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Graft levedygtighed og slå
I dette arbejde blev transplantatets levedygtighed visuelt vurderet, efter at alle klemmerne var fjernet, og en omtrentlig reperfusionstid på 10-15 min blev tilladt med en åben mave til observation af transplantatet. Det samme scoringssystem til objektivt at verificere transplantatets levedygtighed blev brugt til visuel vurdering ved operationens afslutning og til ekkokardiografi på POD 1, POD 7 og POD 14.
0 = ingen organfunktion; 1 = (hvile) organfunktion, kun minimal sammentrækning; 2 = svag eller delvis organfunktion 3 = kontraktil hastighed eller intensitet reduceret, men homogen organfunktion; 4 = optimal atrium- og ventrikelkontraktion (120-160 slag/min). En score på 3 eller 4 blev bedømt som en succes. Palpatorisk evaluering af abdominal donortransplantat blev brugt til at overvåge transplantatets levedygtighed mellem tidspunkterne for ekkokardiografisk vurdering.
Succesrate for dødelighed og transplantatlevedygtighed
Proceduren blev introduceret til et nyt kirurgisk team på studiecentret mellem oktober 2022 og december 2022, og 19 neonatal heterotopisk rottehjertetransplantationer blev udført på studiecentret i denne periode. Den umiddelbare operative overlevelsesrate var 79%, og succesraten for transplantatlevedygtighed (der viste et levedygtigt, bankende donorhjerte) var 84%. Procedureegenskaberne er vist i tabel 3.
Blandt de 12 overlevende dyr krævede 2 eutanasi før 2 ugers studiets endepunkt, 1 på grund af en ileus (n = 1), og den anden på grund af smerter, der ikke blev lindret med smertestillende medicin (n = 1), og 2 blev aflivet ved design 1 uge efter operationen.
Hos tre rotter steg den anvendte modificerede Stanford-score fra 3 til 4 mellem øjeblikkelig postoperativ visuel klassificering og ekkokardiografisk evaluering på POD 1. Blandt de otte overlevende rotter ved 14-dages endepunktet var de modificerede Stanford-scorer ved ekkokardiografi fire for syv dyr og tre for et dyr. Den mest almindelige dødsårsag i denne serie var hæmodynamisk svigt på grund af overdreven blodtab som følge af det meget umodne hjerte og dermed skrøbelige donorskibe til anastomose eller lange anæstesitider.
Histologisk vurdering af EFE-væv
Efter CO2 eutanasi af modtagerrotten blev der udført en re-laparotomi under steril forberedelse. Donortransplantatet blev udskåret og straks anbragt i en fysiologisk saltopløsning på is til videre behandling. En vandret skive blev resekteret på midten af ventrikelniveauet i højre og venstre ventrikel, anbragt i optimal skæretemperatur (OCT) indlejringsmedium og frosset i flydende nitrogen (figur 4A). Alt andet væv blev snapfrosset med flydende nitrogen og opbevaret i en -80 °C fryser til yderligere analyse. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 4B-D).
Immunohistokemisk farvning som guldstandard til identifikation af EndMT blev udført under anvendelse af 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blå), VE-Cadherin som endotelmarkør (rød) og α-SMA som fibroblastmarkør (grøn). Fosforylerede SMAD-proteiner og transkriptionsfaktoren SLUG/SNAIL blev også farvet i EFE-vævet (figur 5A-E)3,20.
Figur 1: Skrå hylde til intubation. Rotten placeres på ryggen, med fortænderne sikret med en snor og hovedet vendt mod kirurgen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ekkokardiografisk langaksebillede af LV . (A) Indfødt rottehjerte, der indikerer normal fyldning under diastol. (B) Donortransplantat med strømningsstagnation inden for LV. Formindsket volumenbelastning under diastol. Forkortelser: LV = venstre ventrikel; MV = mitralventil; LVOT = venstre ventrikulær udstrømningskanal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Anastomoser og EFE evaluering. (A) Ekkokardiografisk farve Doppler-undersøgelse, der indikerer patentarteriel (rød pil) og venøs (blå pil) anastomoser. (B,C): Ekkolys endokardieoverflade i LV-hulrummet, der indikerer EFE (hvide pile). Forkortelser: LV = venstre ventrikel; EFE = endokardial fibroelastose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Makroskopisk og mikroskopisk vævsevaluering . (A) Midventrikulært tværsnit gennem LV og RV. De hvide pile peger mod EFE-vævet. (B) Hematoxylin-eosin, (C) Massons trichrome (MTS) og (D) Elastin van Gieson (EVG) farvning. Den store forstørrelse indikerer, at EFE-vævet (sorte pile) indeholder store mængder organiseret kollagen (blå i MTS) og elastinfibre (sort i EVG). Forkortelser: LV = venstre ventrikel; RV = højre ventrikel; EFE = endokardial fibroelastose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af histologiske og immunhistologiske billeder. (A) Hæmatoxylin-eosinfarvning. (B-E) Immunohistokemisk farvning; EFE-væv dobbeltfarvet for (B,C) VE-Cadherin og α-SMA, (D) CD31 og phospho-SMAD2/SMAD3 (colokaliseret med kernerne farvet med DAPI i blåt) og (E) CD31 og SLUG/SNAIL (colokaliseret med kernerne farvet med DAPI i blåt), hvilket indikerer EndMT, som vist med de hvide pile. Forkortelser: LV = venstre ventrikel; EFE = endokardial fibroelastose; EndMT = endotel-til-mesenkymal overgang. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 1 liter steriliseret, destilleret vand | |
| NaCl | 118 mmol/L |
| KCl | 22 mmol/l |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| MgSO4 | 1,2 mmol/l |
| NaHCO3 | 25 mmol/L |
| Glukose | 11 mmol/l |
| CaCl2 | 2,5 mmol/l |
Tabel 1: Sammensætning af den modificerede Krebs-Henseleit-buffer. Højkalium (22 mmol / l KCl) kardioplegisk opløsning fremstilles, filtreres og opbevares ved 4 ° C natten over.
| Almindelige fejl og fejlfinding | ||
| Graft begynder ikke at slå / koronararterier fyldes ikke efter frigivelse af klemmerne | Kontroller for trombosedannelse ved arteriel anastomose | |
| Kontroller for iskæmitid (= samlet anholdelsestid) (bør ikke overstige 100 minutter) | ||
| Lang vækningstid eller rotte vågner ikke op efter operationen | Overvåg pulsstyrke og frekvens under operationen og reducer isofluranindånding, hvis hæmodynamikken er svag | |
| Umiddelbare postoperative livid eller nekrotiske tarme er mistænkelige for reduceret intraoperativ hæmodynamik, ofte på grund af lang anæstesitid | ||
| Svag hæmodynamik lige efter laparotomi | Juster isofluranflowet til anæstesi | |
| Evaluer intubation og korrekt brystbevægelse: ensidig intubation, pneumothorax, blokeret endotracheal lumen er almindelige fejl i begyndelsen. | ||
| Rotten vågner, men dør i løbet af de første 24 timer | Omfattende blodtab under operationen | |
| Hvis der findes øget mængde blod ved obduktion i maven, skyldes det højst sandsynligt svigt i anastomosen | ||
Tabel 2: Almindelige fejl og fejlfinding. Grundig overvågning og reevaluering af mislykkede procedurer er afgørende for at opnå en høj overlevelsesrate i denne model.
| Modtagerens rottevægt i gram, median [IQR] | 150 [50] |
| Donoralder i dage, median [IQR] | 3 [1] |
| Donorvægt i gram, median [IQR] | 9 [2] |
| Graft iskæmi tid i minutter, median [IQR] | 100 [25] |
| Postoperativ succesrate, n | 16/19 (=84%) |
Tabel 3: Procedurekarakteristika. Valg af modtager og donor, graft iskæmi tid og overlevelsesrate. Forkortelse: IQR = interkvartilt område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne dyremodel for heterotopisk transplantation af et neonatal donorrottehjerte i modtagerens underliv skaber mulighed for at studere EndMT-afledt fibrose gennem detaljeret histologisk vævsevaluering, identificere regulatoriske signalveje og teste behandlingsmuligheder. Da EndMT er den underliggende mekanisme for fibrotiske sygdomme i hjertet, har denne model stor værdi inden for pædiatrisk hjertekirurgi og videre. I denne model kan mange faktorer påvirke resultatet af proceduren negativt. Således er korrekt håndtering af det meget skrøbelige væv på grund af donorhjertets umodenhed, korrekt dyrehåndtering under anæstesi og mikrokirurgiske færdigheder på højt niveau grundlæggende krav til succesen med denne model. En optimal teknisk opsætning, herunder et kirurgisk mikroskop, smådyrsventilator og mikrokirurgiske instrumenter, bør anvendes, når disse eksperimenter udføres. Selvom det ikke er vigtigt, kan grundlæggende overvågning af hjertefrekvensen eller kropstemperaturen være gavnlig, især for uerfarne kirurger, for at overvåge hæmodynamikken og dybden af anæstesi.
Vigtige kirurgiske aspekter at huske på omfatter umodenheden af de neonatale donorhjerter, hvilket gør vævet meget skrøbeligt og efterlader den stigende aorta og lungestammen sårbar over for tårer. Derfor bør enhver håndtering udføres med stor omhu. På grund af de små skibe, der anvendes til anastomose, anbefales det at udføre arteriel anastomose med afbrudte sting og intermitterende skylning af anastomosestedet med hepariniseret saltvand, hvilket hjælper med at undgå dannelse af trombose. Udvælgelse af passende alderen neonatal rotter er nødvendig for at overvinde problemet med at bruge hjerter, der er for umodne og derfor meget modtagelige for anastomosebrud. På den anden side kan EndMT efter en vis alder på ca. 7 dage ikke længere vises reproducerbart i denne dyremodel15.
EndMT er blevet identificeret som den centrale mekanisme for forskellige former for hjertefibrose og åreforkalkning, men forskningen er blevet hæmmet på grund af mangel på in vivo-modeller 8. De vigtigste udviklinger inden for EndMT-forskning er begrænset til cellekulturmodeller, som har iboende begrænsninger 3,8,9. Desuden er undersøgelser af endokardiale endotelceller endnu mere begrænsede. Som et alternativ anvendes koronararterieendotelceller ofte som erstatning, da de er rapporteret at stamme delvist fra endokardieceller21. Derfor kan denne dyremodel ikke kun bruges til hjertefibrose, men til at studere vigtige patomekanismer for flowinduceret EndMT i aterosklerose. For medfødt hjertesygdom har vi vist evnen til at reproducere overgangen fra sundt endokardium til EFE-væv gennem EndMT i vores rottemodel med EFE, der strukturelt ligner humant EFE-væv. Der er en vis kontrovers vedrørende den cellulære oprindelse af mesenkymale celler i EFE-vævet. Clark et al.22 rapporterede, at epikardieceller bidrager til EFE, men vores data viste, at størstedelen af EFE-væv stammer fra endokardiale endotelceller, der gennemgår EndMT3. Eksperimenter på enkeltcelleniveau er i øjeblikket i gang for at fastslå den cellulære oprindelse af EFE-væv.
Gennem denne in vivo-model kan de regulatoriske veje for EndMT undersøges. En ubalance, specifikt en stigning i TGF-ß-vejen og nedsat knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, har vist sig at spille en vigtig rolle i endokardieceller, der udtrykker transkriptionsfaktorer, der regulerer EndMT. Alternativt er Jagged/NOTCH-signalering og Wnt/ß-Catenin også rapporteret at inducere EndMT 3,23. TGF-ß-vejen inducerer aktiveringen af transkriptionsfaktorer som SLUG, SNAIL og TWIST via SMAD-proteiner og regulerer derved EndMT20,24. I denne dyremodel har vi været i stand til at rekapitulere disse mekanismer, som er blevet bekræftet ved immunohistokemisk farvning.
De stimulerende faktorer for EndMT-induceret fibrose i denne dyremodel er umodenhed og flowstagnation, mens andre modeller er designet til at inducere EndMT gennem genetiske modifikationer, hypertension eller diætbegrænsninger 9,25. Sammenlignet med andre arter er neonatale rotter meget umodne ved fødslen, og derfor er de særligt modtagelige for at gennemgå EndMT.
Vi og andre har brugt mus til bedre at studere oprindelsen af EFE via transgen slægtssporing, men flere begrænsninger skal diskuteres 3,22. For det første er dødeligheden på grund af modellens kompleksitet højere hos mus sammenlignet med rotter, og præsentationen af EFE er mere heterogen; Derfor er RAT-modellen mere pålidelig og reproducerbar. Ekkokardiografiske målinger er afgørende for at vurdere transplantatfunktionen i hele undersøgelsesperioden, og vi har vist, at med disse målinger samt vurdering af anastomosernes pulsatilitet og patency kan graftfunktion og kontraktilitet også studeres. Med mere erfaring kunne endnu mere avancerede analyser af det transplanterede hjerte, såsom stammeanalyse af LV, udføres i rottemodeller. Det er i øjeblikket uklart, om den samme patofysiologiske tilstand kan induceres hos andre større dyr end gnavere, og dette kræver yderligere undersøgelse.
Afslutningsvis efterligner denne pædiatriske dyremodel den menneskelige sygdom i EndMT og kan være nyttig til at bestemme reguleringen af EndMT og studere farmakologiske indgreb for at hæmme denne patologiske proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) og Single Ventricle Expansion Fund (til I.F.) og et Marietta Blau-stipendium fra OeAD-GmbH fra midler fra det østrigske forbundsministerium for uddannelse, videnskab og forskning BMBWFC (til G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
