Summary
이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.
Abstract
심내막하 조직 축적으로 정의되는 심내막 섬유탄성증(EFE)은 좌심실(LV)의 발달에 큰 영향을 미치며 선천성 중증 대동맥 협착증 및 저형성 좌심 증후군(HLHS) 환자는 근치적 해부학적 양심실 수술 수리를 받지 못합니다. 외과적 절제는 현재 사용 가능한 유일한 치료 옵션이지만 EFE는 종종 재발하며 때로는 인접한 심근에 훨씬 더 침윤적인 성장 패턴이 있습니다.
EFE의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하고 치료 전략을 탐색하기 위해 전임상 시험에 적합한 동물 모델이 개발되었습니다. 동물 모델은 EFE가 미성숙한 심장의 질병이며 임상 관찰에 의해 뒷받침되는 흐름 장애와 관련이 있음을 고려합니다. 따라서 신생아 쥐 기증자 심장의 이종 심장 이식이 이 모델의 기초입니다.
신생아 쥐의 심장을 청소년 쥐의 복부에 이식하고 수혜자의 대동맥 및 하대정맥에 연결합니다. 관상 동맥의 관류는 기증자 심장의 생존 능력을 보존하는 반면, LV 내의 흐름 정체는 매우 미성숙한 심장에서 EFE 성장을 유도합니다. EFE 형성의 근본적인 메커니즘은 심내막 내피 세포가 중간엽 세포(EndMT)로 전환되는 것인데, 이는 판막과 격막의 초기 배아 발달에 대한 잘 설명된 메커니즘이지만 심부전에서 섬유증의 주요 원인이기도 합니다. EFE 형성은 이식 후 며칠 이내에 거시적으로 관찰 할 수 있습니다. 경복부 심장 초음파는 이식편 생존력, 수축성 및 문합부의 개통성을 모니터링하는 데 사용됩니다. 안락사 후 EFE 조직을 채취하고 HLHS 환자의 인간 EFE 조직과 동일한 조직 병리학적 특성을 보여줍니다.
이 생체 내 모델을 통해 심장에서 EFE 발달 메커니즘을 연구하고 이러한 병리학적 조직 형성을 방지하기 위한 치료 옵션을 테스트할 수 있으며 EndMT 유도 섬유증에 대한 보다 일반화된 검사의 기회를 제공합니다.
Introduction
심내막하 조직에 콜라겐과 탄성 섬유가 축적되어 정의되는 심내막 섬유탄성증(EFE)은 진주 또는 불투명한 두꺼운 심내막으로 나타납니다. EFE는 태아와 유아기 초기에 가장 활발한 성장을 겪는다1. 부검 연구에서 저형성 좌심 증후군(HLHS) 사례의 70%가 EFE2의 존재와 관련이 있었습니다.
섬유아세포에 대한 마커를 발현하는 세포는 EFE의 주요 세포 집단이지만, 이러한 세포는 또한 이러한 EFE 세포의 기원을 나타내는 심내막 내피 마커를 동시에 발현합니다. 우리 그룹은 이전에 EFE 형성의 기본 메커니즘이 내피에서 중간엽으로의 전이(EndMT)를 통해 심내피 세포에서 섬유아세포로의 표현형 변화를 포함한다는 것을 확인했습니다3. EndMT는 분화 클러스터(CD) 31 또는 혈관 내피(VE)-cadherin(CD144) 및 섬유아세포 마커(예: 알파-평활근 액틴, α-SMA)와 같은 내피 마커에 대한 면역조직화학적 이중 염색을 사용하여 검출할 수 있습니다. 또한, 우리는 이전에 전사 인자 SLUG, SNAIL 및 TWIST3의 활성화와 함께 이 과정에서 TGF-ß 경로의 조절 역할을 확립했습니다.
EndMT는 심장 배아 발달 과정에서 발생하는 생리적 과정으로 심내막 쿠션(endocardial cushion)에서 중격(septa)과 판막(valve)의 형성을 유도하지만4, 심부전, 신장 섬유증 또는 암에서 장기 섬유화를 일으키기도 하며 혈관 죽상동맥경화증(vascular atherosclerosis)에서 중요한 역할을 한다 5,6,7,8. 심장 섬유증의 EndMT는 주로 TGF-β 경로를 통해 조절되며, 이는 당사와 다른 사람들이 3,9를 보고한 바와 같습니다. EndMT를 유도하기 위해 염증10, 저산소증11, 기계적 변화12, 강내 혈류의 변화13를 포함한 유동 장애 등 다양한 자극이 기술되어 있으며, EndMT는 유전 질환14의 결과일 수도 있다.
이 동물 모델은 심장 EFE 발달의 핵심 구성 요소를 사용하여 개발되었으며, 이는 미성숙과 강내 혈류의 변화, 특히 흐름 정체입니다. 신생아 쥐는 출생 직후 발달적으로 미성숙한 것으로 알려져 있기 때문에 신생아 쥐의 심장을 기증자로 사용함으로써 미성숙이 충족되었습니다. 이종성 심장 이식은 강내 혈류 제한을 제공했다15.
임상적 관점에서 이 동물 모델을 사용하면 성장하는 좌심실(LV)에 대한 EndMT의 영향을 더 잘 조사할 수 있습니다. EndMT 유도 EFE 형성16을 통해 태아 및 신생아 심장에 부과된 성장 제한은 선천성 중증 대동맥 협착증 및 저형성 좌심 증후군(HLHS)과 같은 좌심실 유출로 폐쇄(LVOTO) 환자를 근치적 해부학적 양심실 수술 수리에서 배제한다17. 이 동물 모델은 EndMT를 통해 세포 메커니즘 및 조직 형성 조절에 대한 연구를 용이하게 하고 약리학적 치료 옵션을 테스트할 수 있습니다 3,18.
경복부 심장 초음파는 이식편 생존력, 수축성 및 문합부의 개통성을 모니터링하는 데 사용됩니다. 안락사 후 EFE 형성은 이식 후 3 일 이내에 거시적으로 관찰 할 수 있습니다. EFE 조직은 LVOTO 환자의 인간 EFE 조직과 동일한 조직 병리학적 특성을 보여줍니다.
따라서 이 동물 모델은 HLHS 스펙트럼에서 소아용으로 개발되었지만 EndMT의 분자 메커니즘을 기반으로 다양한 질병을 연구할 때 적용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 국가연구위원회의 규정에 따라 진행되었습니다. 2011. 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드: 8판. 동물 프로토콜은 Boston Children's Hospital의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인되었습니다.
수술 전에 모든 수술 기구를 증기 고압멸균하고 최종 농도가 22mmol/L KCl인 변형된 Krebs-Henseleit 완충액을 심마비 용액으로 준비합니다(표 1). 용액은 필터 멸균 처리되어 4°C에서 하룻밤 동안 보관됩니다. 이종 신생아 쥐 심장 이식 절차에는 수술용 현미경(12.5x)이 필요합니다.
1. 준비 및 마취
- 체중이 약 150g(생후 5-6주령)인 수컷/암컷 루이스 쥐를 수혜자로 사용합니다.
- 시작하려면 면도기로 쥐의 복부를 넉넉하게 면도하십시오.
- 쥐를 이소플루란 챔버에 넣고 동물이 적절하게 진정되지만 여전히 자발적으로 숨을 쉴 때까지 2% 이소플루란으로 2L/분의 산소 흐름을 켭니다. 45mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진을 복강내(IP)로 주사하고 300U/kg 헤파린을 주사합니다. 발가락 꼬집 테스트로 적절한 마취를 확인합니다.
알림: 흉부 촉진을 통해 자발적 호흡과 심박수를 주의 깊게 모니터링하여 전체 과정에서 안정적인 혈류역학적 상태를 보장합니다. - 삽관을 위해 쥐를 비스듬한 선반에 놓고 (그림 1) 끈으로 앞니를 고정하고 머리가 외과 의사를 향하도록 놓습니다.
- 목 바깥쪽의 빛을 성대 부위에 대고 두 손가락으로 혀를 잡고 위쪽과 왼쪽으로 약간 밀어 삽관을 위한 최적의 시야를 제공합니다. 18-2g의 쥐에 100G, 150인치 캐뉼라를 사용하십시오. 테이프로 기관 내 튜브를 고정합니다.
참고: 삽관에는 3.5배 배율의 수술용 루프가 권장됩니다. - 삽관 캐뉼라를 작은 동물 인공호흡기에 연결하고 동물 크기에 따라 제조업체의 지침에 따라 설정을 조정합니다.
알림: 150g 쥐에 대해 다음 설정을 사용하십시오. 볼륨 모드; 호흡수, 55/분; 일회 호흡량, 1.3mL 50% I/E 비율이지만 필요에 따라 적절하게 조정할 수 있습니다. 적절한 양측 및 균등한 흉부 움직임을 보장하고 인공호흡기를 통해 0.5%–2%로 이소플루란을 지속적으로 투여합니다. - 꼬리가 외과 의사를 향하도록 앙와위 자세로 가열 패드(정상 체온을 유지하기 위해)에 쥐를 놓습니다. 베타딘 용액과 에탄올 70%를 번갈아 가며 복부를 3회 살균합니다. 눈 윤활제를 바르고 멸균 수술용 드레이프로 쥐를 덮고 복부는 덮지 않은 상태로 둡니다.
2. 수혜자 쥐에서 신생아 기증자 심장의 수술 준비 및 이종 이식
- 피부 절개를 위해 15날 메스를 사용하여 정중선 개복술을 시행하고 가위를 사용하여 전방 복벽을 연 다음 면 팁 어플리케이터로 후복막 복부 대동맥과 하대정맥(IVC)을 둔하게 노출합니다.
- 창자(하행 결장 포함)를 동원하고 오른쪽 상부 사분면을 향해 놓습니다. 따뜻한 식염수를 적신 거즈로 장을 덮으십시오. IVC와 복부 대동맥의 최적 노출을 보장하기 위해 견인기를 사용하십시오.
- 분기점을 향해 infarenal IVC와 복부 대동맥을 둔하게 절제합니다. 모든 내장동맥과 정맥(예: 하장간막 동맥 및 림프절 동맥)을 10-0 나일론 봉합사로 결찰합니다.
참고: 이러한 곁가지의 해부학적 구조에는 큰 차이가 있습니다. 다른 혈류역학적 모니터링을 사용할 수 없는 경우 대동맥의 맥박과 심박수를 시각적으로 모니터링합니다. 발가락 꼬집 테스트를 통해 15분마다 적절한 마취 깊이를 평가합니다. 그에 따라 이소플루란 농도를 조정하십시오. - 신생아 쥐에서 기증자의 심장을 채취한 후, 절제된 심장을 무균 상태로 크렙스-헨셀레이트 완충액이 들어 있는 수술용 대야에 넣어 수술 현장으로 전달합니다. 얼음처럼 차가운 심정지 용액으로 기증자의 심장을 간헐적으로 세척합니다.
참고: 두 번째 외과의가 있는 경우 두 번째 외과의가 수혜 동물의 총 마취 시간과 기증자 심장의 허혈 시간을 줄이기 때문에 심장을 동시에 준비해야 합니다. 두 번째 외과 의사가 없는 경우, 따뜻한 식염수로 수혜자의 복부를 덮고 채취 과정에서 동물을 관찰합니다. - 4개의 작은 비외상성 혈관 클램프를 극간 대동맥 및 IVC의 원위 및 근위 분절에 적용합니다. 필요한 경우 7-0 실크 봉합사로 불리한 신장을 일시적으로 막고 시술 후 봉합사를 해제합니다. 10-0 나일론 봉합사를 대동맥 전벽에 수직으로 놓아 대동맥 절개술을 용이하게 합니다. 봉합사를 약간 위로 당겨 미세 가위로 두 개의 작은 수평 절단(쐐기 모양)으로 대동맥 절개술을 수행합니다.
알림: 혈전을 제거하려면 헤파린화 식염수로 대동맥 내강을 씻어내는 것이 좋습니다. - 기증자의 심장을 대동맥의 왼쪽(동물의 관점에서)에 놓고 수혜자의 대동맥과 기증자의 상행 대동맥을 대동맥 절개술의 12시 및 6시 방향에 봉합사로 고정합니다. 3시와 9시 방향에서 세 번째와 네 번째 봉합을 계속하고, 세 번째 봉합 후 심장을 대동맥 오른쪽으로 부드럽게 뒤집습니다. 모든 틈새에 1-2개의 봉합사를 추가하여 동맥 문합을 완료합니다.
알림: 조직 손상을 방지하기 위해 문합을 할 때 기증자의 상행 대동맥 또는 수혜자의 복부 대동맥을 겸자로 만지지 않도록 주의해야 합니다. - 머리가 외과의의 왼손을 향하도록 쥐를 시계 반대 방향으로 돌립니다. 기증자의 대동맥을 복부 대동맥의 왼쪽으로 이동하여 IVC를 최적으로 볼 수 있도록 합니다.
- 대동맥 문합에 약간 근접한 IVC에서 정맥 절제술을 수행하며, 천자용 11개의 날과 기증자의 폐 몸통의 직경에 따라 적절한 크기 조정을 위한 미세 가위를 사용합니다. 다시 말하지만, 헤파린화 식염수로 intracaval 루멘을 씻어냅니다.
- 수혜자의 IVC와 기증자의 폐 몸통 사이의 정맥 문합으로 시작하여 12시 방향과 6시 방향(IVC 관련)에서 시작하여 혈관 뒤쪽 벽에 중단된 11-0 나일론 봉합사를 배치하는 것이 가장 좋습니다.
- 흡수성 젤라틴 스폰지의 작은 스트립으로 문합부를 덮고 미세혈관 cl을 제거합니다.amp말단에서 시작합니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 스폰지를 가볍게 압축하여 최적의 지혈을 얻습니다.
- 원위 미세혈관 클램프가 해제될 때 이식편의 관상동맥 혈관이 채워지는 것을 관찰하고 근위 클램프가 해제될 때 기증자의 심장이 즉시 뛰기 시작하는지 확인합니다.
참고: 이식편의 생존력은 적절한 이식편 기능을 확인하기 위해 수정된 Stanford 점수19 에 따라 수술 중 0에서 4까지 점수를 매길 수 있습니다. - 동맥 및 정맥 문합이 왜곡되지 않도록 하여 장을 복부에 다시 놓습니다.
- 수술 후 진통을 확인하기 위해 동물을 완전히 마취한 상태에서 meloxicam(1mg/kg)과 ethiqa XR(0.65mg/kg)을 피하로 투여합니다. 그런 다음 연속 5-0 흡수성 vicryl 봉합사로 복벽을 닫은 후 6-0 흡수성 vicryl 봉합사로 피부를 피내 봉합합니다.
참고: 일반적인 오류 및 문제 해결에 대한 지침은 표 2에 나와 있습니다.
3. 신생아 기증자 심장 적출
- 진정을 위해 신생아 기증자 쥐를 이소플루란(2%)이 주입된 챔버에 넣습니다. 케타민(75mg/kg)과 자일라진(5mg/kg), 헤파린(300U/kg)을 복강내로 투여합니다.
- 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인하고 꼬리가 당신을 향하도록 쥐를 앙와위 자세로 놓습니다. 흉곽과 복벽 전체를 베타딘과 70% 에탄올로 번갈아 세 번 소독합니다. 멸균 수술용 드레이프로 쥐를 덮습니다.
- 12.5x 수술용 현미경을 사용하여 15날 메스를 사용하여 xyphoid를 수평으로 절개한 후 가위로 양쪽 겨드랑이까지 수직으로 절개하여 전방 흉벽 전체를 제거합니다. 그런 다음 목 바로 아래에 또 다른 수평 절개를 계속하여 전방 흉벽을 제거할 수 있습니다.
- IVC, 좌우 상대정맥, 폐혈관을 가위로 절개한 후 7-0 실크 봉합사로 모든 혈관을 둘러싸고 결찰합니다. 30G 바늘로 IVC를 뚫고 집게로 다이어프램을 약간 눌러 얼음처럼 차가운 고칼륨 변성 Krebs-Henseleit 용액 3mL를 오른쪽 심방에 투여합니다.
- IVC, SVC, 폐혈관 및 대동맥을 가위로 자릅니다. 11날 메스를 사용하여 적절한 길이를 보장하기 위해 가능한 한 폐동맥을 가로지르고 상완두부 몸통 원위부에 대동맥을 횡단합니다.
- 마이크로가위로 폐동맥과 상행 대동맥을 분리하고 3mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 심정지 용액으로 심장을 씻어냅니다.
4. 수혜자 회복 및 이식편 모니터링
- 수술 후 쥐가 깨어날 수 있는 충분한 시간(보통 15분 간격)을 주고 온열 패드에서 회복되도록 합니다.
참고: 감염 위험이 매우 낮고 실험 모델을 손상시키지 않기 위해 항생제가 필요하지 않으며 음식이나 물에 대한 제한이 적용되지 않습니다. - 이식 후 매일 이식된 심장을 촉진하여 이식 기능을 모니터링하되, 장 중첩으로 인해 평가하기 어려울 수 있음을 고려하십시오.
참고: 복부 심장 초음파는 이식편 생존율을 보다 정확하게 측정할 수 있습니다. 심장 초음파 검사의 경우 콧방울을 통해 흡입한 이소플루란(1-2%)으로 쥐를 약간 진정시키고 가열 패드에 놓습니다. 심장 초음파는 일반적으로 수술 후 (POD) 1, POD 7 및 POD 14에 수행됩니다. 심박수와 수축도를 평가하기 위해 장축 및 단축 보기를 쉽게 얻을 수 있습니다(그림 2A, B). 문합을 평가하려면 도플러 심초음파(그림 3A)를 사용하고 좌심실강 내에서 에코-브라이트 심내막층으로 보이는 EFE 조직의 형성을 확인합니다(그림 3B, C).
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Representative Results
접목 생존력과 박동
이 작업에서는 모든 클램프를 제거한 후 이식편 생존력을 육안으로 평가하고 이식편을 관찰하기 위해 복부를 개방한 상태에서 대략 10-15분의 재관류 시간을 허용했습니다. 이식편 생존력을 객관적으로 검증하기 위한 동일한 채점 시스템이 수술 종료 시 육안 평가와 POD 1, POD 7 및 POD 14의 심장 초음파에 사용되었습니다.
0 = 장기 기능 없음; 1 = (휴식) 장기 기능, 최소한의 수축만; 2 = 약하거나 부분적인 장기 기능; 3 = 수축률 또는 강도는 감소했지만 균질한 장기 기능; 4 = 최적의 심방 및 심실 수축(120-160회/분). 3점 또는 4점은 성공으로 평가되었습니다. 복부 기증자 이식편의 촉진 평가는 심장 초음파 평가의 시점 사이의 이식편 생존력을 모니터링하는 데 사용되었습니다.
사망률 및 이식 생존 성공률
이 시술은 2022년 10월부터 2022년 12월까지 연구센터의 새로운 수술팀에 도입되었으며, 이 기간 동안 연구센터에서 19건의 신생아 이종성 쥐 심장 이식이 수행되었습니다. 즉시수술 생존율은 79%였고, 이식 생존 성공률(기증자의 심장이 박동하는 생존 가능)은 84%였다. 절차 특성은 표 3에 나와 있습니다.
생존한 12마리 중 2마리는 2주간의 연구 종점 이전에 안락사가 필요했고, 1마리는 장폐색증(n=1), 다른 1마리는 진통제로 완화되지 않은 통증(n=1)으로 안락사가 필요했으며, 2마리는 수술 1주일 후 설계에 따라 안락사되었다.
3마리의 쥐에서 적용된 수정된 스탠포드 점수는 수술 직후 시력 평가와 POD 1의 심장 초음파 평가 사이에 3에서 4로 증가했습니다. 14일 동안 생존한 쥐 8마리 중 심장초음파검사에서 수정된 스탠포드 점수는 7마리에 대해 4점, 1마리에 대해 3점이었다. 이 시리즈에서 가장 흔한 사망 원인은 매우 미성숙한 심장으로 인한 과도한 출혈로 인한 혈역학적 부전으로, 따라서 문합 또는 긴 마취 시간을 위한 취약한 기증 혈관이었습니다.
EFE 조직의 조직학적 평가
수혜 쥐의CO2 안락사 후, 멸균 준비 하에 재개복술을 수행하였다. 기증자 이식편을 절제하고 추가 처리를 위해 즉시 얼음 위의 생리식염수에 넣었습니다. 우심실 및 좌심실의 중심실 수준에서 수평 절편을 절제하고, 최적 절삭 온도(OCT) 매립 매체에 배치하고, 액체 질소에 동결했습니다(그림 4A). 다른 모든 조직은 액체 질소로 급속 냉동하고 추가 분석을 위해 -80°C 냉동고에 보관했습니다. 이미지는 도립 현미경을 사용하여 획득했습니다(그림 4B-D).
EndMT를 식별하기 위한 황금 표준인 면역조직화학적 염색은 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(파란색), VE-Cadherin을 내피 마커(빨간색), α-SMA를 섬유아세포 마커(녹색)로 사용하여 수행되었습니다. 인산화된 SMAD 단백질과 전사 인자 SLUG/SNAIL도 EFE 조직에서 염색되었습니다(그림 5A-E)3,20.
그림 1: 삽관을 위한 비스듬한 선반. 쥐는 등을 대고 앞니는 끈으로 고정하고 머리는 외과 의사를 향하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LV의 심장 초음파 장축 보기 . (A) 이완기 동안 정상적인 충전을 나타내는 천연 쥐의 심장. (B) LV 내에서 흐름 정체가 있는 기증자 이식편. 이완기 동안 부피 부하 감소. 약어: LV = 좌심실; MV = 승모판막; LVOT = 좌심실 유출로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 문합 및 EFE 평가. (A) 특허 동맥(빨간색 화살표) 및 정맥(파란색 화살표) 문합을 나타내는 심초음파 컬러 도플러 연구. (B,C): EFE(흰색 화살표)를 나타내는 LV 캐비티 내의 에코 밝은 심내막 표면. 약어: LV = 좌심실; EFE = 심내막 섬유탄성증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 거시적 및 미시적 조직 평가. (A) LV 및 RV를 통한 심실 중간 단면. 흰색 화살표는 EFE 조직을 가리킵니다. (B) 헤마톡실린-에오신, (C) 마손의 삼색(MTS) 및 (D) 엘라스틴 반 기슨(EVG) 염색. 큰 배율은 EFE 조직 (검은 색 화살표)이 조직 된 콜라겐 (MTS의 파란색)과 엘라스틴 섬유 (EVG의 검은 색)를 다량 함유하고 있음을 나타냅니다. 약어: LV = 좌심실; RV = 우심실; EFE = 심내막 섬유탄성증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 조직학적 이미지와 면역조직학적 이미지의 비교. (A) 헤마톡실린-에오신 염색. (B-E) 면역조직화학적 염색; 흰색 화살표로 표시된 것처럼 EndMT를 나타내는 (B,C) VE-Cadherin 및 α-SMA, (D) CD31 및 phospho-SMAD2/SMAD3(파란색의 DAPI로 염색된 핵과 공동 국소화됨) 및 (E) CD31 및 SLUG/SNAIL(파란색의 DAPI로 염색된 핵과 공동 국소화)에 대해 이중 염색된 EFE 조직. 약어: LV = 좌심실; EFE = 심내막 섬유탄성증; EndMT = 내피에서 중간엽으로의 전환. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 멸균된 증류수 1리터 | |
| 염화나트륨 | 118 밀리몰 / L |
| 케이클 | 22 밀리몰 / L |
| KH2PO4 | 1.2 밀리몰 / 리터 |
| 마그네슘소(MgSO4) | 1.2 밀리몰 / L |
| NaHCO3 (나HCO3) | 25 밀리몰 / L |
| 포도당 | 11 밀리몰 / L |
| CaCl2 (카클2) | 2.5 밀리몰 / L |
표 1: 변형된 Krebs-Henseleit 완충액의 구성. 고칼륨(22mmol/L KCl) 심마비 용액을 제조하고 필터 멸균하여 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
| 일반적인 오류 및 문제 해결 | ||
| 이식편이 박동하기 시작하지 않음/클램프를 해제한 후 관상동맥이 채워지지 않음 | 동맥 문합 시 혈전 형성 확인 | |
| 허혈 시간(=총 체포 시간) 확인(100분을 초과해서는 안 됨) | ||
| 기상 시간이 길거나 수술 후 쥐가 깨어나지 않음 | 수술 중 맥박 강도와 주파수를 모니터링하고 혈류역학이 약한 경우 이소플루란 흡입을 줄입니다. | |
| 수술 직후 장내 혈류나 괴사성 장은 마취 시간이 길기 때문에 수술 중 혈류역학 감소가 의심되는 경우가 많습니다 | ||
| 개복술 직후의 약한 혈류역학 | 마취를 위한 이소플루란 흐름 조정 | |
| 삽관 및 적절한 흉부 움직임 평가: 편측 삽관, 기흉, 기관내 내강 폐쇄는 초기에 흔히 발생하는 실패입니다. | ||
| 쥐는 깨어나지만 처음 24시간 안에 죽습니다. | 수술 중 광범위한 출혈 | |
| 복부 부검에서 혈액량이 증가한 것이 발견되면 문합 실패로 인한 것일 가능성이 큽니다 | ||
표 2: 일반적인 장애 및 문제 해결. 실패한 시술에 대한 철저한 모니터링과 재평가는 이 모델에서 높은 생존율을 달성하는 데 매우 중요합니다.
| 수신자 쥐 무게(그램), 중앙값 [IQR] | 150 [50] |
| 기증자 연령(일), 중앙값 [IQR] | 3 [1] |
| 그램 단위의 기증자 체중, 중앙값 [IQR] | 9 [2] |
| 이식편 허혈 시간(분), 중앙값 [IQR] | 100 [25] |
| 수술 후 성공률, n | 19분의 16 (=84%) |
표 3: 절차 특성. 수혜자 및 기증자 선택, 이식편 허혈 시간 및 생존율. 약어: IQR = 사분위수 범위.
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Discussion
신생아 기증자 쥐의 심장을 수혜자의 복부에 이소성 이식하는 이 동물 모델은 상세한 조직학적 조직 평가를 통해 EndMT 유래 섬유증을 연구하고, 조절 신호 경로를 식별하고, 치료 옵션을 테스트할 수 있는 가능성을 제공합니다. EndMT는 심장 섬유화 질환의 기본 기전이기 때문에 이 모델은 소아 심장 수술 분야와 그 이상의 분야에서 큰 가치를 지닙니다. 이 모형에서는 많은 요인이 절차의 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 기증자 심장의 미성숙으로 인한 매우 연약한 조직의 적절한 취급, 마취 중 적절한 동물 취급 및 높은 수준의 미세 수술 기술은 이 모델의 성공을 위한 기본 요구 사항입니다. 이러한 실험을 수행할 때는 수술용 현미경, 소동물 인공호흡기 및 미세 수술 기구를 포함한 최적의 기술 설정을 사용해야 합니다. 필수는 아니지만 심박수 또는 체온에 대한 기본적인 모니터링은 특히 경험이 부족한 외과 의사에게 혈류역학과 마취 깊이를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다.
명심해야 할 중요한 수술 측면에는 신생아 기증자 심장의 미성숙이 포함되며, 이로 인해 조직이 매우 약해지고 상행 대동맥과 폐 몸통이 찢어지기 쉽습니다. 따라서 모든 취급은 세심한 주의를 기울여야 합니다. 문합에 사용되는 작은 혈관으로 인해 혈전 형성을 방지하는 데 도움이 되는 헤파린 식염수로 문합 부위를 봉합하고 간헐적으로 세척하는 동맥 문합을 수행하는 것이 좋습니다. 너무 미성숙하여 문합 파열에 매우 취약한 심장을 사용하는 문제를 극복하기 위해 적절하게 나이 든 신생아 쥐를 선택하는 것이 필요합니다. 반면에, 약 7일의 특정 연령이 경과하면, EndMT는 더 이상 이 동물 모델(15)에서 재현성 있게 나타날 수 없다.
EndMT는 다양한 종류의 심장 섬유증 및 죽상동맥경화증의 중심 기전으로 확인되었지만, in vivo 모델8의 부족으로 인해 연구가 지연되고 있다. EndMT 연구 분야의 주요 발전은 세포 배양 모델에 국한되어 있으며, 여기에는 내재된 한계가 있습니다 3,8,9. 더욱이 심내막 내피 세포에 대한 연구는 훨씬 더 제한적입니다. 대안으로서, 관상동맥 내피세포(coronary artery endothelial cell)가 종종 대체물로서 사용되는데, 이는 이들이 부분적으로 심내막 세포(endocardial cell)로부터 유래하는 것으로 보고되었기 때문이다21. 따라서 이 동물 모델은 심장 섬유증뿐만 아니라 죽상동맥경화증에서 유동 유도 EndMT의 중요한 병리기전을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 선천성 심장 질환의 경우, 구조적으로 인간의 EFE 조직과 유사한 EFE를 사용하여 쥐 모델에서 EndMT를 통해 건강한 심내막에서 EFE 조직으로의 전환을 재현할 수 있는 능력을 보여주었습니다. EFE 조직 내에서 중간엽 세포의 세포 기원에 관한 논란이 있습니다. Clark et al.22은 심외막 세포가 EFE에 기여한다고 보고했지만, 우리의 데이터에 따르면 EFE 조직의 대부분은 EndMT3를 받는 심내막 내피 세포를 통해 파생됩니다. EFE 조직의 세포 기원을 확인하기 위해 현재 단일 세포 수준의 실험이 진행 중입니다.
이 in vivo 모델을 통해 EndMT의 조절 경로를 연구할 수 있습니다. 불균형, 특히 TGF-ß 경로의 증가와 손상된 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호전달은 EndMT를 조절하는 전사 인자를 발현하는 심내막 세포에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 대안적으로, Jagged/NOTCH 신호전달 및 Wnt/ß-Catenin도 EndMT 3,23을 유도하는 것으로 보고되었습니다. TGF-ß 경로는 SMAD 단백질을 통해 SLUG, SNAIL 및 TWIST와 같은 전사 인자의 활성화를 유도하여 EndMT20,24를 조절합니다. 이 동물 모델에서 우리는 면역조직화학적 염색에 의해 확인된 이러한 메커니즘을 재현할 수 있었습니다.
이 동물 모델에서 EndMT 유발 섬유증에 대한 자극 요인은 미성숙 및 흐름 정체인 반면, 다른 모델은 유전자 변형, 고혈압 또는 식이 제한을 통해 EndMT를 유도하도록 설계되었습니다 9,25. 다른 종에 비해 신생아 쥐는 태어날 때 매우 미성숙하기 때문에 EndMT를 겪기 특히 쉽습니다.
우리와 다른 사람들은 형질 전환 계통 추적을 통해 EFE의 기원을 더 잘 연구하기 위해 마우스를 사용했지만 몇 가지 제한 사항을 논의해야합니다 3,22. 첫째, 모델의 복잡성으로 인해 쥐에 비해 쥐의 사망률이 더 높고 EFE의 표현이 더 이질적입니다. 따라서 RAT 모델은 더 신뢰할 수 있고 재현 가능합니다. 심초음파 측정은 연구 기간 동안 이식편 기능을 평가하는 데 중요하며, 이러한 측정으로 문합, 이식편 기능 및 수축성의 박동성과 개통성을 평가할 수 있음을 보여주었습니다. 경험이 많을수록 LV의 변형 분석과 같은 이식된 심장에 대한 훨씬 더 고급 분석이 쥐 모델에서 수행될 수 있습니다. 설치류가 아닌 더 큰 동물에서도 동일한 병태생리학적 상태가 유발될 수 있는지 여부는 현재 불분명하며, 이는 추가 조사가 필요합니다.
결론적으로, 이 소아 동물 모델은 EndMT의 인간 질병을 모방하며 EndMT의 조절을 결정하고 이 병리학적 과정을 억제하기 위한 약리학적 개입을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 연구는 Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) 및 Single Ventricle Expansion Fund (to I.F.) 및 오스트리아 연방 교육과학연구부 BMBWFC (to G.G.)가 제공한 기금에서 OeAD-GmbH의 Marietta Blau 장학금으로 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
