Summary
Detta arbete presenterar en djurmodell av endotel-till-mesenkymal övergångsinducerad fibros, som ses vid medfödda hjärtfel såsom kritisk aortastenos eller hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom, vilket möjliggör detaljerad histologisk vävnadsutvärdering, identifiering av regulatoriska signalvägar och testning av behandlingsalternativ.
Abstract
Endokardiell fibroelastos (EFE), som definieras som ackumulering av subendokardiell vävnad, har stor inverkan på utvecklingen av vänster kammare (LV) och utesluter patienter med medfödd kritisk aortastenos och hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) från botande anatomisk biventrikulär kirurgisk reparation. Kirurgisk resektion är för närvarande det enda tillgängliga behandlingsalternativet, men EFE återkommer ofta, ibland med ett ännu mer infiltrativt tillväxtmönster i det intilliggande hjärtmuskeln.
För att bättre förstå de underliggande mekanismerna för EFE och för att utforska terapeutiska strategier utvecklades en djurmodell som lämpar sig för prekliniska tester. Djurmodellen tar hänsyn till att EFE är en sjukdom i det omogna hjärtat och är förknippad med flödesstörningar, vilket stöds av kliniska observationer. Således är den heterotopiska hjärttransplantationen av neonatala råttdonatorhjärtan grunden för denna modell.
Ett neonatalt råtthjärta transplanteras till en ung råttas buk och kopplas till mottagarens infrarenala aorta och nedre hålven. Medan perfusion av kranskärlen bevarar donatorhjärtats livsduglighet, inducerar flödesstagnation i LV EFE-tillväxt i det mycket omogna hjärtat. Den bakomliggande mekanismen för EFE-bildning är övergången av endokardiella endotelceller till mesenkymala celler (EndMT), vilket är en väl beskriven mekanism för tidig embryonal utveckling av klaffar och septa men också den främsta orsaken till fibros vid hjärtsvikt. EFE-bildning kan observeras makroskopiskt inom några dagar efter transplantationen. Transabdominell ekokardiografi används för att övervaka transplantatets livsduglighet, kontraktilitet och öppenhet hos anastomoserna. Efter avlivning skördas EFE-vävnaden och den uppvisar samma histopatologiska egenskaper som human EFE-vävnad från HLHS-patienter.
Denna in vivo-modell gör det möjligt att studera mekanismerna för EFE-utveckling i hjärtat och testa behandlingsalternativ för att förhindra denna patologiska vävnadsbildning och ger möjlighet till en mer generaliserad undersökning av EndMT-inducerad fibros.
Introduction
Endokardiell fibroelastos (EFE), definierad av ackumulering av kollagen och elastiska fibrer i subendokardiell vävnad, presenterar sig som ett pärlemorskimrande eller ogenomskinligt förtjockat endokardiet; EFE genomgår den mest aktiva tillväxten under fosterperioden och den tidiga spädbarnstiden1. I en obduktionsstudie var 70 % av fallen med hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) associerade med förekomst av EFE2.
Celler som uttrycker markörer för fibroblaster är den huvudsakliga cellpopulationen i EFE, men dessa celler uttrycker också samtidigt endokardiella endotelmarkörer, vilket är en indikation på ursprunget till dessa EFE-celler. Vår grupp har tidigare fastställt att den underliggande mekanismen för EFE-bildning involverar en fenotypisk förändring av endokardiella endotelceller till fibroblaster genom endotel-till-mesenkymal övergång (EndMT)3. EndMT kan detekteras med hjälp av immunhistokemisk dubbelfärgning för endotelmarkörer såsom kluster av differentiering (CD) 31 eller vaskulär endotel (VE)-cadherin (CD144) och fibroblastmarkörer (t.ex. alfa-glatt muskelaktin, α-SMA). Dessutom har vi tidigare fastställt TGF-ß-vägens reglerande roll i denna process med aktivering av transkriptionsfaktorerna SLUG, SNAIL och TWIST3.
EndMT är en fysiologisk process som sker under embryonal hjärtutveckling och leder till bildandet av septa och klaffar från endokardiella kuddar4, men det orsakar också organfibros vid hjärtsvikt, njurfibros eller cancer och spelar en nyckelroll vid vaskulär ateroskleros 5,6,7,8. EndMT i hjärtfibros regleras huvudsakligen genom TGF-β-vägen, som vi och andra har rapporterat 3,9. Olika stimuli har beskrivits inducera EndMT: inflammation 10, hypoxi 11, mekaniska förändringar 12 och flödesstörningar, inklusive förändringar av det intrakavitära blodflödet 13, och EndMT kan också vara en följd av en genetisk sjukdom 14.
Denna djurmodell utvecklades med hjälp av nyckelkomponenterna i hjärtats EFE-utveckling, som är omognad och förändringar av det intrakavitära blodflödet, särskilt flödesstagnation. Omognad uppfylldes genom att använda neonatala råtthjärtan som donatorer, eftersom neonatala råttor är kända för att vara utvecklingsmässigt omogna direkt efter födseln. Heterotopisk hjärttransplantation erbjöd intrakavitär flödesbegränsning15.
Ur klinisk synvinkel gör denna djurmodell det möjligt att bättre undersöka effekten av EndMT på den växande vänsterkammaren (LV). Den tillväxthämning som påförts fostrets och det neonatala hjärtat genom EndMT-inducerad EFE-bildning16 utesluter patienter med obstruktion av utflödeskanalen för vänster kammare (LVOTO) såsom medfödd kritisk aortastenos och hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) från botande anatomisk biventrikulär kirurgisk reparation17. Denna djurmodell underlättar studier av de cellulära mekanismerna och regleringen av vävnadsbildning genom EndMT och möjliggör testning av farmakologiska behandlingsalternativ 3,18.
Transabdominell ekokardiografi används för att övervaka transplantatets livsduglighet, kontraktilitet och öppenhet hos anastomoserna. Efter eutanasi kan EFE-bildning observeras makroskopiskt inom 3 dagar efter transplantationen. EFE-vävnad uppvisar samma histopatologiska egenskaper som human EFE-vävnad från patienter med LVOTO.
Därför kan denna djurmodell, även om den utvecklats för pediatrisk användning i spektrumet av HLHS, tillämpas vid studier av olika sjukdomar baserat på den molekylära mekanismen för EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Research Council. 2011. Guide för vård och användning av försöksdjur: åttonde upplagan. Djurprotokollen granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Boston Children's Hospital.
Före operationen ångautoklaveras alla kirurgiska instrument och modifierad Krebs-Henseleit-buffert, med en slutlig koncentration på 22 mmol/L KCl, bereds som en kardioplegisk lösning (tabell 1). Lösningen är filtersteriliserad och förvaras vid 4 °C över natten. Ett kirurgiskt mikroskop (12,5x) krävs för den heterotopiska neonatala hjärttransplantationen på råtta.
1. Förberedelse och anestesi
- Använd Lewis-råttor av hane/honkön med en vikt på cirka 150 g (5-6 veckors ålder) som mottagare.
- Till att börja med ska du generöst raka råttans buk med en rakhyvel.
- Placera råttan i en isoflurankammare och slå på syrgasflödet med 2 l/min med 2 % isofluran tills djuret är ordentligt nedsövt men fortfarande andas spontant. Injicera 45 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazin intraperitonealt (IP) samt 300 E/kg heparin. Bekräfta korrekt bedövning med ett tånyptest.
OBS: Övervaka noggrant den spontana andningen och hjärtfrekvensen genom palpation av bröstet för att säkerställa en stabil hemodynamisk status under hela processen. - För intubation, placera råttan på en sned hylla (Figur 1), fäst framtänderna med ett snöre och placera huvudet vänt mot kirurgen.
- Placera ljuset på utsidan av halsen på stämbanden, ta tag i tungan med två fingrar och tryck den lätt uppåt och åt vänster för att ge optimal syn för intubation. Använd en 18 G, 2 i kanyl för en 100-150 g råtta. Fäst intratrakealtuben med tejp.
OBS: Kirurgiska luppar med 3.5x förstoring rekommenderas för intubation. - Anslut intubationskanylen till smådjursventilatorn och justera inställningarna enligt tillverkarens instruktioner baserat på djurstorleken.
OBS: Använd följande inställningar för en 150 g råtta: volymläge; andningsfrekvens, 55/min; tidalvolym, 1,3 ml 50 % I/E-förhållande, men detta kan justeras på lämpligt sätt efter behov. Säkerställ korrekt bilateral och jämn bröstkorgsrörelse och administrera isofluran kontinuerligt med 0,5–2 % genom ventilatorn. - Placera råttan på en värmedyna (för att bibehålla normal kroppstemperatur) i ryggläge med svansen vänd mot kirurgen. Sterilisera buken tre gånger med betadinlösning och 70 % etanol omväxlande. Administrera ögonglidmedel och täck råttan med ett sterilt kirurgiskt draperi och lämna buken otäckt.
2. Kirurgisk förberedelse och heterotopisk transplantation av det neonatala donatorhjärtat hos mottagarråttan
- Utför en laparotomi i mittlinjen med en 15-bladig skalpell för hudsnittet och använd en sax för att öppna den främre bukväggen, följt av trubbig exponering av den retroperitoneala bukaortan och nedre hålvenen (IVC) med bomullsspetsapplikatorer.
- Mobilisera tarmarna (inklusive den nedåtgående tjocktarmen) och placera dem mot den högra övre kvadranten. Täck tarmarna med varm saltlösning indränkt gasbinda. Använd upprullningsdon för att säkerställa optimal exponering av IVC och bukaorta.
- Utför trubbig dissektion av infrarenal IVC och bukaorta upp mot bifurkationen. Ligate alla infrarenala grenartärer och vener (t.ex. nedre tarmkäxartären och lymfkörtelartärerna) med en 10-0 nylonsutur.
OBS: Det finns stor variation i anatomin hos dessa sidogrenar. Övervaka aortans puls och hjärtfrekvens visuellt när ingen annan hemodynamisk övervakning är tillgänglig. Bedöm rätt anestesidjup var 15:e minut genom ett tåklämtest. Justera isoflurankoncentrationen i enlighet med detta. - Efter att donatorhjärtat har skördats från en neonatal råtta, levereras det utskurna hjärtat under sterila förhållanden i en kirurgisk bassäng som innehåller Krebs-Henseleit-buffert till det kirurgiska fältet. Skölj donatorhjärtat intermittent med iskall kardioplegisk lösning.
OBS: När en andra kirurg är tillgänglig bör hjärtat förberedas samtidigt, eftersom en andra kirurg minskar den totala anestesitiden för mottagardjuret och ischemitiden för donatorhjärtat. När en andra kirurg inte är tillgänglig, täck mottagarens buk med varm koksaltlösning och övervaka djuret under skördeproceduren. - Applicera fyra små atraumatiska kärlklämmor på de distala och proximala segmenten av infrarenal aorta och IVC. Om det behövs, täpp tillfälligt till ett ogynnsamt njurkärl med en 7-0 silkessutur och släpp suturen efter ingreppet. Placera en 10-0 nylonsutur vertikalt på aortans främre vägg för att underlätta aortomin. Utför en aortotomi med två små horisontella snitt (kilformade) med mikrosax genom att dra upp suturen något.
OBS: För att ta bort eventuella blodproppar rekommenderas spolning av aortalumen med hepariniserad koksaltlösning. - Placera donatorhjärtat på aortans vänstra sida (ur djurets perspektiv) och fäst mottagarens infrarenala aorta och donatorns uppåtgående aorta från sida till sida vid aortomins positioner klockan 12 och klockan 6 med suturer. Fortsätt med den tredje och fjärde suturen vid klockan 3 och klockan 9, vänd försiktigt över hjärtat till höger sida av aortan efter den tredje suturen. Fullborda arteriell anastomos genom att lägga till en till två suturer i varje mellanrum.
OBS: Försiktighet bör iakttas för att undvika att vidröra antingen donatorns stigande aorta eller mottagarens bukaorta med pincett när anastomosen skapas för att undvika vävnadsskador. - Vrid råttan moturs, med huvudet vänt mot kirurgens vänstra hand. Flytta donatorns aorta till vänster sida av bukaortan för att ge optimal syn på IVC.
- Utför en venotomi på IVC, något proximalt till aortaanastomosen, med hjälp av ett 11-blad för punktering och mikrosax för adekvat storleksjustering enligt diametern på donatorns lungstam. Spola återigen intrakavallumen med hepariniserad koksaltlösning.
- Börja med den venösa anastomosen mellan mottagarens IVC och donatorns lungstam, vilket bäst uppnås genom att placera avbrutna 11-0 nylonsuturer på kärlets bakvägg, med början vid positionerna klockan 12 och 6 (relaterade till IVC), och placera sedan en kontinuerlig 11-0 nylonsutur på den främre väggen (från klockan 6 till klockan 12).
- Täck anastomoserna med små remsor av en absorberbar gelatinsvamp och ta bort de mikrovaskulära klämmorna med början distalt. Använd en bomullsapplikator för att lätt komprimera svamparna för att få optimal hemostas.
- Observera att transplantatets kranskärl fylls vid tidpunkten för frisättningen av de distala mikrovaskulära klämmorna och se till att donatorhjärtat börjar slå omedelbart när den proximala klämman släpps.
OBS: Transplantatets livskraft kan poängsättas från 0 till 4 intraoperativt enligt en modifierad Stanford-poäng19 för att bekräfta adekvat transplantatfunktion. - Placera tillbaka tarmarna i buken genom att se till att inte förvränga den arteriella och venösa anastomosen.
- Administrera meloxikam (1 mg/kg) och ethiqa XR (0,65 mg/kg) subkutant medan djuret är fullständigt bedövat för att fastställa postoperativ smärtlindring. Stäng sedan bukväggen med en kontinuerlig 5-0 absorberbar vicryl-sutur innan du stänger huden med en 6-0 absorberbar vicryl-sutur intrakutant.
OBS: Vägledning om vanliga fel och felsökning presenteras i tabell 2.
3. Skörd av det neonatala donatorhjärtat
- Placera den neonatala donatorråttan i en kammare insufflerad med isofluran (2 %) för sedering. Administrera ketamin (75 mg/kg) och xylazin (5 mg/kg) samt heparin (300 E/kg) intraperitonealt.
- Bekräfta anestesidjupet genom att nypa ihop tårna och placera råttan i ryggläge med svansen vänd mot dig. Sterilisera hela bröstkorgen och bukväggen med betadin och 70% etanol tre gånger alternativt. Täck råttan med ett sterilt kirurgiskt skynke.
- Använd ett 12,5x kirurgiskt mikroskop och ta bort hela den främre bröstkorgsväggen genom att börja med ett horisontellt snitt med en 15-bladig skalpell vid xyfoiden följt av vertikala snitt i sidled upp till axillerna på båda sidor med en sax. Den främre bröstkorgsväggen kan sedan tas bort genom att fortsätta med ytterligare ett horisontellt snitt precis under halsen.
- Dissekera IVC, höger och vänster övre hålvenen och lungkärlen med en sax, och omringa och ligera sedan alla kärl med en 7-0 silkessutur. Administrera 3 ml iskall Krebs-Henseleit-lösning med hög kaliumhalt till höger förmak genom att punktera IVC med en 30 G nål och trycka lätt ner membranet med en pincett.
- Klipp IVC, SVC, lungkärl och aorta med sax. Transektera lungartärerna så långt som möjligt och aortan distalt om brachiocephalic trunk för att säkerställa rätt längd med hjälp av en skalpell med 11 blad.
- Separera lungstammen och uppåtgående aorta med en mikrosax och spola hjärtat med iskall kardioplegisk lösning med en 3 ml spruta.
4. Återhämtning av mottagaren och övervakning av transplantat
- Efter operationen, ge råttan gott om tid att vakna, vilket vanligtvis sker inom ett tidsfönster på 15 minuter, och låt den återhämta sig på en värmedyna.
OBS: Ingen antibiotika är nödvändig på grund av den mycket låga infektionsrisken och för att inte äventyra den experimentella modellen, och ingen begränsning till mat eller vatten tillämpas. - Efter transplantation ska transplantatfunktionen övervakas genom palpation av det transplanterade hjärtat dagligen, men tänk på att detta ibland kan vara svårt att bedöma på grund av tarmöverlagring.
OBS: Bukekokardiografi kan mer exakt mäta transplantatets livskraft. För ekokardiografi, söva råttan lätt med isofluran (1-2%) inhalerad genom en noskon, och placera den på en värmedyna. Ekokardiografi utförs vanligtvis på postoperativ dag (POD) 1, POD 7 och POD 14. För att möjliggöra bedömning av hjärtfrekvens och kontraktilitet kan man enkelt få lång- och kortaxelvyer (Figur 2A, B). För att utvärdera anastomoserna, använd dopplerekokardiografi (Figur 3A) och bekräfta bildandet av EFE-vävnad som ses som ett ekoljust endokardiellt skikt i vänster kammarekavitet (Figur 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transplantatets livsduglighet och slagning
I detta arbete bedömdes transplantatets livsduglighet visuellt efter att alla klämmor hade tagits bort, och en ungefärlig reperfusionstid på 10-15 minuter tilläts med öppen buk för observation av transplantatet. Samma poängsystem för att objektivt verifiera transplantatets livsduglighet användes för visuell bedömning i slutet av operationen och för ekokardiografi på POD 1, POD 7 och POD 14.
0 = ingen organfunktion; 1 = (vilo)organfunktion, endast minimal sammandragning; 2 = svag eller partiell organfunktion; 3 = reducerad kontraktil hastighet eller intensitet, men homogen organfunktion; 4 = optimal sammandragning av förmak och kammare (120-160 slag/min). En poäng på 3 eller 4 bedömdes som en framgång. Palpatorisk utvärdering av det abdominella donatortransplantatet användes för att övervaka transplantatets livsduglighet mellan tidpunkterna för ekokardiografisk bedömning.
Dödlighet och transplantatlivsduglighet
Ingreppet introducerades för ett nytt kirurgiskt team vid studiecentret mellan oktober 2022 och december 2022, och 19 neonatala heterotopiska hjärttransplantationer på råtta utfördes på studiecentret under denna period. Den omedelbara operativa överlevnaden var 79 % och överlevnadsgraden för transplantatet (som uppvisar ett livsdugligt, slående donatorhjärta) var 84 %. Procedurens karakteristika presenteras i tabell 3.
Av de 12 överlevande djuren krävde 2 avlivning före studiens effektmått på 2 veckor, 1 på grund av en ileus (n = 1) och den andra på grund av smärta som inte lindrades med smärtstillande läkemedel (n = 1), och 2 avlivades avsiktligt 1 vecka efter operationen.
Hos tre råttor ökade den tillämpade modifierade Stanford-poängen från 3 till 4 mellan omedelbar postoperativ visuell gradering och ekokardiografisk utvärdering på POD 1. Bland de åtta överlevande råttorna vid 14-dagarsslutpunkten var de modifierade Stanford-poängen vid ekokardiografi fyra för sju djur och tre för ett djur. Den vanligaste dödsorsaken i denna serie var hemodynamisk svikt på grund av kraftig blodförlust till följd av det mycket omogna hjärtat och därmed sköra donatorkärl för anastomos eller långa anestesitider.
Histologisk bedömning av EFE-vävnad
Efter CO2 -avlivning av mottagarråttan utfördes en ny laparotomi under steril förberedelse. Donatortransplantatet skars ut och placerades omedelbart i en fysiologisk koksaltlösning på is för vidare bearbetning. En horisontell skiva avlägsnades på mitten av ventrikelnivån i höger och vänster kammare, placerades i inbäddningsmedium för optimal skärtemperatur (OCT) och frystes i flytande kväve (Figur 4A). All annan vävnad snäppfrystes med flytande kväve och förvarades i en frys på −80 °C för vidare analys. Bilderna togs med hjälp av ett inverterat mikroskop (figur 4B-D).
Immunhistokemisk färgning som guldstandard för att identifiera EndMT utfördes med användning av 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå), VE-Cadherin som endotelmarkör (röd) och α-SMA som fibroblastmarkör (grön). Fosforylerade SMAD-proteiner och transkriptionsfaktorn SLUG/SNAIL färgades också i EFE-vävnaden (Figur 5A-E)3,20.
Figur 1: Sned hylla för intubation. Råttan placeras på rygg, med framtänderna säkrade med ett snöre och huvudet vänt mot kirurgen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ekokardiografisk långaxlig vy av LV . (A) Inhemskt råtthjärta som indikerar normal fyllning under diastole. (B) Donatortransplantat med flödesstagnation inom LV. Minskad volymbelastning under diastole. Förkortningar: LV = vänster kammare; MV = mitralisklaff; LVOT = utflöde från vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Anastomoser och EFE-utvärdering. A) Ekokardiografisk färgdopplerstudie som indikerar patentarteriella (röd pil) och venösa (blå pil) anastomoser. (B,C): Ekoljus endokardiell yta i LV-kaviteten som indikerar EFE (vita pilar). Förkortningar: LV = vänster kammare; EFE = endokardiell fibroelastos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Makroskopisk och mikroskopisk vävnadsutvärdering . (A) Tvärsnitt i mitten av ventrikulären genom LV och RV. De vita pilarna pekar mot EFE-vävnaden. (B) Hematoxylin-eosin, (C) Massons trikrom (MTS) och (D) Elastin van Gieson (EVG) färgning. Den stora förstoringen indikerar att EFE-vävnaden (svarta pilar) innehåller stora mängder organiserat kollagen (blått i MTS) och elastinfibrer (svart i EVG). Förkortningar: LV = vänster kammare; RV = höger kammare; EFE = endokardiell fibroelastos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av histologiska och immunhistologiska bilder. A) Färgning av hematoxylin-eosin. (B-E) Immunhistokemisk färgning; EFE-vävnad dubbelfärgad för (B,C) VE-Cadherin och α-SMA, (D) CD31 och fosfo-SMAD2/SMAD3 (samlokaliserad med kärnorna färgade med DAPI i blått), och (E) CD31 och SLUG/SNAIL (samlokaliserad med kärnorna färgade med DAPI i blått), vilket indikerar EndMT, vilket visas av de vita pilarna. Förkortningar: LV = vänster kammare; EFE = endokardiell fibroelastos; EndMT = endotel-till-mesenkymal övergång. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| 1 liter steriliserat, destillerat vatten | |
| NaCl | 118 mmol/L |
| KCl | 22 mmol/L |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| MgSO4 | 1,2 mmol/L |
| NaHCO3 | 25 mmol/L |
| Glukos | 11 mmol/L |
| CaCl2 | 2,5 mmol/L |
Tabell 1: Sammansättning av den modifierade Krebs-Henseleit-bufferten. Kardioplegisk lösning med hög kaliumhalt (22 mmol/L KCl) bereds, filtreras och förvaras vid 4 °C över natten.
| Vanliga fel och felsökning | ||
| Transplantatet börjar inte slå/kranskärl fylls inte efter att klämmorna släppts | Kontrollera om det finns trombbildning vid arteriell anastomos | |
| Kontrollera ischemisk tid (=total stopptid) (bör inte överstiga 100 minuter) | ||
| Lång väckningstid eller råtta vaknar inte efter operationen | Övervaka pulsstyrka och frekvens under operationen och minska inhalationen av isofluran om hemodynamiken är svag | |
| Omedelbart postoperativa liv- eller nekrotiska tarmar misstänks för minskad intraoperativ hemodynamik, ofta på grund av lång anestesitid | ||
| Svag hemodynamik direkt efter laparotomi | Justera isofluranflödet för anestesi | |
| Utvärdera intubation och korrekt bröstkorgsrörelse: ensidig intubation, pneumothorax, obstruktiv endotrakeal lumen är vanliga misslyckanden i början. | ||
| Råttan vaknar men dör inom de första 24 timmarna | Omfattande blodförlust under operation | |
| Om ökad mängd blod hittas vid obduktion i buken beror det troligen på att anastomosen inte fungerar | ||
Tabell 2: Vanliga fel och felsökning. Noggrann övervakning och omvärdering av misslyckade försök är avgörande för att uppnå en hög överlevnadsgrad i denna modell.
| Mottagarråttans vikt i gram, median [IQR] | 150 [50] |
| Donatorns ålder i dagar, median [IQR] | 3 [1] |
| Donatorns vikt i gram, median [IQR] | 9 [2] |
| Transplantatischemitid i minuter, median [IQR] | 100 [25] |
| Postoperativ framgångsfrekvens, n | 16/19 (=84 %) |
Tabell 3: Förfarandets karakteristika. Val av mottagare och donator, transplantatischemitid och överlevnadsgrad. Förkortning: IQR = interkvartilintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna djurmodell för heterotopisk transplantation av ett neonatalt donatorråtthjärta till mottagarens buk skapar möjligheten att studera EndMT-härledd fibros genom detaljerad histologisk vävnadsutvärdering, identifiera regulatoriska signalvägar och testa behandlingsalternativ. Eftersom EndMT är den underliggande mekanismen för fibrotiska sjukdomar i hjärtat har denna modell stort värde inom pediatrisk hjärtkirurgi och därefter. I denna modell kan många faktorer påverka resultatet av proceduren negativt. Korrekt hantering av den mycket ömtåliga vävnaden på grund av givarhjärtats omognad, korrekt djurhantering under anestesi och mikrokirurgiska färdigheter på hög nivå är därför grundläggande krav för att denna modell ska lyckas. En optimal teknisk installation, inklusive ett kirurgiskt mikroskop, smådjursventilator och mikrokirurgiska instrument, bör användas när dessa experiment utförs. Även om det inte är nödvändigt, kan grundläggande övervakning av hjärtfrekvens eller kroppstemperatur vara fördelaktigt, särskilt för oerfarna kirurger, för att övervaka hemodynamiken och anestesidjupet.
Viktiga kirurgiska aspekter att ha i åtanke är bland annat att de neonatala donatorhjärtana är omogna, vilket gör vävnaden mycket skör och gör den uppåtgående aortan och lungstammen sårbara för tårar. Därför bör all hantering utföras med stor försiktighet. På grund av de små kärl som används för anastomos rekommenderas det att utföra arteriell anastomos med avbrutna stygn och intermittent spolning av anastomosstället med hepariniserad koksaltlösning, vilket hjälper till att undvika trombbildning. Urval av neonatala råttor i lämplig ålder krävs för att övervinna problemet med att använda hjärtan som är för omogna och därför mycket mottagliga för anastomosruptur. Å andra sidan, efter en viss ålder på cirka 7 dagar, kan EndMT inte längre visas reproducerbart i denna djurmodell15.
EndMT har identifierats som den centrala mekanismen för olika typer av hjärtfibros och åderförkalkning, men forskningen har hämmats på grund av brist på in vivo-modeller 8. Den huvudsakliga utvecklingen inom EndMT-forskningen är begränsad till cellodlingsmodeller, som har inneboende begränsningar 3,8,9. Dessutom är studier på endokardiella endotelceller ännu mer begränsade. Som ett alternativ används ofta endotelceller i kranskärlet som ersättning, eftersom de har rapporterats härstamma delvis från endokardiella celler21. Därför kan denna djurmodell användas inte bara för hjärtfibros utan för att studera viktiga patogenmekanismer för flödesinducerad EndMT vid åderförkalkning. För medfödda hjärtfel har vi visat förmågan att reproducera övergången från frisk endokardium till EFE-vävnad genom EndMT i vår råttmodell, med EFE som strukturellt liknar mänsklig EFE-vävnad. Det finns en viss kontrovers angående det cellulära ursprunget till mesenkymala celler i EFE-vävnaden. Clark et al.22 rapporterade att epikardiella celler bidrar till EFE, men våra data indikerade att majoriteten av EFE-vävnad härrör från endokardiella endotelceller som genomgår EndMT3. Experiment på encellsnivå pågår för närvarande för att fastställa det cellulära ursprunget till EFE-vävnad.
Genom denna in vivo-modell kan de regulatoriska vägarna för EndMT studeras. En obalans, särskilt en ökning av TGF-ß-signalvägen och försämrad benmorfogenetisk proteinsignalering (BMP), har visat sig spela en viktig roll i endokardiella celler som uttrycker transkriptionsfaktorer som reglerar EndMT. Alternativt har Jagged/NOTCH-signalering och Wnt/ß-Catenin också rapporterats inducera EndMT 3,23. TGF-ß-vägen inducerar aktivering av transkriptionsfaktorer som SLUG, SNAIL och TWIST via SMAD-proteiner och reglerar därigenom EndMT20,24. I denna djurmodell har vi kunnat rekapitulera dessa mekanismer, som har bekräftats genom immunhistokemisk färgning.
De stimulerande faktorerna för EndMT-inducerad fibros i denna djurmodell är omognad och flödesstagnation, medan andra modeller är utformade för att inducera EndMT genom genetiska modifieringar, hypertoni eller kostrestriktioner 9,25. Jämfört med andra arter är neonatala råttor mycket omogna vid födseln, och därför är de särskilt mottagliga för att genomgå EndMT.
Vi och andra har använt möss för att bättre studera ursprunget till EFE via transgen härstamning, men flera begränsningar behöver diskuteras 3,22. För det första, på grund av modellens komplexitet, är dödligheten högre hos möss jämfört med råttor, och presentationen av EFE är mer heterogen; Därför är råttmodellen mer tillförlitlig och reproducerbar. Ekokardiografiska mätningar är avgörande för att bedöma transplantatets funktion under hela studieperioden, och vi har visat att med dessa mått, förutom att bedöma anastomosernas pulsatilitet och patency, kan transplantatfunktion och kontraktilitet också studeras. Med mer erfarenhet skulle ännu mer avancerade analyser av det transplanterade hjärtat, till exempel stamanalys av LV, kunna utföras i råttmodeller. Det är för närvarande oklart om samma patofysiologiska tillstånd kan induceras hos andra större djur än gnagare, och detta kräver ytterligare utredning.
Sammanfattningsvis efterliknar denna pediatriska djurmodell den mänskliga sjukdomen EndMT och kan vara användbar för att bestämma regleringen av EndMT och för att studera farmakologiska interventioner för att hämma denna patologiska process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) och Single Ventricle Expansion Fund (till I.F.) och ett Marietta Blau-stipendium från OeAD-GmbH från medel från det österrikiska federala ministeriet för utbildning, vetenskap och forskning BMBWFC (till G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
