Summary
يقدم هذا العمل نموذجا حيوانيا للتليف الناجم عن الانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة ، كما يظهر في عيوب القلب الخلقية مثل تضيق الأبهر الحرج أو متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج ، مما يسمح بإجراء تقييم مفصل للأنسجة النسيجية ، وتحديد مسارات الإشارات التنظيمية ، واختبار خيارات العلاج.
Abstract
الداء الليفي الشغفي (EFE) ، الذي يحدده تراكم الأنسجة تحت الشغاف ، له تأثيرات كبيرة على تطور البطين الأيسر (LV) ويمنع المرضى الذين يعانون من تضيق الأبهر الحرج الخلقي ومتلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS) من الإصلاح الجراحي التشريحي الشافي للبطينين. الاستئصال الجراحي هو الخيار العلاجي الوحيد المتاح حاليا ، ولكن غالبا ما يتكرر EFE ، وأحيانا مع نمط نمو أكثر تسلل إلى عضلة القلب المجاورة.
لفهم الآليات الأساسية ل EFE بشكل أفضل واستكشاف الاستراتيجيات العلاجية ، تم تطوير نموذج حيواني مناسب للاختبار قبل السريري. يأخذ النموذج الحيواني في الاعتبار أن EFE هو مرض يصيب القلب غير الناضج ويرتبط باضطرابات التدفق ، كما تدعمه الملاحظات السريرية. وبالتالي ، فإن زرع القلب غير المتجانس لقلوب المتبرعين بالفئران حديثي الولادة هو الأساس لهذا النموذج.
يتم زرع قلب فأر حديث الولادة في بطن فأر مراهق وتوصيله بالشريان الأورطي تحت الكلوي للمتلقي والوريد الأجوف السفلي. في حين أن تروية الشرايين التاجية تحافظ على صلاحية قلب المتبرع ، فإن ركود التدفق داخل LV يحفز نمو EFE في القلب غير الناضج للغاية. الآلية الأساسية لتشكيل EFE هي انتقال الخلايا البطانية الشغاف إلى خلايا اللحمة المتوسطة (EndMT) ، وهي آلية موصوفة جيدا للتطور الجنيني المبكر للصمامات والحاجز ولكن أيضا السبب الرئيسي للتليف في قصور القلب. يمكن ملاحظة تكوين EFE مجهريا في غضون أيام بعد الزرع. يستخدم تخطيط صدى القلب عبر البطن لمراقبة صلاحية الكسب غير المشروع ، والانقباض ، وسالكية المفاغرة. بعد القتل الرحيم ، يتم حصاد أنسجة EFE ، وتظهر نفس الخصائص النسيجية المرضية مثل أنسجة EFE البشرية من مرضى HLHS.
يسمح هذا النموذج في الجسم الحي بدراسة آليات تطور EFE في القلب واختبار خيارات العلاج لمنع تكوين الأنسجة المرضية هذا ويوفر الفرصة لإجراء فحص أكثر عمومية للتليف الناجم عن EndMT.
Introduction
داء ليفي الشغاف (EFE) ، الذي يحدده تراكم الكولاجين والألياف المرنة في الأنسجة تحت الشغاف ، يظهر على شكل شغاف سميك لؤلؤي أو معتم. يخضع EFE للنمو الأكثر نشاطا خلال فترة الجنين والطفولة المبكرة1. في دراسة تشريح الجثة ، ارتبطت 70٪ من حالات متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS) بوجود EFE2.
الخلايا التي تعبر عن علامات الخلايا الليفية هي مجموعة الخلايا الرئيسية في EFE ، ولكن هذه الخلايا تعبر أيضا بشكل متزامن عن علامات بطانة الشغاف ، وهو مؤشر على أصل خلايا EFE هذه. أثبتت مجموعتنا سابقا أن الآلية الأساسية لتشكيل EFE تتضمن تغييرا ظاهريا للخلايا البطانية الشغاف إلى الخلايا الليفية من خلال الانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة (EndMT) 3. يمكن الكشف عن EndMT باستخدام تلطيخ مزدوج كيميائي مناعي لعلامات البطانة مثل مجموعة التمايز (CD) 31 أو بطانة الأوعية الدموية (VE) - كادرين (CD144) وعلامات الخلايا الليفية (على سبيل المثال ، أكتين العضلات الملساء ألفا ، α-SMA). علاوة على ذلك ، أنشأنا سابقا الدور التنظيمي لمسار TGF-ß في هذه العملية مع تنشيط عوامل النسخ SLUG و SNAIL و TWIST3.
EndMT هي عملية فسيولوجية تحدث أثناء نمو القلب الجنيني وتؤدي إلى تكوين الحاجز والصمامات من وسائد الشغاف4 ، ولكنها تسبب أيضا تليف الأعضاء في قصور القلب أو التليف الكلوي أو السرطان وتلعب دورا رئيسيا في تصلب الشرايين الوعائية5،6،7،8. يتم تنظيم EndMT في التليف القلبي بشكل أساسي من خلال مسار TGF-β ، حيث أبلغنا نحن وآخرونعن 3,9. تم وصف محفزات مختلفة للحث على EndMT: الالتهاب 10 ، نقص الأكسجة 11 ، التعديلات الميكانيكية 12 ، واضطرابات التدفق ، بما في ذلك تغيرات تدفق الدم داخل الأجواف 13 ، وقد يكون EndMT أيضا نتيجة لمرض وراثي 14.
تم تطوير هذا النموذج الحيواني باستخدام المكونات الرئيسية لتطوير EFE للقلب ، وهي عدم النضج والتغيرات في تدفق الدم داخل الأجواف ، وتحديدا ركود التدفق. تم تحقيق عدم النضج باستخدام قلوب الفئران حديثي الولادة كمتبرعين ، حيث من المعروف أن الفئران الوليدية غير ناضجة من الناحية التنموية بعد الولادة مباشرة. عرضت زراعة القلب غير المتجانسة توفير تقييد التدفق داخل التجويف15.
من وجهة نظر سريرية ، يسمح هذا النموذج الحيواني بالتحقيق بشكل أفضل في تأثير EndMT على البطين الأيسر المتنامي (LV). إن تقييد النمو المفروض على قلب الجنين وحديثي الولادة من خلال تكوين EFE الناجم عن EndMT16 يمنع المرضى الذين يعانون من انسداد مجرى تدفق البطين الأيسر (LVOTO) مثل تضيق الأبهر الخلقي الحرج ومتلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS) من الإصلاح الجراحي التشريحي الشافيللبطينين 17. يسهل هذا النموذج الحيواني دراسة الآليات الخلوية وتنظيم تكوين الأنسجة من خلال EndMT ويسمح باختبار خيارات العلاج الدوائي 3,18.
يستخدم تخطيط صدى القلب عبر البطن لمراقبة صلاحية الكسب غير المشروع ، والانقباض ، وسالكية المفاغرة. بعد القتل الرحيم ، يمكن ملاحظة تكوين EFE مجهريا في غضون 3 أيام بعد الزرع. تظهر أنسجة EFE نفس الخصائص النسيجية المرضية مثل أنسجة EFE البشرية من المرضى الذين يعانون من LVOTO.
ومن ثم ، يمكن تطبيق هذا النموذج الحيواني ، على الرغم من تطويره لاستخدام الأطفال في طيف HLHS ، عند دراسة الأمراض المختلفة بناء على الآلية الجزيئية ل EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمجلس القومي للبحوث. 2011. دليل لرعاية واستخدام المختبر: الطبعة الثامنة. تمت مراجعة بروتوكولات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مستشفى بوسطن للأطفال.
قبل الجراحة ، يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية بالبخار ، ويتم تحضير المخزن المؤقت Krebs-Henseleit المعدل ، بتركيز نهائي يبلغ 22 مليمول / لتر KCl ، كمحلول لشلل القلب (الجدول 1). يتم تعقيم المحلول بالفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. مطلوب مجهر جراحي (12.5x) لإجراء عملية زرع قلب الفئران حديثي الولادة غير المتجانسة.
1. التحضير والتخدير
- استخدم ذكور / إناث فئران لويس التي يبلغ وزنها حوالي 150 جراما (5-6 أسابيع من العمر) كمتلقين.
- للبدء ، حلق بسخاء بطن الفئران باستخدام ماكينة حلاقة.
- ضع الجرذ في غرفة إيزوفلوران ، وقم بتشغيل تدفق الأكسجين عند 2 لتر / دقيقة مع 2٪ إيزوفلوران حتى يتم تخدير بشكل صحيح ولكن لا يزال يتنفس تلقائيا. يتم حقن 45 ملغ/كغ من الكيتامين و5 ملغ/كغ من الزيلازين داخل الصفاق (IP)، بالإضافة إلى 300 مغ/كغ من الهيبارين. تأكد من التخدير المناسب من خلال اختبار قرصة إصبع القدم.
ملاحظة: راقب بعناية التنفس التلقائي ومعدل ضربات القلب من خلال ملامسة الصدر لضمان حالة الدورة الدموية المستقرة طوال العملية بأكملها. - للتنبيب ، ضع الجرذ على رف مائل (الشكل 1) ، وقم بتأمين الأسنان الأمامية بخيط ، وضع الرأس متجها نحو الجراح.
- ضع الضوء على الجزء الخارجي من الرقبة على منطقة الحبال الصوتية ، وأمسك اللسان بإصبعين ، وادفعه قليلا لأعلى وإلى اليسار لتوفير رؤية مثالية للتنبيب. استخدام 18 غرام ، 2 في قنية للفئران 100-150 غرام. تأمين أنبوب القصبة الهوائية مع الشريط.
ملاحظة: يوصى باستخدام الفصوص الجراحية ذات التكبير 3.5x للتنبيب. - قم بتوصيل قنية التنبيب بجهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة ، واضبط الإعدادات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بناء على حجم.
ملاحظة: استخدم الإعدادات التالية لفأر 150 جم: وضع مستوى الصوت; معدل التنفس ، 55 / دقيقة ؛ حجم المد والجزر ، 1.3 مل 50٪ نسبة I / E ، ولكن يمكن تعديل ذلك بشكل مناسب حسب الحاجة. ضمان حركة الصدر الثنائية والمتساوية المناسبة، وتطبيق الأيزوفلوران بشكل مستمر بنسبة 0.5٪ -2٪ من خلال جهاز التنفس الصناعي. - ضع الجرذ على وسادة تدفئة (للحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية) في وضع ضعيف مع توجيه الذيل نحو الجراح. تعقيم البطن ثلاث مرات بمحلول بيتادين و 70٪ من الإيثانول بالتناوب. إدارة مزلق العين ، وتغطية الفئران بستارة جراحية معقمة ، وترك البطن مكشوفا.
2. التحضير الجراحي والزرع غير المتجانس لقلب المتبرع الوليدي في الفئران المتلقية
- قم بإجراء بضع البطن في خط الوسط باستخدام مشرط مكون من 15 شفرة لشق الجلد ، واستخدم المقص لفتح جدار البطن الأمامي ، متبوعا بالتعرض الحاد للشريان الأورطي البطني خلف الصفاق والوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام أدوات تطبيق طرف القطن.
- حرك الأمعاء (بما في ذلك القولون النازل) ، وضعها نحو الربع العلوي الأيمن. غطي الأمعاء بشاش دافئ منقوع بالمحلول الملحي. استخدم المبعدات لضمان التعرض الأمثل لل IVC والشريان الأورطي البطني.
- إجراء تشريح حاد لل IVC تحت الكلوي والشريان الأورطي البطني حتى نحو التشعب. اربط جميع الشرايين والأوردة المتفرعة تحت الكلوية (على سبيل المثال ، الشريان المساريقي السفلي وشرايين العقدة الليمفاوية) بخياطة من النايلون 10-0.
ملاحظة: هناك تباين كبير في تشريح هذه الفروع الجانبية. راقب نبض الشريان الأورطي ومعدل ضربات القلب بصريا عندما لا تتوفر مراقبة أخرى لدورة الدم. قم بتقييم عمق التخدير المناسب كل 15 دقيقة من خلال اختبار قرصة إصبع القدم. اضبط تركيز الأيزوفلوران وفقا لذلك. - بعد حصاد قلب المتبرع من فأر حديثي الولادة ، قم بتوصيل القلب المستأصل في ظروف معقمة في حوض جراحي يحتوي على عازل Krebs-Henseleit إلى المجال الجراحي. ري قلب المتبرع بشكل متقطع بمحلول شلل القلب المثلج.
ملاحظة: عند توفر جراح ثان ، يجب تحضير القلب في نفس الوقت ، حيث يقلل الجراح الثاني من وقت التخدير الكلي للحيوان المتلقي ووقت نقص تروية قلب المتبرع. في حالة عدم توفر جراح ثان ، قم بتغطية بطن المتلقي بمحلول ملحي دافئ ، ومراقبة أثناء إجراء الحصاد. - ضع أربعة مشابك وعائية صغيرة غير رضحية على الأجزاء البعيدة والقريبة من الشريان الأورطي تحت الكلوي و IVC. إذا لزم الأمر ، قم بسد وعاء كلوي غير موات مؤقتا بخياطة حريرية 7-0 ، ثم حرر الخيط بعد العملية. ضع درز نايلون 10-0 عموديا على الجدار الأمامي للشريان الأورطي لتسهيل بضع الأبهر. إجراء بضع الأبهر مع قطعتين أفقيتين صغيرتين (على شكل إسفين) مع مقص صغير عن طريق سحب خياطة قليلا.
ملاحظة: لإزالة أي جلطات دموية ، يوصى بتنظيف تجويف الأبهر بمحلول ملحي من الهيبارين. - ضع قلب المتبرع على الجانب الأيسر (من منظور) من الشريان الأورطي وقم بتأمين الشريان الأورطي تحت الكلوي للمتلقي والشريان الأورطي الصاعد للمتبرع من طرف إلى آخر في مواضع الساعة 12 والساعة 6 من بضع الأبهر مع الغرز. استمر في الغرز الثالثة والرابعة في موضع الساعة 3 والساعة 9 ، واقلب القلب برفق إلى الجانب الأيمن من الشريان الأورطي بعد الخيط الثالث. أكمل مفاغرة الشرايين بإضافة خيط أو خيطين إلى كل فراغ داخلي.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب لمس الشريان الأورطي الصاعد للمتبرع أو الشريان الأورطي البطني للمتلقي بالملقط عند إنشاء مفاغرة لتجنب تلف الأنسجة. - قم بتدوير الجرذ عكس اتجاه عقارب الساعة ، بحيث يكون الرأس متجها نحو اليد اليسرى للجراح. حرك الشريان الأورطي للمتبرع إلى الجانب الأيسر من الشريان الأورطي البطني للسماح بالرؤية المثلى على IVC.
- قم بإجراء بضع الوريد على IVC ، القريب قليلا من مفاغرة الأبهر ، باستخدام شفرة 11 للثقب والمقص المجهري لتعديل الحجم المناسب وفقا لقطر الجذع الرئوي للمتبرع. مرة أخرى ، اغسل تجويف داخل الكافال بمحلول ملحي هيبارين.
- ابدأ بالمفاغرة الوريدية بين IVC للمتلقي والجذع الرئوي للمتبرع ، والذي يمكن تحقيقه بشكل أفضل عن طريق وضع خيوط نايلون متقطعة 11-0 على الجدار الخلفي للوعاء ، بدءا من مواضع الساعة 12 والساعة 6 (المتعلقة ب IVC) ، ثم ضع خياطة نايلون مستمرة 11-0 على الجدار الأمامي (من الساعة 6 باتجاه موضع الساعة 12).
- قم بتغطية المفاغرة بشرائح صغيرة من إسفنجة جيلاتينية قابلة للامتصاص ، وقم بإزالة المشابك الوعائية الدقيقة بدءا من البعيد. استخدمي أداة وضع طرف قطني لضغط الإسفنج برفق للحصول على الإرقاء الأمثل.
- راقب ملء الأوعية التاجية للطعم في وقت إطلاق المشابك الوعائية الدقيقة البعيدة ، وتأكد من أن قلب المتبرع يبدأ في النبض فورا عند تحرير المشبك القريب.
ملاحظة: يمكن تسجيل صلاحية الكسب غير المشروع من 0 إلى 4 أثناء الجراحة وفقا لدرجة ستانفورد المعدلة19 لتأكيد وظيفة الكسب غير المشروع الكافية. - ضع الأمعاء مرة أخرى في البطن من خلال التأكد من عدم تشويه مفاغرة الشرايين والوريدية.
- تطبيق ميلوكسيكام (1 ملغ/كغ) وإيثيكا إكس آر (0.65 ملغ/كغ) تحت الجلد بينما يتم تخدير بالكامل للتأكد من التسكين بعد العملية الجراحية. بعد ذلك ، أغلق جدار البطن بخياطة فيكريل قابلة للامتصاص بنسبة 5-0 قبل إغلاق الجلد بخياطة فيكريل قابلة للامتصاص 6-0 داخل الجلد.
ملاحظة: ترد إرشادات بشأن حالات الفشل الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 2.
3. حصاد قلب المتبرع حديث الولادة
- ضع الجرذ المتبرع الوليدي في غرفة مملوءة بالإيزوفلوران (2٪) للتخدير. يجب تطبيق الكيتامين (75 ملغ/ كغ) والزيلازين (5 ملغ/كغ)، وكذلك الهيبارين (300 وحدة/كغ) داخل الصفاق.
- تأكد من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، وضع الجرذ في وضع ضعيف مع توجيه الذيل نحوك. تعقيم كامل الصدر وجدار البطن مع بيتادين و 70 ٪ من الإيثانول ثلاث مرات بدلا من ذلك. تغطية الفئران مع الستارة الجراحية المعقمة.
- باستخدام مجهر جراحي 12.5x ، قم بإزالة جدار الصدر الأمامي بالكامل عن طريق البدء بشق أفقي باستخدام مشرط 15 شفرة في xyphoid متبوعا بشقوق رأسية جانبية تصل إلى الإبطين على كلا الجانبين بالمقص. يمكن بعد ذلك إزالة جدار الصدر الأمامي عن طريق الاستمرار في شق أفقي آخر أسفل الرقبة مباشرة.
- تشريح IVC ، الوريد الأجوف العلوي الأيمن والأيسر ، والأوعية الرئوية بالمقص ، ثم تطويق وربط جميع الأوعية بخياطة حريرية 7-0. تطبيق 3 مل من محلول كريبس-هنسليت المثلج وعالي البوتاسيوم المعدل في الأذين الأيمن عن طريق ثقب IVC بإبرة 30 جم ودفع الحجاب الحاجز قليلا لأسفل بالملقط.
- قطع IVC ، SVCs ، الأوعية الرئوية ، والشريان الأورطي بالمقص. انقل الشرايين الرئوية إلى أقصى حد ممكن والشريان الأورطي البعيد إلى الجذع العضدي الرأسي لضمان الطول المناسب باستخدام مشرط مكون من 11 شفرة.
- افصل الجذع الرئوي والشريان الأورطي الصاعد بالمقص المجهري ، واغسل القلب بمحلول شلل القلب البارد باستخدام حقنة سعة 3 مل.
4. استعادة المتلقي ومراقبة الكسب غير المشروع
- بعد الجراحة ، امنح الجرذ متسعا من الوقت للاستيقاظ ، والذي يحدث عادة في نافذة زمنية مدتها 15 دقيقة ، واتركه يتعافى على وسادة التدفئة.
ملاحظة: لا توجد مضادات حيوية ضرورية بسبب انخفاض خطر الإصابة بالعدوى ومن أجل عدم المساس بالنموذج التجريبي ، ولا يتم تطبيق أي قيود على الطعام أو الماء. - بعد الزرع ، راقب وظيفة الكسب غير المشروع عن طريق ملامسة القلب المزروع يوميا ، ولكن ضع في اعتبارك أنه قد يكون من الصعب في بعض الأحيان تقييم ذلك بسبب تراكب الأمعاء.
ملاحظة: يمكن لتخطيط صدى القلب البطني قياس جدوى الكسب غير المشروع بدقة أكبر. لتخطيط صدى القلب ، قم بتخدير الفئران قليلا باستخدام الأيزوفلوران (1-2٪) الذي يتم استنشاقه من خلال مخروط الأنف ، ووضعه على وسادة التدفئة. عادة ما يتم إجراء تخطيط صدى القلب في يوم ما بعد الجراحة (POD) 1 و POD 7 و POD 14. للسماح بتقييم معدل ضربات القلب والانقباض ، يمكن للمرء بسهولة الحصول على وجهات نظر المحور الطويل والمحور القصير (الشكل 2A ، B). لتقييم المفاغرة ، استخدم تخطيط صدى القلب دوبلر (الشكل 3 أ) ، وتأكد من تكوين أنسجة EFE كما ينظر إليها على أنها طبقة شغاف مشرقة بالصدى داخل تجويف البطين الأيسر (الشكل 3B ، C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
جدوى الكسب غير المشروع والضرب
في هذا العمل ، تم تقييم صلاحية الكسب غير المشروع بصريا بعد إزالة جميع المشابك ، وسمح بوقت تقريبي للتروية من 10-15 دقيقة مع بطن مفتوح لمراقبة الكسب غير المشروع. تم استخدام نفس نظام التسجيل للتحقق بشكل موضوعي من جدوى الكسب غير المشروع للتقييم البصري في نهاية الجراحة ولتخطيط صدى القلب على POD 1 و POD 7 و POD 14.
0 = لا وظيفة الجهاز ؛ 1 = (الراحة) وظيفة الجهاز ، فقط الحد الأدنى من الانكماش ؛ 2 = وظيفة عضو ضعيفة أو جزئية ؛ 3 = انخفاض معدل أو شدة الانقباض ، ولكن وظيفة الجهاز متجانسة ؛ 4 = الأذين الأمثل وتقلص البطين (120-160 نبضة / دقيقة). تم تصنيف النتيجة 3 أو 4 على أنها ناجحة. تم استخدام التقييم الجسي للكسب غير المشروع من متبرع بالبطن لمراقبة صلاحية الكسب غير المشروع بين النقاط الزمنية لتقييم تخطيط صدى القلب.
معدل نجاح الوفيات وجدوى الكسب غير المشروع
تم تقديم الإجراء إلى فريق جراحي جديد في مركز الدراسة بين أكتوبر 2022 وديسمبر 2022 ، وتم إجراء 19 عملية زرع قلب فئران غير متجانسة لحديثي الولادة في مركز الدراسة خلال هذه الفترة. كان معدل البقاء على قيد الحياة على الفور 79 ٪ ، وكان معدل نجاح الكسب غير المشروع (عرض قلب متبرع نابض ونابض) 84 ٪. يتم عرض خصائص الإجراء في الجدول 3.
من بين ال 12 الباقية على قيد الحياة ، تطلب 2 القتل الرحيم قبل نقطة نهاية الدراسة لمدة أسبوعين ، و 1 بسبب العلوص (ن = 1) ، والآخر بسبب الألم غير المخفف بمسكنات الألم (ن = 1) ، و 2 تم القتل الرحيم عن طريق التصميم بعد أسبوع واحد من الجراحة.
في ثلاثة فئران ، زادت درجة ستانفورد المعدلة المطبقة من 3 إلى 4 بين التصنيف البصري الفوري بعد الجراحة وتقييم تخطيط صدى القلب على POD 1. من بين الفئران الثمانية الباقية على قيد الحياة في نقطة النهاية لمدة 14 يوما ، كانت درجات ستانفورد المعدلة في تخطيط صدى القلب أربعة لسبعة وثلاثة لحيوان واحد. كان السبب الأكثر شيوعا للوفاة في هذه السلسلة هو فشل الدورة الدموية بسبب فقدان الدم المفرط نتيجة للقلب غير الناضج للغاية ، وبالتالي الأوعية المانحة الهشة للمفاغرة أو أوقات التخدير الطويلة.
التقييم النسيجي لأنسجة EFE
بعد القتل الرحيم CO2 للفأر المتلقي ، تم إجراء إعادة فتح البطن تحت إعداد معقم. تم استئصال الكسب غير المشروع للمتبرع ووضعه على الفور في محلول ملحي فسيولوجي على الجليد لمزيد من المعالجة. تم استئصال شريحة أفقية على مستوى منتصف البطين من البطين الأيمن والأيسر ، ووضعها في وسط تضمين درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وتجميدها في النيتروجين السائل (الشكل 4 أ). تم تجميد جميع الأنسجة الأخرى باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها في مجمد -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 4B-D).
تم إجراء التلوين الكيميائي المناعي كمعيار ذهبي لتحديد EndMT باستخدام 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (أزرق) ، VE-Cadherin كعلامة بطانية (أحمر) ، و α-SMA كعلامة للخلايا الليفية (أخضر). كما تم تلطيخ بروتينات SMAD المفسفرة وعامل النسخ SLUG / SNAIL في أنسجة EFE (الشكل 5A-E) 3،20.
الشكل 1: رف مائل للتنبيب. يتم وضع الجرذ على ظهره ، مع تثبيت الأسنان الأمامية بخيط والرأس متجها نحو الجراح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منظر طويل المحور لتخطيط صدى القلب للجهد المنخفض (أ) قلب الجرذ الأصلي يشير إلى امتلاء طبيعي أثناء الانبساط. (ب) الكسب غير المشروع المانح مع ركود التدفق داخل الجهد المنخفض. انخفاض حجم التحميل أثناء الانبساط. الاختصارات: LV = البطين الأيسر. MV = الصمام التاجي ؛ LVOT = مجرى تدفق البطين الأيسر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مفاغرة وتقييم EFE. (أ) دراسة دوبلر ملونة لتخطيط صدى القلب تشير إلى مفاغرة شريانية (سهم أحمر) ووريدي (سهم أزرق). (B ، C): سطح شغاف ساطع بالصدى داخل تجويف LV يدل على EFE (الأسهم البيضاء). الاختصارات: LV = البطين الأيسر. EFE = داء ليفي شغافي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقييم الأنسجة العيانية والمجهرية . (أ) المقطع العرضي للبطين الأوسط من خلال الجهد المنخفض و RV. تشير الأسهم البيضاء نحو نسيج EFE. ب: الهيماتوكسيلين-يوزين، ج: ثلاثي الألوان لماسون (MTS)، د: تلطيخ الإيلاستين فان جيسون. يشير التكبير الكبير إلى أن نسيج EFE (الأسهم السوداء) يحتوي على كميات عالية من الكولاجين المنظم (الأزرق في MTS) وألياف الإيلاستين (الأسود في EVG). الاختصارات: LV = البطين الأيسر. RV = البطين الأيمن. EFE = داء ليفي شغافي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة بين الصور النسيجية والمناعية. أ: تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين. (ب-ه) تلطيخ مناعي كيميائي. أنسجة EFE مزدوجة اللون ل (B ، C) VE-Cadherin و α-SMA ، (D) CD31 و phospho-SMAD2 / SMAD3 (موضعية مع النوى الملطخة ب DAPI باللون الأزرق) ، و (E) CD31 و SLUG / SNAIL (موضعية مع النوى الملطخة ب DAPI باللون الأزرق) ، تدل على EndMT ، كما هو موضح في الأسهم البيضاء. الاختصارات: LV = البطين الأيسر. EFE = داء ليفي شغافي ؛ EndMT = الانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 لتر من الماء المقطر المعقم | |
| كلوريد الصوديوم | 118 ملليمول/لتر |
| ككل | 22 ملليمول/لتر |
| KH2PO4 | 1.2 ملليمول/لتر |
| مغسو 4 | 1.2 ملليمول/لتر |
| هيدروكسي الصوديوم 3 | 25 ملليمول/لتر |
| الجلوكوز | 11 ملليمول/لتر |
| CaCl2 | 2.5 ملليمول/لتر |
الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت Krebs-Henseleit المعدل. يتم تحضير محلول شلل القلب عالي البوتاسيوم (22 مليمول / لتر KCl) وتعقيمه بالفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
| حالات الفشل الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها | ||
| لا يبدأ الكسب غير المشروع في النبض / لا تمتلئ الشرايين التاجية بعد تحرير المشابك | تحقق من تكوين الخثرة في مفاغرة الشرايين | |
| تحقق من وقت نقص التروية (= إجمالي وقت الاعتقال) (يجب ألا يتجاوز 100 دقيقة) | ||
| وقت الاستيقاظ الطويل أو الفئران لا تستيقظ بعد الجراحة | مراقبة قوة النبض وتكراره أثناء الجراحة وتقليل استنشاق الأيزوفلوران ، إذا كانت ديناميكا الدم ضعيفة | |
| الأمعاء الحية أو الميتة بعد العملية الجراحية مباشرة مشبوهة لانخفاض ديناميكا الدم أثناء العملية غالبا بسبب وقت التخدير الطويل | ||
| ضعف ديناميكا الدم مباشرة بعد بضع البطن | ضبط تدفق الأيزوفلوران للتخدير | |
| تقييم التنبيب وحركة الصدر المناسبة: التنبيب من جانب واحد ، استرواح الصدر ، تجويف القصبة الهوائية المسدود هي حالات فشل شائعة في البداية. | ||
| يستيقظ الجرذ لكنه يموت في أول 24 ساعة | فقدان الدم على نطاق واسع أثناء الجراحة | |
| إذا تم العثور على كمية متزايدة من الدم عند تشريح الجثة في البطن ، فمن المرجح أن يكون ذلك بسبب فشل مفاغرة | ||
الجدول 2: حالات الفشل الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تعد المراقبة الشاملة وإعادة تقييم الإجراءات غير الناجحة أمرا بالغ الأهمية لتحقيق معدل بقاء مرتفع في هذا النموذج.
| وزن الفئران المتلقي بالجرام ، المتوسط [IQR] | 150 [50] |
| عمر المتبرع بالأيام، المتوسط [IQR] | 3 [1] |
| وزن المتبرع بالجرام، المتوسط [IQR] | 9 [2] |
| وقت نقص تروية الكسب غير المشروع بالدقائق ، الوسيط [IQR] | 100 [25] |
| معدل نجاح ما بعد الجراحة ، ن | 16/19 (= 84٪) |
الجدول 3: خصائص الإجراء. اختيار المتلقي والمتبرع ، ووقت نقص تروية الكسب غير المشروع ، ومعدل البقاء على قيد الحياة. الاختصار: IQR = المدى الربيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يخلق هذا النموذج الحيواني للزرع غير المتجانس لقلب فأر متبرع حديث الولادة في بطن المتلقي إمكانية دراسة التليف المشتق من EndMT من خلال تقييم الأنسجة النسيجي المفصل ، وتحديد مسارات الإشارات التنظيمية ، وخيارات علاج الاختبار. نظرا لأن EndMT هي الآلية الأساسية للأمراض الليفية للقلب ، فإن هذا النموذج له قيمة كبيرة في مجال جراحة القلب للأطفال وخارجها. في هذا النموذج ، يمكن أن تؤثر العديد من العوامل سلبا على نتيجة الإجراء. وبالتالي ، فإن التعامل السليم مع الأنسجة الهشة للغاية بسبب عدم نضج قلب المتبرع ، والتعامل السليم مع أثناء التخدير ، ومهارات الجراحة المجهرية عالية المستوى هي متطلبات أساسية لنجاح هذا النموذج. يجب استخدام الإعداد الفني الأمثل ، بما في ذلك المجهر الجراحي ، وجهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة ، وأدوات الجراحة المجهرية ، عند إجراء هذه التجارب. على الرغم من أنه ليس ضروريا ، إلا أن المراقبة الأساسية لمعدل ضربات القلب أو درجة حرارة الجسم يمكن أن تكون مفيدة ، خاصة بالنسبة للجراحين عديمي الخبرة ، من أجل مراقبة ديناميكا الدم وعمق التخدير.
تشمل الجوانب الجراحية المهمة التي يجب وضعها في الاعتبار عدم نضج قلوب المتبرعين حديثي الولادة ، مما يجعل الأنسجة هشة للغاية ويترك الشريان الأورطي الصاعد والجذع الرئوي عرضة للتمزق. وبالتالي ، ينبغي إجراء أي معالجة بعناية فائقة. بسبب الأوعية الصغيرة المستخدمة في مفاغرة ، يوصى بإجراء مفاغرة شريانية مع غرز متقطعة وتدفق متقطع لموقع مفاغرة بمحلول ملحي هيبارين ، مما يساعد على تجنب تكوين الجلطة. مطلوب اختيار الفئران حديثي الولادة ذات العمر المناسب للتغلب على مشكلة استخدام قلوب غير ناضجة للغاية ، وبالتالي ، معرضة بشدة لتمزق المفاغرة. من ناحية أخرى ، بعد عمر معين يبلغ حوالي 7 أيام ، لم يعد من الممكن إظهار EndMT بشكل متكرر في هذا النموذج الحيواني15.
تم تحديد EndMT كآلية مركزية لأنواع مختلفة من تليف القلب وتصلب الشرايين ، ولكن تم إعاقة البحث بسبب نقص النماذج 8 في الجسم الحي. تقتصر التطورات الرئيسية في مجال أبحاث EndMT على نماذج زراعة الخلايا ، والتي لها قيود متأصلة3،8،9. علاوة على ذلك ، فإن الدراسات التي أجريت على الخلايا البطانية الشغاف أكثر تقييدا. كبديل ، غالبا ما تستخدم الخلايا البطانية للشريان التاجي كبديل ، حيث تم الإبلاغ عن أنها تنشأ جزئيا من خلايا الشغاف21. وبالتالي ، يمكن استخدام هذا النموذج الحيواني ليس فقط للتليف القلبي ولكن لدراسة الآليات المرضية المهمة ل EndMT الناجم عن التدفق في تصلب الشرايين. بالنسبة لأمراض القلب الخلقية ، أظهرنا القدرة على إعادة إنتاج الانتقال من الشغاف الصحي إلى أنسجة EFE من خلال EndMT في نموذج الفئران الخاص بنا ، مع EFE الذي يشبه هيكليا أنسجة EFE البشرية. هناك بعض الجدل حول الأصل الخلوي لخلايا اللحمة المتوسطة داخل أنسجة EFE. أفاد كلارك وآخرون 22 أن خلايا النخاب تساهم في EFE ، لكن بياناتنا أشارت إلى أن غالبية أنسجة EFE مشتقة من خلال الخلايا البطانية الشغاف التي تخضع ل EndMT3. تجري حاليا تجارب على مستوى خلية واحدة للتأكد من الأصل الخلوي لأنسجة EFE.
من خلال هذا النموذج في الجسم الحي ، يمكن دراسة المسارات التنظيمية ل EndMT. ثبت أن عدم التوازن ، وتحديدا الزيادة في مسار TGF-ß وضعف إشارات البروتين المورفولوجي العظمي (BMP) ، يلعب دورا رئيسيا في خلايا الشغاف التي تعبر عن عوامل النسخ التي تنظم EndMT. بدلا من ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن إشارات Jagged / NOTCH و Wnt / ß-Catenin للحث على EndMT 3,23. يحفز مسار TGF-ß تنشيط عوامل النسخ مثل SLUG و SNAIL و TWIST عبر بروتينات SMAD ، وبالتالي تنظيم EndMT20,24. في هذا النموذج الحيواني ، تمكنا من تلخيص هذه الآليات ، والتي تم تأكيدها من خلال تلطيخ الكيمياء المناعية.
العوامل المحفزة للتليف الناجم عن EndMT في هذا النموذج الحيواني هي عدم النضج وركود التدفق ، في حين تم تصميم نماذج أخرى للحث على EndMT من خلال التعديلات الجينية أو ارتفاع ضغط الدم أو القيود الغذائية 9,25. بالمقارنة مع الأنواع الأخرى ، فإن الفئران الوليدية غير ناضجة للغاية عند الولادة ، وبالتالي فهي عرضة بشكل خاص للخضوع ل EndMT.
لقد استخدمنا نحن وآخرون الفئران لدراسة أصول EFE بشكل أفضل من خلال تتبع النسب المعدل وراثيا ، ولكن يجب مناقشة العديد من القيود 3,22. أولا ، نظرا لتعقيد النموذج ، تكون معدلات الوفيات أعلى في الفئران مقارنة بالفئران ، وعرض EFE أكثر تغايرا ؛ لذلك ، فإن نموذج الفئران أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. تعتبر مقاييس تخطيط صدى القلب ضرورية لتقييم وظيفة الكسب غير المشروع طوال فترة الدراسة ، وقد أظهرنا أنه من خلال هذه التدابير ، بالإضافة إلى تقييم نبض وسالكية المفاغرة ، يمكن أيضا دراسة وظيفة الكسب غير المشروع والانقباض. مع المزيد من الخبرة ، يمكن إجراء تحليلات أكثر تقدما للقلب المزروع ، مثل تحليل إجهاد LV ، في نماذج الفئران. من غير الواضح حاليا ما إذا كان يمكن إحداث نفس الحالة الفيزيولوجية المرضية في الكبيرة بخلاف القوارض ، وهذا يتطلب مزيدا من التحقيق.
في الختام ، يحاكي هذا النموذج الحيواني للأطفال المرض البشري ل EndMT ويمكن أن يكون مفيدا لتحديد تنظيم EndMT ودراسة التدخلات الدوائية لتثبيط هذه العملية المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل مشاريع إضافية - صندوق أبحاث البطين الواحد (SVRF) وصندوق توسيع البطين الواحد (إلى I.F.) ومنحة ماريتا بلاو من OeAD-GmbH من الأموال المقدمة من الوزارة الفيدرالية النمساوية للتعليم والعلوم والبحوث BMBWFC (إلى G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
