Summary
Ce travail présente un modèle animal de fibrose induite par la transition endothéliale à mésenchymateuse, tel qu’il est observé dans les malformations cardiaques congénitales telles que la sténose aortique critique ou le syndrome hypoplasique du cœur gauche, ce qui permet une évaluation histologique détaillée des tissus, l’identification des voies de signalisation régulatrices et le test des options de traitement.
Abstract
La fibroélastose endocardique (EFE), définie par l’accumulation de tissu sous-endocardique, a des impacts majeurs sur le développement du ventricule gauche (VG) et empêche les patients atteints de sténose aortique critique congénitale et de syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS) d’une réparation chirurgicale anatomique biventriculaire curative. La résection chirurgicale est actuellement la seule option thérapeutique disponible, mais l’EFE récidive souvent, parfois avec un schéma de croissance encore plus infiltrant dans le myocarde adjacent.
Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de l’EFE et d’explorer des stratégies thérapeutiques, un modèle animal adapté aux essais précliniques a été développé. Le modèle animal tient compte du fait que l’EFE est une maladie du cœur immature et qu’elle est associée à des troubles de l’écoulement, comme le confirment les observations cliniques. Ainsi, la transplantation cardiaque hétérotopique de cœurs de donneurs de rats nouveau-nés est à la base de ce modèle.
Un cœur de rat nouveau-né est transplanté dans l’abdomen d’un rat adolescent et relié à l’aorte infrarouge et à la veine cave inférieure du receveur. Alors que la perfusion des artères coronaires préserve la viabilité du cœur du donneur, la stagnation du flux dans le VG induit la croissance de l’EFE dans le cœur très immature. Le mécanisme sous-jacent de la formation d’EFE est la transition des cellules endothéliales endocardiques vers les cellules mésenchymateuses (EndMT), qui est un mécanisme bien décrit du développement embryonnaire précoce des valves et des septa, mais aussi la principale cause de fibrose dans l’insuffisance cardiaque. La formation d’EFE peut être observée macroscopiquement dans les jours qui suivent la transplantation. L’échocardiographie transabdominale est utilisée pour surveiller la viabilité du greffon, la contractilité et la perméabilité des anastomoses. Après l’euthanasie, le tissu EFE est prélevé et il présente les mêmes caractéristiques histopathologiques que le tissu EFE humain des patients HLHS.
Ce modèle in vivo permet d’étudier les mécanismes de développement de l’EFE dans le cœur et de tester des options de traitement pour prévenir cette formation de tissu pathologique et offre la possibilité d’un examen plus généralisé de la fibrose induite par EndMT.
Introduction
La fibroélastose endocardique (EFE), définie par l’accumulation de collagène et de fibres élastiques dans le tissu sous-endocardique, se présente sous la forme d’un endocarde épaissi nacré ou opaque ; La croissance de l’EFE est la plus active pendant la période fœtale et la petite enfance1. Dans une étude d’autopsie, 70 % des cas de syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS) étaient associés à la présence d’EFE2.
Les cellules exprimant des marqueurs pour les fibroblastes constituent la principale population cellulaire de l’EFE, mais ces cellules expriment également de manière concomitante des marqueurs endothéliaux endocardiques, ce qui est une indication de l’origine de ces cellules EFE. Notre groupe a précédemment établi que le mécanisme sous-jacent de la formation d’EFE implique un changement phénotypique des cellules endothéliales endocardiques en fibroblastes par la transition endothéliale-mésenchymateuse (EndMT)3. EndMT peut être détecté à l’aide d’une double coloration immunohistochimique pour les marqueurs endothéliaux tels que le cluster de différenciation (CD) 31 ou l’endothélium vasculaire (VE)-cadhérine (CD144) et les marqueurs fibroblastiques (par exemple, l’actine du muscle lisse alpha, α-SMA). De plus, nous avons également précédemment établi le rôle régulateur de la voie TGF-ß dans ce processus avec l’activation des facteurs de transcription SLUG, SNAIL et TWIST3.
EndMT est un processus physiologique qui se produit au cours du développement cardiaque embryonnaire et conduit à la formation des septa et des valves à partir des coussinets endocardiques4, mais il provoque également une fibrose d’organe dans l’insuffisance cardiaque, la fibrose rénale ou le cancer et joue un rôle clé dans l’athérosclérose vasculaire 5,6,7,8. EndMT dans la fibrose cardiaque est principalement régulée par la voie TGF-β, comme nous l’avons rapportéavec d’autres 3,9. Divers stimuli ont été décrits pour induire EndMT : inflammation 10, hypoxie 11, altérations mécaniques 12 et troubles de l’écoulement, y compris des altérations du flux sanguin intracavitaire 13, et EndMT peut également être une conséquence d’une maladie génétique 14.
Ce modèle animal a été développé en utilisant les composants clés du développement de l’EFE cardiaque, qui sont l’immaturité et les altérations du flux sanguin intracavitaire, en particulier la stagnation du flux. L’immaturité a été comblée par l’utilisation de cœurs de rats nouveau-nés comme donneurs, car les rats nouveau-nés sont connus pour être immatures sur le plan du développement immédiatement après la naissance. La transplantation cardiaque hétérotopique offrait la possibilité de restreindre le débit intracavitaire15.
D’un point de vue clinique, ce modèle animal permet de mieux étudier l’impact d’EndMT sur le ventricule gauche (VG) en croissance. La restriction de croissance imposée au cœur fœtal et néonatal par la formation d’EFE induite par EndMT16 empêche les patients présentant des obstructions des voies d’écoulement ventriculaire gauche (LVOTO) telles que la sténose aortique critique congénitale et le syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS) de la réparation chirurgicale biventriculaire anatomique curative17. Ce modèle animal facilite l’étude des mécanismes cellulaires et de la régulation de la formation tissulaire grâce à EndMT et permet de tester des options de traitement pharmacologique 3,18.
L’échocardiographie transabdominale est utilisée pour surveiller la viabilité du greffon, la contractilité et la perméabilité des anastomoses. Après l’euthanasie, la formation d’EFE peut être observée macroscopiquement dans les 3 jours suivant la transplantation. Le tissu EFE présente les mêmes caractéristiques histopathologiques que le tissu EFE humain de patients atteints de LVOTO.
Par conséquent, ce modèle animal, bien que développé pour une utilisation pédiatrique dans le spectre de HLHS, peut être appliqué lors de l’étude de diverses maladies basées sur le mécanisme moléculaire d’EndMT.
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Protocol
Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément au Conseil national de recherches du Canada. 2011. Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire : huitième édition. Les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital pour enfants de Boston.
Avant l’intervention chirurgicale, tous les instruments chirurgicaux sont autoclavés à la vapeur et un tampon de Krebs-Henseleit modifié, avec une concentration finale de 22 mmol/L de KCl, est préparé sous forme de solution cardioplégique (tableau 1). La solution est stérilisée par filtre et stockée à 4 °C pendant la nuit. Un microscope chirurgical (12,5x) est nécessaire pour la procédure de transplantation cardiaque néonatale hétérotopique chez le rat.
1. Préparation et anesthésie
- Utilisez des rats Lewis mâles/femelles d’un poids d’environ 150 g (5-6 semaines) comme receveurs.
- Pour commencer, rasez généreusement l’abdomen du rat avec un rasoir.
- Placez le rat dans une chambre d’isoflurane et allumez le débit d’oxygène à 2 L/min avec 2 % d’isoflurane jusqu’à ce que l’animal soit correctement sédaté mais qu’il respire encore spontanément. Injecter 45 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale (IP), ainsi que 300 U/kg d’héparine. Confirmez l’anesthésie appropriée avec un test de pincement des orteils.
REMARQUE : Surveillez attentivement la respiration spontanée et la fréquence cardiaque par palpation de la poitrine pour assurer un état hémodynamique stable tout au long du processus. - Pour l’intubation, placez le rat sur une étagère oblique (Figure 1), fixez les dents de devant avec une ficelle et placez la tête face au chirurgien.
- Placez la lumière à l’extérieur du cou sur la zone des cordes vocales, saisissez la langue avec deux doigts et poussez-la légèrement vers le haut et vers la gauche pour offrir une vision optimale pour l’intubation. Utilisez une canule de 18 g et 2 pouces pour un rat de 100 à 150 g. Fixez la sonde intratrachéale avec du ruban adhésif.
REMARQUE : Les loupes chirurgicales avec un grossissement de 3,5x sont recommandées pour l’intubation. - Connectez la canule d’intubation au ventilateur pour petits animaux et ajustez les paramètres selon les instructions du fabricant en fonction de la taille de l’animal.
REMARQUE : Utilisez les paramètres suivants pour un rat de 150 g : mode volume ; fréquence respiratoire, 55/min ; volume courant, 1,3 mL 50 % I/E, mais cela peut être ajusté de manière appropriée au besoin. Assurez-vous d’un mouvement thoracique bilatéral et égal et administrez l’isoflurane en continu à raison de 0,5 % à 2 % à l’aide du ventilateur. - Placez le rat sur un coussin chauffant (pour maintenir une température corporelle normale) en décubitus dorsal, la queue tournée vers le chirurgien. Stérilisez l’abdomen trois fois avec une solution de bétadine et 70% d’éthanol en alternance. Administrez un lubrifiant oculaire et couvrez le rat d’un champ chirurgical stérile, en laissant l’abdomen découvert.
2. Préparation chirurgicale et transplantation hétérotopique du cœur néonatal du donneur chez le rat receveur
- Effectuez une laparotomie médiane à l’aide d’un scalpel à 15 lames pour l’incision cutanée et utilisez des ciseaux pour ouvrir la paroi abdominale antérieure, suivie d’une exposition contondante de l’aorte abdominale rétropéritonéale et de la veine cave inférieure (IVC) avec des applicateurs à embout de coton.
- Mobilisez les intestins (y compris le côlon descendant) et placez-les vers le quadrant supérieur droit. Couvrez les intestins avec de la gaze chaude imbibée de sérum physiologique. Utiliser des écarteurs pour assurer une exposition optimale de la CIV et de l’aorte abdominale.
- Effectuer une dissection contondante de la IVC infrarouge et de l’aorte abdominale vers la bifurcation. Licenciez toutes les artères et veines ramifiées infrarouges (par exemple, l’artère mésentérique inférieure et les artères ganglionnaires) avec une suture en nylon 10-0.
REMARQUE : Il existe une grande variabilité dans l’anatomie de ces branches latérales. Surveillez visuellement le pouls et la fréquence cardiaque de l’aorte lorsqu’aucune autre surveillance hémodynamique n’est disponible. Évaluez la profondeur appropriée de l’anesthésie toutes les 15 minutes à l’aide d’un test de pincement des orteils. Ajustez la concentration d’isoflurane en conséquence. - Une fois que le cœur du donneur a été prélevé sur un rat nouveau-né, délivrer le cœur excisé dans des conditions stériles dans un bassin chirurgical contenant un tampon de Krebs-Henseleit au champ opératoire. Irriguer le cœur du donneur par intermittence avec une solution cardioplégique glacée.
REMARQUE : Lorsqu’un deuxième chirurgien est disponible, le cœur doit être préparé en même temps, car un deuxième chirurgien réduit le temps total d’anesthésie de l’animal receveur et le temps d’ischémie du cœur du donneur. Lorsqu’un deuxième chirurgien n’est pas disponible, couvrez l’abdomen du receveur avec du sérum physiologique chaud et surveillez l’animal pendant la procédure de prélèvement. - Appliquer quatre petites pinces vasculaires atraumatiques sur les segments distaux et proximaux de l’aorte infrarouge et de la CIV. Si nécessaire, occlure temporairement un vaisseau rénal défavorable avec une suture en soie 7-0 et relâchez la suture après l’intervention. Placez une suture en nylon 10-0 verticalement sur la paroi antérieure de l’aorte pour faciliter l’aortomie. Effectuez une aortotomie avec deux petites incisions horizontales (en forme de coin) avec des microciseaux en tirant légèrement sur la suture.
REMARQUE : Pour éliminer les caillots sanguins, il est recommandé de rincer la lumière aortique avec une solution saline héparinisée. - Placez le cœur du donneur sur le côté gauche (du point de vue de l’animal) de l’aorte et fixez l’aorte infrarouge du receveur et l’aorte ascendante du donneur côte à côte aux positions 12 heures et 6 heures de l’aortotomie avec des sutures. Continuez avec les troisième et quatrième sutures aux positions 3 heures et 9 heures, en retournant doucement le cœur sur le côté droit de l’aorte après la troisième suture. Complétez l’anastomose artérielle en ajoutant une ou deux sutures à chaque espace intercalaire.
REMARQUE : Il faut prendre soin d’éviter de toucher l’aorte ascendante du donneur ou l’aorte abdominale du receveur avec des forceps lors de la création de l’anastomose afin d’éviter d’endommager les tissus. - Faites pivoter le rat dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, la tête tournée vers la main gauche du chirurgien. Déplacez l’aorte du donneur vers le côté gauche de l’aorte abdominale pour permettre une vision optimale sur la CIV.
- Réaliser une veinotomie sur la CIV, légèrement proximale de l’anastomose aortique, à l’aide d’une lame 11 pour ponction et de microciseaux pour un ajustement adéquat de la taille en fonction du diamètre du tronc pulmonaire du donneur. Encore une fois, rincez la lumière intracave avec une solution saline héparinisée.
- Commencez par l’anastomose veineuse entre la CIV du receveur et le tronc pulmonaire du donneur, ce qui est mieux réalisé en plaçant des sutures en nylon 11-0 interrompues sur la paroi arrière du vaisseau, en commençant par les positions 12 heures et 6 heures (liées à la IVC), puis placez une suture continue en nylon 11-0 sur la paroi avant (de 6 heures à 12 heures).
- Recouvrez les anastomoses avec de petites bandes d’éponge de gélatine résorbable et retirez les pinces microvasculaires en commençant distalement. À l’aide d’un applicateur coton-tige, comprimer légèrement les éponges afin d’obtenir une hémostase optimale.
- Observez le remplissage des vaisseaux coronaires du greffon au moment de la libération des pinces microvasculaires distales et assurez-vous que le cœur du donneur commence à battre immédiatement lorsque la pince proximale est relâchée.
REMARQUE : La viabilité du greffon peut être notée de 0 à 4 en peropératoire selon un score de Stanford modifiéde 19 pour confirmer une fonction adéquate du greffon. - Replacez les intestins dans l’abdomen en veillant à ne pas déformer l’anastomose artérielle et veineuse.
- Administrer du méloxicam (1 mg/kg) et de l’ethiqa XR (0,65 mg/kg) par voie sous-cutanée pendant que l’animal est complètement anesthésié pour vérifier l’analgésie postopératoire. Ensuite, fermez la paroi abdominale avec une suture vicryl résorbable 5-0 continue avant de fermer la peau avec une suture vicryl résorbable 6-0 par voie intracutanée.
REMARQUE : Des conseils concernant les défaillances courantes et le dépannage sont présentés dans le Tableau 2.
3. Prélèvement du cœur du donneur néonatal
- Placez le rat donneur nouveau-né dans une chambre insufflée avec de l’isoflurane (2%) pour la sédation. Administrer de la kétamine (75 mg/kg) et de la xylazine (5 mg/kg), ainsi que de l’héparine (300 U/kg) par voie intrapéritonéale.
- Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils et placez le rat en décubitus dorsal avec la queue tournée vers vous. Stérilisez l’ensemble du thorax et de la paroi abdominale avec de la bétadine et de l’éthanol à 70 % trois fois en alternance. Recouvrez le rat d’un champ chirurgical stérile.
- À l’aide d’un microscope chirurgical 12,5x, retirez toute la paroi thoracique antérieure en commençant par une incision horizontale à l’aide d’un scalpel à 15 lames au niveau du xyphoïde, suivie d’incisions verticales latéralement jusqu’aux aisselles des deux côtés avec des ciseaux. La paroi thoracique antérieure peut ensuite être enlevée en continuant avec une autre incision horizontale juste sous le cou.
- Disséquez l’IVC, les veines caves supérieures droite et gauche et les vaisseaux pulmonaires avec des ciseaux, puis encerclez et ligaturez tous les vaisseaux avec une suture en soie 7-0. Administrer 3 mL de solution de Krebs-Henseleit modifiée glacée et riche en potassium dans l’oreillette droite en ponctionnant la CIV avec une aiguille de 30 G et en poussant légèrement le diaphragme vers le bas avec une pince.
- Coupez le CIV, les CVS, les vaisseaux pulmonaires et l’aorte avec des ciseaux. Transectez les artères pulmonaires aussi loin que possible et l’aorte distale au tronc brachiocéphale pour assurer la bonne longueur à l’aide d’un scalpel à 11 lames.
- Séparez le tronc pulmonaire et l’aorte ascendante à l’aide de microciseaux et rincez le cœur avec une solution cardioplégique glacée à l’aide d’une seringue de 3 ml.
4. Récupération du receveur et suivi du greffon
- Après la chirurgie, donnez au rat suffisamment de temps pour se réveiller, ce qui se produit généralement dans une fenêtre de temps de 15 minutes, et laissez-le récupérer sur un coussin chauffant.
REMARQUE : Aucun antibiotique n’est nécessaire en raison du très faible risque d’infection et afin de ne pas compromettre le modèle expérimental, et aucune restriction à la nourriture ou à l’eau n’est appliquée. - Après la transplantation, surveillez quotidiennement la fonction du greffon par palpation du cœur transplanté, mais considérez que cela peut parfois être difficile à évaluer en raison de la superposition intestinale.
REMARQUE : L’échocardiographie abdominale permet de mesurer plus précisément la viabilité du greffon. Pour l’échocardiographie, sédatif légèrement le rat avec de l’isoflurane (1 à 2 %) inhalé par un cône nasal et placez-le sur un coussin chauffant. L’échocardiographie est généralement réalisée le jour postopératoire (POD) 1, POD 7 et POD 14. Pour permettre l’évaluation de la fréquence cardiaque et de la contractilité, on peut facilement obtenir des vues sur les grands axes et les petits axes (Figure 2A, B). Pour évaluer les anastomoses, utiliser l’échocardiographie Doppler (Figure 3A) et confirmer la formation de tissu EFE sous la forme d’une couche endocardique écho-brillante dans la cavité ventriculaire gauche (Figure 3B, C).
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Representative Results
Viabilité et battement des greffons
Dans ce travail, la viabilité du greffon a été évaluée visuellement après que toutes les pinces aient été retirées, et un temps de reperfusion approximatif de 10 à 15 minutes a été autorisé avec un abdomen ouvert pour l’observation du greffon. Le même système de notation pour vérifier objectivement la viabilité du greffon a été utilisé pour l’évaluation visuelle à la fin de la chirurgie et pour l’échocardiographie sur les POD 1, POD 7 et POD 14.
0 = pas de fonction d’organe ; 1 = fonction des organes (au repos), contraction minimale seulement ; 2 = fonction d’organe faible ou partielle ; 3 = vitesse ou intensité contractile réduite, mais fonction homogène des organes ; 4 = contraction optimale de l’oreillette et du ventricule (120-160 battements/min). Un score de 3 ou 4 a été considéré comme un succès. L’évaluation palpatoire du greffon de donneur abdominal a été utilisée pour surveiller la viabilité du greffon entre les moments de l’évaluation échocardiographique.
Taux de mortalité et de viabilité des greffons
La procédure a été présentée à une nouvelle équipe chirurgicale du centre d’étude entre octobre 2022 et décembre 2022, et 19 transplantations cardiaques hétérotopiques néonatales de rats ont été réalisées au centre d’étude au cours de cette période. Le taux de survie opératoire immédiate était de 79 % et le taux de réussite de la viabilité du greffon (avec un cœur de donneur viable et battant) était de 84 %. Les caractéristiques de la procédure sont présentées dans le tableau 3.
Parmi les 12 animaux survivants, 2 ont eu besoin d’une euthanasie avant le critère d’évaluation de l’étude de 2 semaines, 1 en raison d’un iléus (n = 1) et l’autre en raison d’une douleur non soulagée par des analgésiques (n = 1), et 2 ont été euthanasiés par conception 1 semaine après la chirurgie.
Chez trois rats, le score de Stanford modifié appliqué est passé de 3 à 4 entre la notation visuelle postopératoire immédiate et l’évaluation échocardiographique sur POD 1. Parmi les huit rats survivants au point final de 14 jours, les scores modifiés de Stanford à l’échocardiographie étaient de quatre pour sept animaux et de trois pour un animal. La cause la plus fréquente de décès dans cette série était l’insuffisance hémodynamique due à une perte de sang excessive due à un cœur très immature et, par conséquent, à la fragilité des vaisseaux du donneur pour l’anastomose ou les longs temps d’anesthésie.
Évaluation histologique du tissu EFE
Après l’euthanasie au CO2 du rat receveur, une re-laparotomie a été réalisée sous préparation stérile. Le greffon du donneur a été excisé et immédiatement placé dans une solution saline physiologique sur de la glace pour un traitement ultérieur. Une tranche horizontale a été réséquée au niveau du ventricule moyen des ventricules droit et gauche, placée dans un milieu d’enrobage à température de coupe optimale (OCT) et congelée dans de l’azote liquide (Figure 4A). Tous les autres tissus ont été congelés avec de l’azote liquide et conservés dans un congélateur à −80 °C pour une analyse plus approfondie. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope inversé (figure 4B-D).
La coloration immunohistochimique en tant qu’étalon-or pour identifier l’EndMT a été réalisée en utilisant le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu), la VE-Cadhérine comme marqueur endothélial (rouge) et le α-SMA comme marqueur de fibroblastes (vert). Les protéines SMAD phosphorylées et le facteur de transcription SLUG/SNAIL ont également été colorés dans le tissu EFE (Figure 5A-E)3,20.
Figure 1 : Tablette oblique pour l’intubation. Le rat est placé sur le dos, les dents de devant fixées par une ficelle et la tête tournée vers le chirurgien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Vue échocardiographique du grand axe du VG. (A) Cœur de rat natif indiquant un remplissage normal pendant la diastole. (B) Greffon donneur avec stagnation du flux dans le VG. Diminution de la charge volumique pendant la diastole. Abréviations : LV = ventricule gauche ; MV = valve mitrale ; LVOT = voie d’écoulement ventriculaire gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Anastomoses et évaluation de l’EFE. (A) Etude Doppler couleur échocardiographique indiquant des anastomoses artérielles (flèche rouge) et veineuses (flèche bleue) persistantes. (B,C) : Surface endocardique écho-brillante à l’intérieur de la cavité VG indiquant l’EFE (flèches blanches). Abréviations : LV = ventricule gauche ; EFE = fibroélastose endocardique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Évaluation macroscopique et microscopique des tissus. (A) Coupe transversale ventriculaire moyenne à travers le VG et le RV. Les flèches blanches pointent vers le tissu EFE. (B) l’hématoxyline-éosine, (C) le trichrome de Masson (MTS) et (D) la coloration à l’élastine de van Gieson (EVG). Le grand grossissement indique que le tissu EFE (flèches noires) contient de grandes quantités de collagène organisé (bleu dans le MTS) et de fibres d’élastine (noir dans l’EVG). Abréviations : LV = ventricule gauche ; RV = ventricule droit ; EFE = fibroélastose endocardique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Comparaison des images histologiques et immunohistologiques. (A) Coloration à l’hématoxyline-éosine. (B-E) Coloration immunohistochimique ; Tissu EFE doublement coloré pour (B,C) VE-Cadhérine et α-SMA, (D) CD31 et phospho-SMAD2/SMAD3 (colocalisé avec les noyaux colorés avec DAPI en bleu), et (E) CD31 et SLUG/SNAIL (colocalisés avec les noyaux colorés avec DAPI en bleu), indiquant EndMT, comme indiqué par les flèches blanches. Abréviations : LV = ventricule gauche ; EFE = fibroélastose endocardique ; EndMT = transition endothélio-mésenchymateuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| 1 litre d’eau distillée stérilisée | |
| NaCl | 118 mmol/L |
| Kcl | 22 mmol/L |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| Le MgSO4 | 1,2 mmol/L |
| NaHCO3 | 25 mmol/L |
| Glucose | 11 mmol/L |
| CaCl2 | 2,5 mmol/L |
Tableau 1 : Composition de la zone tampon de Krebs-Henseleit modifiée. Une solution cardioplégique à haute teneur en potassium (22 mmol/L de KCl) est préparée, stérilisée par filtre et conservée à 4 °C pendant la nuit.
| Défaillances courantes et dépannage | ||
| Le greffon ne commence pas à battre/les artères coronaires ne se remplissent pas après avoir relâché les pinces | Vérifier la formation de thrombus au niveau de l’anastomose artérielle | |
| Vérifiez le temps d’ischémie (= temps total d’arrêt) (ne doit pas dépasser 100 minutes) | ||
| Temps de réveil prolongé ou le rat ne se réveille pas après la chirurgie | Surveillez la force et la fréquence du pouls pendant la chirurgie et réduisez l’inhalation d’isoflurane, si l’hémodynamique est faible | |
| Les intestins livides ou nécrotiques postopératoires immédiats sont suspectés d’une réduction de l’hémodynamique peropératoire, souvent due à un long temps d’anesthésie | ||
| Hémodynamique faible juste après la laparotomie | Ajuster le débit d’isoflurane pour l’anesthésie | |
| Évaluez l’intubation et le bon mouvement de la poitrine : l’intubation unilatérale, le pneumothorax, l’obstruction de la lumière endotrachéale sont des échecs courants au début. | ||
| Le rat se réveille mais meurt dans les premières 24 heures | Perte de sang importante pendant la chirurgie | |
| Si une augmentation de la quantité de sang est trouvée à l’autopsie dans l’abdomen, cela est probablement dû à l’échec de l’anastomose | ||
Tableau 2 : Défaillances courantes et dépannage. Un suivi approfondi et une réévaluation des procédures infructueuses sont essentiels pour atteindre un taux de survie élevé dans ce modèle.
| Poids du rat receveur en grammes, médiane [IQR] | 150 [50] |
| Âge du donneur en jours, médiane [IQR] | 3 [1] |
| Poids du donneur en grammes, médiane [IQR] | 9 [2] |
| Temps d’ischémie du greffon en minutes, médiane [IQR] | 100 [25] |
| Taux de réussite postopératoire, n | 16/19 (=84%) |
Tableau 3 : Caractéristiques de la procédure. Sélection du receveur et du donneur, temps d’ischémie du greffon et taux de survie. Abréviation : IQR = intervalle interquartile.
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Discussion
Ce modèle animal de transplantation hétérotopique d’un cœur de rat donneur néonatal dans l’abdomen du receveur permet d’étudier la fibrose dérivée d’EndMT grâce à une évaluation histologique détaillée des tissus, d’identifier les voies de signalisation régulatrices et de tester les options de traitement. Étant donné que EndMT est le mécanisme sous-jacent des maladies fibrotiques du cœur, ce modèle a une grande valeur dans le domaine de la chirurgie cardiaque pédiatrique et au-delà. Dans ce modèle, de nombreux facteurs peuvent influencer négativement le résultat de la procédure. Ainsi, une manipulation correcte du tissu très fragile en raison de l’immaturité du cœur du donneur, une manipulation correcte de l’animal pendant l’anesthésie et des compétences microchirurgicales de haut niveau sont des exigences de base pour le succès de ce modèle. Une configuration technique optimale, comprenant un microscope chirurgical, un ventilateur pour petits animaux et des instruments microchirurgicaux, doit être utilisée lors de la réalisation de ces expériences. Bien qu’elle ne soit pas essentielle, une surveillance de base de la fréquence cardiaque ou de la température corporelle pourrait être bénéfique, en particulier pour les chirurgiens inexpérimentés, afin de surveiller l’hémodynamique et la profondeur de l’anesthésie.
Parmi les aspects chirurgicaux importants à prendre en compte, citons l’immaturité des cœurs des donneurs nouveau-nés, qui rend le tissu très fragile et rend l’aorte ascendante et le tronc pulmonaire vulnérables aux déchirures. Ainsi, toute manipulation doit être effectuée avec le plus grand soin. En raison des petits vaisseaux utilisés pour l’anastomose, il est recommandé d’effectuer une anastomose artérielle avec des points de suture interrompus et un rinçage intermittent du site d’anastomose avec une solution saline héparinisée, ce qui permet d’éviter la formation de thrombus. La sélection de rats nouveau-nés d’âge approprié est nécessaire pour surmonter le problème de l’utilisation de cœurs trop immatures et, par conséquent, très sensibles à la rupture de l’anastomose. D’autre part, après un certain âge d’environ 7 jours, EndMT ne peut plus être montré de manière reproductible dans ce modèle animal15.
EndMT a été identifié comme le mécanisme central de divers types de fibrose cardiaque et d’athérosclérose, mais la recherche a été entravée en raison d’un manque de modèles in vivo 8. Les principaux développements dans le domaine de la recherche EndMT se limitent aux modèles de culture cellulaire, qui ont des limites inhérentes 3,8,9. De plus, les études sur les cellules endothéliales endocardiques sont encore plus restreintes. Comme alternative, les cellules endothéliales de l’artère coronaire sont souvent utilisées comme substitut, car il a été rapporté qu’elles proviennent en partie de cellules endocardiques21. Par conséquent, ce modèle animal peut être utilisé non seulement pour la fibrose cardiaque, mais aussi pour étudier d’importants mécanismes pathopathologiques de l’EndMT induite par le flux dans l’athérosclérose. Pour les cardiopathies congénitales, nous avons montré la capacité de reproduire la transition de l’endocarde sain au tissu EFE via EndMT dans notre modèle de rat, avec EFE qui ressemble structurellement au tissu EFE humain. Il existe une certaine controverse concernant l’origine cellulaire des cellules mésenchymateuses dans le tissu EFE. Clark et al.22 ont rapporté que les cellules épicardiques contribuent à l’EFE, mais nos données indiquent que la majorité des tissus EFE sont dérivés des cellules endothéliales endocardiques subissant EndMT3. Des expériences au niveau d’une seule cellule sont actuellement en cours pour déterminer l’origine cellulaire du tissu EFE.
Grâce à ce modèle in vivo, les voies de régulation d’EndMT peuvent être étudiées. Il a été démontré qu’un déséquilibre, en particulier une augmentation de la voie TGF-ß et une altération de la signalisation des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), joue un rôle majeur dans les cellules endocardiques exprimant des facteurs de transcription régulant EndMT. Alternativement, la signalisation Jagged/NOTCH et Wnt/ß-caténine ont également été rapportées pour induire EndMT 3,23. La voie TGF-ß induit l’activation de facteurs de transcription tels que SLUG, SNAIL, et TWIST via les protéines SMAD, régulant ainsi EndMT20,24. Dans ce modèle animal, nous avons pu récapituler ces mécanismes, qui ont été confirmés par coloration immunohistochimique.
Les facteurs stimulants de la fibrose induite par EndMT dans ce modèle animal sont l’immaturité et la stagnation du flux, alors que d’autres modèles sont conçus pour induire l’EndMT par le biais de modifications génétiques, d’hypertension ou de restrictions alimentaires 9,25. Par rapport à d’autres espèces, les rats nouveau-nés sont très immatures à la naissance et, par conséquent, ils sont particulièrement susceptibles de subir une MTEND.
Avec d’autres, nous avons utilisé des souris pour mieux étudier les origines de l’EFE via le traçage de lignées transgéniques, mais plusieurs limites doivent être discutées 3,22. Premièrement, en raison de la complexité du modèle, les taux de mortalité sont plus élevés chez les souris que chez les rats, et la présentation de l’EFE est plus hétérogène ; Par conséquent, le modèle RAT est plus fiable et reproductible. Les mesures échocardiographiques sont cruciales pour évaluer la fonction du greffon tout au long de la période d’étude, et nous avons montré qu’avec ces mesures, en plus d’évaluer la pulsatilité et la perméabilité des anastomoses, la fonction du greffon et la contractilité peuvent également être étudiées. Avec plus d’expérience, des analyses encore plus avancées du cœur transplanté, telles que l’analyse de la souche du VG, pourraient être effectuées sur des modèles de rats. Il n’est actuellement pas clair si le même état physiopathologique peut être induit chez des animaux plus grands autres que les rongeurs, et cela nécessite des recherches plus approfondies.
En conclusion, ce modèle animal pédiatrique imite la maladie humaine d’EndMT et peut être utile pour déterminer la régulation d’EndMT et pour étudier des interventions pharmacologiques visant à inhiber ce processus pathologique.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) et Single Ventricle Expansion Fund (to I.F.) et une bourse Marietta Blau de l’OeAD-GmbH à partir de fonds fournis par le ministère fédéral autrichien de l’Éducation, de la Science et de la Recherche BMBWFC (à G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
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