Summary
In dieser Arbeit wird ein Tiermodell der endothelial-mesenchymalen Transitions-induzierten Fibrose vorgestellt, wie sie bei angeborenen Herzfehlern wie der kritischen Aortenstenose oder dem hypoplastischen Linksherzsyndrom auftritt, das eine detaillierte histologische Gewebebewertung, die Identifizierung regulatorischer Signalwege und die Erprobung von Behandlungsoptionen ermöglicht.
Abstract
Die endokardiale Fibroelastose (EFE), definiert durch subendokardiale Gewebeakkumulation, hat große Auswirkungen auf die Entwicklung des linken Ventrikels (LV) und schließt Patienten mit angeborener kritischer Aortenstenose und hypoplastischem Linksherzsyndrom (HLHS) von einer kurativen anatomischen biventrikulären chirurgischen Reparatur aus. Die chirurgische Resektion ist derzeit die einzige verfügbare Therapieoption, aber die EFE kommt häufig wieder vor, manchmal mit einem noch infiltrativeren Wachstumsmuster in das angrenzende Myokard.
Um die zugrundeliegenden Mechanismen der EFE besser zu verstehen und therapeutische Strategien zu erforschen, wurde ein für präklinische Tests geeignetes Tiermodell entwickelt. Das Tiermodell berücksichtigt, dass es sich bei EFE um eine Erkrankung des unreifen Herzens handelt, die mit Strömungsstörungen einhergeht, was durch klinische Beobachtungen belegt wird. Somit ist die heterotope Herztransplantation von neonatalen Rattenspenderherzen die Grundlage für dieses Modell.
Ein neugeborenes Rattenherz wird in den Bauch einer jugendlichen Ratte transplantiert und mit der Nebennierenaorta und der unteren Hohlvene des Empfängers verbunden. Während die Perfusion der Koronararterien die Lebensfähigkeit des Spenderherzens erhält, induziert die Stagnation des Flusses innerhalb des LV ein EFE-Wachstum im sehr unreifen Herzen. Der zugrundeliegende Mechanismus der EFE-Bildung ist der Übergang von endokardialen Endothelzellen zu mesenchymalen Zellen (EndMT), der ein gut beschriebener Mechanismus der frühen embryonalen Entwicklung der Klappen und Septen ist, aber auch die Hauptursache für Fibrose bei Herzinsuffizienz. Die EFE-Bildung kann innerhalb von Tagen nach der Transplantation makroskopisch beobachtet werden. Die transabdominelle Echokardiographie wird verwendet, um die Lebensfähigkeit, Kontraktilität und Durchgängigkeit der Anastomosen zu überwachen. Nach der Euthanasie wird das EFE-Gewebe entnommen und weist die gleichen histopathologischen Merkmale auf wie menschliches EFE-Gewebe von HLHS-Patienten.
Dieses In-vivo-Modell ermöglicht es, die Mechanismen der EFE-Entwicklung im Herzen zu untersuchen und Behandlungsoptionen zu testen, um diese pathologische Gewebebildung zu verhindern, und bietet die Möglichkeit für eine allgemeinere Untersuchung der EndMT-induzierten Fibrose.
Introduction
Die endokardiale Fibroelastose (EFE), die durch die Ansammlung von Kollagen und elastischen Fasern im subendokardialen Gewebe definiert ist, zeigt sich als perlmuttartiges oder undurchsichtiges verdicktes Endokard; EFE durchläuft das aktivste Wachstum während der fetalen Periode und im frühen Säuglingsalter1. In einer Autopsiestudie waren 70% der Fälle mit hypoplastischem Linksherzsyndrom (HLHS) mit dem Vorhandensein von EFE2 assoziiert.
Zellen, die Marker für Fibroblasten exprimieren, sind die Hauptzellpopulation bei EFE, aber diese Zellen exprimieren gleichzeitig auch endokardiale Endothelmarker, was ein Hinweis auf die Herkunft dieser EFE-Zellen ist. Unsere Gruppe hat bereits zuvor festgestellt, dass der zugrundeliegende Mechanismus der EFE-Bildung eine phänotypische Veränderung von endokardialen Endothelzellen zu Fibroblasten durch einen endothelialen zu mesenchymalen Übergang (EndMT)3 beinhaltet. EndMT kann mittels immunhistochemischer Doppelfärbung für Endothelmarker wie Cluster of Differentiation (CD) 31 oder vaskuläres Endothel (VE)-Cadherin (CD144) und Fibroblastenmarker (z. B. Alpha-Glattmuskel-Aktin, α-SMA) nachgewiesen werden. Darüber hinaus haben wir bereits die regulatorische Rolle des TGF-ß-Signalwegs in diesem Prozess mit der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren SLUG, SNAIL und TWIST3 nachgewiesen.
EndMT ist ein physiologischer Prozess, der während der embryonalen Herzentwicklung auftritt und zur Bildung der Septen und Klappen aus endokardialen Polstern führt4, aber auch Organfibrose bei Herzinsuffizienz, Nierenfibrose oder Krebs verursacht und eine Schlüsselrolle bei vaskulärer Atherosklerose spielt 5,6,7,8. EndMT bei Herzfibrose wird hauptsächlich über den TGF-β-Signalweg reguliert, wie wir und andere berichtet haben 3,9. Es wurden verschiedene Stimuli beschrieben, die EndMT induzieren: Entzündung 10, Hypoxie11, mechanische Veränderungen 12 und Flussstörungen, einschließlich Veränderungen des intrakavitären Blutflusses 13, und EndMT kann auch eine Folge einer genetischen Erkrankungsein 14.
Dieses Tiermodell wurde unter Verwendung der Schlüsselkomponenten der kardialen EFE-Entwicklung entwickelt, nämlich Unreife und Veränderungen des intrakavitären Blutflusses, insbesondere Flussstagnation. Die Unreife wurde durch die Verwendung von neugeborenen Rattenherzen als Spender erfüllt, da bekannt ist, dass neugeborene Ratten unmittelbar nach der Geburt entwicklungsunreif sind. Die heterotope Herztransplantation bot die Möglichkeit einer intrakavitären Flussrestriktion15.
Aus klinischer Sicht ermöglicht dieses Tiermodell eine bessere Untersuchung des Einflusses von EndMT auf die wachsende linke Herzkammer (LV). Die Wachstumseinschränkung, die dem fetalen und neonatalen Herzen durch die EndMT-induzierte EFE-Bildung auferlegt wird16, schließt Patienten mit linksventrikulären Ausflusstraktobstruktionen (LVOTO) wie angeborener kritischer Aortenstenose und hypoplastischem Linksherzsyndrom (HLHS) von einer kurativen anatomischen biventrikulären chirurgischen Reparatur aus17. Dieses Tiermodell erleichtert die Untersuchung der zellulären Mechanismen und der Regulation der Gewebebildung durch EndMT und ermöglicht die Erprobung pharmakologischer Behandlungsoptionen 3,18.
Die transabdominelle Echokardiographie wird verwendet, um die Lebensfähigkeit, Kontraktilität und Durchgängigkeit der Anastomosen zu überwachen. Nach der Euthanasie kann die EFE-Bildung innerhalb von 3 Tagen nach der Transplantation makroskopisch beobachtet werden. EFE-Gewebe zeigt die gleichen histopathologischen Merkmale wie humanes EFE-Gewebe von Patienten mit LVOTO.
Daher kann dieses Tiermodell, obwohl es für den pädiatrischen Einsatz im Spektrum des HLHS entwickelt wurde, bei der Untersuchung verschiedener Krankheiten angewendet werden, die auf dem molekularen Mechanismus von EndMT basieren.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Nationalen Forschungsrat durchgeführt. 2011. Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren: Achte Auflage. Die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Boston Children's Hospital geprüft und genehmigt.
Vor der Operation werden alle chirurgischen Instrumente dampfautoklaviert und modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer mit einer Endkonzentration von 22 mmol/L KCl als kardioplegikerische Lösung hergestellt (Tabelle 1). Die Lösung wird filtersterilisiert und über Nacht bei 4 °C gelagert. Ein Operationsmikroskop (12,5x) ist für die heterotope neonatale Rattenherztransplantation erforderlich.
1. Vorbereitung und Anästhesie
- Verwenden Sie männliche/weibliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von ca. 150 g (5-6 Wochen alt) als Empfänger.
- Zu Beginn rasierst du den Bauch der Ratte großzügig mit einem Rasiermesser.
- Setzen Sie die Ratte in eine Isofluran-Kammer und schalten Sie den Sauerstofffluss mit 2 l/min mit 2 % Isofluran ein, bis das Tier ordnungsgemäß sediert ist, aber immer noch spontan atmet. Injizieren Sie 45 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin intraperitoneal (IP) sowie 300 E/kg Heparin. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie mit einem Zehenklemmtest.
HINWEIS: Überwachen Sie sorgfältig die Spontanatmung und die Herzfrequenz durch Abtasten des Brustkorbs, um einen stabilen hämodynamischen Status während des gesamten Prozesses zu gewährleisten. - Für die Intubation legen Sie die Ratte auf ein schräges Regal (Abbildung 1), sichern Sie die Vorderzähne mit einer Schnur und legen Sie den Kopf in Richtung des Chirurgen.
- Platzieren Sie das Licht an der Außenseite des Halses im Bereich der Stimmbänder, greifen Sie die Zunge mit zwei Fingern und drücken Sie sie leicht nach oben und links, um eine optimale Sicht für die Intubation zu gewährleisten. Verwenden Sie eine 18 G, 2 Zoll Kanüle für eine 100-150 g Ratte. Befestigen Sie den Intratrachealtubus mit Klebeband.
HINWEIS: Für die Intubation werden chirurgische Lutschen mit 3,5-facher Vergrößerung empfohlen. - Schließen Sie die Intubationskanüle an das Kleintierbeatmungsgerät an und passen Sie die Einstellungen gemäß den Anweisungen des Herstellers an die Tiergröße an.
HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für eine 150-g-Ratte: Lautstärkemodus; Atemfrequenz, 55/min; Tidalvolumen, 1,3 ml 50 % I/E-Verhältnis, kann jedoch bei Bedarf entsprechend angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass der Brustkorb richtig beidseitig und gleichmäßig bewegt wird, und verabreichen Sie Isofluran kontinuierlich mit 0,5 % bis 2 % über das Beatmungsgerät. - Legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen (um die normale Körpertemperatur aufrechtzuerhalten) in Rückenlage mit dem Schwanz in Richtung des Chirurgen. Sterilisieren Sie den Bauch dreimal abwechselnd mit Betadinlösung und 70% Ethanol. Verabreichen Sie Augengleitmittel und bedecken Sie die Ratte mit einem sterilen chirurgischen Tuch, wobei der Bauch unbedeckt bleibt.
2. Chirurgische Vorbereitung und heterotope Transplantation des neonatalen Spenderherzens in der Empfängerratte
- Führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie mit einem 15-Klingen-Skalpell für den Hautschnitt durch und verwenden Sie eine Schere, um die vordere Bauchdecke zu öffnen, gefolgt von einer stumpfen Freilegung der retroperitonealen Bauchschlagader und der unteren Hohlvene (IVC) mit Wattespitzenapplikatoren.
- Mobilisieren Sie den Darm (einschließlich des absteigenden Dickdarms) und platzieren Sie ihn in Richtung des rechten oberen Quadranten. Bedecke den Darm mit warmer, in Kochsalzlösung getränkter Gaze. Verwenden Sie Retraktoren, um eine optimale Freilegung der IVC und der Bauchaorta zu gewährleisten.
- Führen Sie eine stumpfe Dissektion der infrarenalen IVC und der abdominalen Aorta bis zur Bifurkation durch. Ligatieren Sie alle infrarenalen verzweigten Arterien und Venen (z. B. Arteria mesenterica inferior und Lymphknotenarterien) mit einer 10-0-Nylonnaht.
HINWEIS: Es gibt eine große Variabilität in der Anatomie dieser Seitenäste. Überwachen Sie den Puls und die Herzfrequenz der Aorta visuell, wenn keine andere hämodynamische Überwachung verfügbar ist. Beurteilen Sie die richtige Anästhesietiefe alle 15 Minuten durch einen Zehenklemmtest. Stellen Sie die Isofluran-Konzentration entsprechend ein. - Nachdem das Spenderherz einer neugeborenen Ratte entnommen wurde, wird das herausgeschnittene Herz unter sterilen Bedingungen in einem Operationsbecken mit Krebs-Henseleit-Puffer in das Operationsfeld gebracht. Spülen Sie das Spenderherz intermittierend mit eiskalter kardioplegischer Lösung.
HINWEIS: Wenn ein zweiter Chirurg zur Verfügung steht, sollte das Herz gleichzeitig vorbereitet werden, da ein zweiter Chirurg die Gesamtanästhesiezeit des Empfängertieres und die Ischämiezeit des Spenderherzens verkürzt. Wenn kein zweiter Chirurg zur Verfügung steht, bedecken Sie den Bauch des Empfängers mit warmer Kochsalzlösung und überwachen Sie das Tier während der Entnahme. - Legen Sie vier kleine atraumatische Gefäßklemmen an den distalen und proximalen Segmenten der infrarenalen Aorta und der IVC an. Falls erforderlich, verschließen Sie vorübergehend ein ungünstiges Nierengefäß mit einer 7-0-Seidennaht und lösen Sie die Naht nach dem Eingriff. Platzieren Sie eine 10-0-Nylonnaht vertikal an der Vorderwand der Aorta, um die Aortotomie zu erleichtern. Führen Sie eine Aortotomie mit zwei kleinen horizontalen Schnitten (keilförmig) mit einer Mikroschere durch, indem Sie die Naht leicht nach oben ziehen.
HINWEIS: Um Blutgerinnsel zu entfernen, wird empfohlen, das Aortenlumen mit heparinisierter Kochsalzlösung zu spülen. - Platzieren Sie das Spenderherz auf der linken Seite (aus der Perspektive des Tieres) der Aorta und sichern Sie die infrarenale Aorta des Empfängers und die aufsteigende Aorta des Spenders an der 12-Uhr- und 6-Uhr-Position der Aortotomie mit Nähten. Fahren Sie mit der dritten und vierten Naht an der 3-Uhr- und 9-Uhr-Position fort und drehen Sie das Herz nach der dritten Naht vorsichtig auf die rechte Seite der Aorta. Schließen Sie die arterielle Anastomose ab, indem Sie jedem Zwischenraum ein bis zwei Nähte hinzufügen.
HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass bei der Erstellung der Anastomose weder die aufsteigende Aorta des Spenders noch die Bauchaorta des Empfängers mit einer Pinzette berührt wird, um Gewebeschäden zu vermeiden. - Drehen Sie die Ratte gegen den Uhrzeigersinn, wobei der Kopf zur linken Hand des Chirurgen zeigt. Verschieben Sie die Aorta des Spenders auf die linke Seite der Bauchschlagader, um eine optimale Sicht auf die IVC zu ermöglichen.
- Führen Sie eine Venotomie an der IVC durch, die sich leicht in der Nähe der Aortenanastomose befindet, mit einer 11-Klinge für die Punktion und einer Mikroschere für eine angemessene Größenanpassung entsprechend dem Durchmesser des Lungenrumpfes des Spenders. Spülen Sie das intrakavale Lumen erneut mit heparinisierter Kochsalzlösung.
- Beginnen Sie mit der venösen Anastomose zwischen der IVC des Empfängers und dem Lungenrumpf des Spenders, die am besten erreicht wird, indem unterbrochene 11-0-Nylonnähte an der Rückwand des Gefäßes platziert werden, beginnend bei der 12-Uhr- und 6-Uhr-Position (bezogen auf die IVC), und legen Sie dann eine durchgehende 11-0-Nylonnaht an der Vorderwand (von der 6-Uhr-Position zur 12-Uhr-Position).
- Decken Sie die Anastomosen mit kleinen Streifen eines resorbierbaren Gelatineschwamms ab und entfernen Sie die mikrovaskulären Klemmen beginnend distal. Verwenden Sie einen Wattestäbchen-Applikator, um die Schwämme leicht zu komprimieren, um eine optimale Hämostase zu erhalten.
- Beobachten Sie, wie sich die Koronargefäße des Transplantats zum Zeitpunkt des Lösens der distalen mikrovaskulären Klemmen füllen, und stellen Sie sicher, dass das Spenderherz sofort zu schlagen beginnt, wenn die proximale Klemme gelöst wird.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit des Transplantats kann intraoperativ auf einer Skala von 0 bis 4 gemäß einem modifizierten Stanford-Scorevon 19 bewertet werden, um eine angemessene Transplantatfunktion zu bestätigen. - Legen Sie den Darm zurück in den Bauchraum, indem Sie darauf achten, die arterielle und venöse Anastomose nicht zu verzerren.
- Meloxicam (1 mg/kg) und Ethiqa XR (0,65 mg/kg) subkutan verabreichen, während das Tier vollständig betäubt ist, um die postoperative Analgesie festzustellen. Verschließen Sie dann die Bauchdecke mit einer kontinuierlichen 5-0 resorbierbaren Vicryl-Naht, bevor Sie die Haut mit einer 6-0 resorbierbaren Vicryl-Naht intrakutan verschließen.
HINWEIS: Anleitungen zu häufigen Fehlern und zur Fehlerbehebung finden Sie in Tabelle 2.
3. Entnahme des Spenderherzens für Neugeborene
- Die neugeborene Spenderratte wird zur Sedierung in eine mit Isofluran (2%) insufflierte Kammer gegeben. Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) sowie Heparin (300 U/kg) intraperitoneal verabreichen.
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen zusammendrücken, und legen Sie die Ratte in Rückenlage, wobei der Schwanz zu Ihnen zeigt. Sterilisieren Sie den gesamten Thorax und die Bauchdecke dreimal abwechselnd mit Betadin und 70% Ethanol. Decken Sie die Ratte mit einem sterilen OP-Tuch ab.
- Entfernen Sie mit einem 12,5-fachen Operationsmikroskop die gesamte vordere Brustwand, indem Sie mit einem horizontalen Schnitt mit einem 15-Klingen-Skalpell am Xyphoid beginnen, gefolgt von vertikalen Schnitten seitlich bis zu den Achselhöhlen auf beiden Seiten mit einer Schere. Die vordere Brustwand kann dann entfernt werden, indem ein weiterer horizontaler Schnitt direkt unter dem Hals durchgeführt wird.
- Sezieren Sie die IVC, die rechte und linke obere Hohlvene und die Lungengefäße mit einer Schere und umkreisen und ligieren Sie dann alle Gefäße mit einer 7-0-Seidennaht. Verabreichen Sie 3 ml eiskalte, kaliumreich modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung in den rechten Vorhof, indem Sie den IVC mit einer 30-G-Nadel punktieren und das Zwerchfell mit einer Zange leicht nach unten drücken.
- Schneiden Sie die IVC, SVCs, Lungengefäße und Aorta mit einer Schere. Durchtrennen Sie die Lungenarterien so weit wie möglich und die Aorta distal des Truncus brachiocephalic, um die richtige Länge mit einem 11-Klingen-Skalpell sicherzustellen.
- Trennen Sie den Lungenstamm und die aufsteigende Aorta mit einer Mikroschere und spülen Sie das Herz mit einer 3-ml-Spritze mit eiskalter kardioplegikerischer Lösung.
4. Rückgewinnung des Empfängers und Überwachung des Transplantats
- Geben Sie der Ratte nach der Operation ausreichend Zeit, um aufzuwachen, was normalerweise in einem Zeitfenster von 15 Minuten geschieht, und lassen Sie sie sich auf einem Heizkissen erholen.
HINWEIS: Aufgrund des sehr geringen Infektionsrisikos und um das Versuchsmodell nicht zu gefährden, sind keine Antibiotika erforderlich, und es wird keine Beschränkung auf Nahrung oder Wasser angewendet. - Überwachen Sie nach der Transplantation die Transplantatfunktion durch tägliches Abtasten des transplantierten Herzens, aber bedenken Sie, dass dies aufgrund der Darmüberlagerung manchmal schwer zu beurteilen sein kann.
HINWEIS: Die abdominale Echokardiographie kann die Lebensfähigkeit des Transplantats genauer messen. Für die Echokardiographie wird die Ratte mit Isofluran (1-2%), das durch einen Nasenkegel eingeatmet wird, leicht sediert und auf einem Heizkissen positioniert. Die Echokardiographie wird in der Regel am postoperativen Tag (POD) 1, POD 7 und POD 14 durchgeführt. Um die Herzfrequenz und die Kontraktilität beurteilen zu können, kann man leicht Ansichten der langen und kurzen Achse erhalten (Abbildung 2A, B). Um die Anastomosen zu beurteilen, wird die Doppler-Echokardiographie (Abbildung 3A) verwendet und die Bildung von EFE-Gewebe als echohelle Endokardschicht in der linksventrikulären Höhle bestätigt (Abbildung 3B, C).
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Representative Results
Lebensfähigkeit und Schlagen des Transplantats
In dieser Arbeit wurde die Lebensfähigkeit des Transplantats visuell beurteilt, nachdem alle Klammern entfernt worden waren, und es wurde eine ungefähre Reperfusionszeit von 10-15 Minuten mit offenem Abdomen zur Beobachtung des Transplantats zugelassen. Das gleiche Scoring-System zur objektiven Überprüfung der Transplantatlebensfähigkeit wurde für die visuelle Beurteilung am Ende der Operation und für die Echokardiographie an POD 1, POD 7 und POD 14 verwendet.
0 = keine Organfunktion; 1 = (Ruhe-)Organfunktion, nur minimale Kontraktion; 2 = schwache oder partielle Organfunktion; 3 = reduzierte Kontraktionsrate oder -intensität, aber homogene Organfunktion; 4 = optimale Vorhof- und Ventrikelkontraktion (120-160 Schläge/min). Eine Punktzahl von 3 oder 4 wurde als Erfolg gewertet. Die palpatorische Bewertung des abdominalen Spendertransplantats wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit des Transplantats zwischen den Zeitpunkten der echokardiographischen Beurteilung zu überwachen.
Erfolgsrate von Mortalität und Transplantatlebensfähigkeit
Das Verfahren wurde zwischen Oktober 2022 und Dezember 2022 einem neuen chirurgischen Team im Studienzentrum vorgestellt, und in diesem Zeitraum wurden 19 neonatale heterotope Rattenherztransplantationen im Studienzentrum durchgeführt. Die unmittelbare operative Überlebensrate betrug 79 % und die Erfolgsrate der Transplantatlebensfähigkeit (mit einem lebensfähigen, schlagenden Spenderherzen) lag bei 84 %. Die Merkmale des Verfahrens sind in Tabelle 3 dargestellt.
Von den 12 überlebenden Tieren mussten 2 vor dem 2-wöchigen Studienendpunkt eingeschläfert werden, 1 aufgrund eines Ileus (n = 1) und das andere aufgrund von Schmerzen, die mit Schmerzmitteln nicht gelindert wurden (n = 1), und 2 wurden 1 Woche nach der Operation eingeschläfert.
Bei drei Ratten erhöhte sich der angewandte modifizierte Stanford-Score von 3 auf 4 zwischen der unmittelbaren postoperativen visuellen Bewertung und der echokardiographischen Bewertung von POD 1. Bei den acht überlebenden Ratten am 14-Tage-Endpunkt betrugen die modifizierten Stanford-Werte bei der Echokardiographie vier für sieben Tiere und drei für ein Tier. Die häufigste Todesursache in dieser Serie war ein hämodynamisches Versagen aufgrund eines übermäßigen Blutverlustes als Folge des sehr unreifen Herzens und damit der fragilen Spendergefäße für Anastomose oder lange Anästhesiezeiten.
Histologische Beurteilung von EFE-Gewebe
Nach CO2 -Euthanasie der Empfängerratte wurde eine Re-Laparotomie unter steriler Präparation durchgeführt. Das Spendertransplantat wurde herausgeschnitten und sofort zur weiteren Verarbeitung in eine physiologische Kochsalzlösung auf Eis gelegt. Ein horizontaler Schnitt wurde auf mittelventrikulärer Ebene des rechten und linken Ventrikels reseziert, in Einbettmedium mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) platziert und in flüssigem Stickstoff eingefroren (Abbildung 4A). Alle anderen Gewebe wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur weiteren Analyse in einem Gefrierschrank von −80 °C gelagert. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop aufgenommen (Abbildung 4B-D).
Die immunhistochemische Färbung als Goldstandard zur Identifizierung von EndMT wurde mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blau), VE-Cadherin als Endothelmarker (rot) und α-SMA als Fibroblastenmarker (grün) durchgeführt. Phosphorylierte SMAD-Proteine und der Transkriptionsfaktor SLUG/SNAIL wurden ebenfalls im EFE-Gewebe gefärbt (Abbildung 5A-E)3,20.
Abbildung 1: Schräge Ablage für die Intubation. Die Ratte wird auf den Rücken gelegt, wobei die Vorderzähne mit einer Schnur befestigt sind und der Kopf zum Chirurgen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Echokardiographische Längsachsenansicht des LV . (A) Natives Rattenherz, das eine normale Füllung während der Diastole anzeigt. (B) Spendertransplantat mit Strömungsstagnation innerhalb des LV. Verminderte Volumenbelastung während der Diastole. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel; MV = Mitralklappe; LVOT = linksventrikulärer Ausflusstrakt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Anastomosen und EFE-Bewertung. (A) Echokardiographische Farbdoppler-Studie, die auf offene arterielle (roter Pfeil) und venöse (blauer Pfeil) Anastomosen hinweist. (B,C): Echohelle endokardiale Oberfläche innerhalb der LV-Höhle, die auf EFE hinweist (weiße Pfeile). Abkürzungen: LV = linker Ventrikel; EFE = endokardiale Fibroelastose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Makroskopische und mikroskopische Gewebeauswertung . (A) Mittelventrikulärer Querschnitt durch LV und RV. Die weißen Pfeile zeigen in Richtung des EFE-Gewebes. (B) Hämatoxylin-Eosin, (C) Masson-Trichrom (MTS) und (D) Elastin-van-Gieson-Färbung (EVG). Die große Vergrößerung zeigt an, dass das EFE-Gewebe (schwarze Pfeile) hohe Mengen an organisiertem Kollagen (blau bei MTS) und Elastinfasern (schwarz bei EVG) enthält. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel; RV = rechter Ventrikel; EFE = endokardiale Fibroelastose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleich von histologischen und immunhistologischen Bildern. (A) Hämatoxylin-Eosin-Färbung. (B-E) Immunhistochemische Färbung; EFE-Gewebe doppelt gefärbt für (B,C) VE-Cadherin und α-SMA, (D) CD31 und Phospho-SMAD2/SMAD3 (kolokalisiert mit den mit DAPI gefärbten Zellkernen in blau) und (E) CD31 und SLUG/SNAIL (kolokalisiert mit den mit DAPI gefärbten Kernen in blau), was auf EndMT hinweist, wie durch die weißen Pfeile dargestellt. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel; EFE = endokardiale Fibroelastose; EndMT = Übergang von Endothel zu Mesenchym. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| 1 Liter sterilisiertes, destilliertes Wasser | |
| NaCl | 118 mmol/L |
| Kcl | 22 mmol/L |
| KH2PO4-KARTON | 1,2 mmol/l |
| MgSO4-KARTON | 1,2 mmol/L |
| NaHCO3-KARTON | 25 mmol/L |
| Traubenzucker | 11 mmol/L |
| CaCl2-KARTON | 2,5 mmol/L |
Tabelle 1: Zusammensetzung des modifizierten Krebs-Henseleit-Puffers. Kardioplegiker-Lösung mit hohem Kaliumgehalt (22 mmol/L KCl) wird hergestellt, filtriert und über Nacht bei 4 °C gelagert.
| Häufige Fehler und Fehlerbehebung | ||
| Das Transplantat beginnt nicht zu schlagen / die Koronararterien füllen sich nach dem Lösen der Klammern nicht | Kontrolle auf Thrombusbildung bei arterieller Anastomose | |
| Überprüfung der Ischämiezeit (=Gesamtverhaftungszeit) (sollte 100 Minuten nicht überschreiten) | ||
| Lange Aufwachzeit oder Ratte wacht nach der Operation nicht auf | Überwachen Sie die Pulsstärke und -frequenz während der Operation und reduzieren Sie die Inhalation von Isofluran, wenn die Hämodynamik schwach ist | |
| Unmittelbar postoperative livide oder nekrotische Därme sind verdächtig für eine reduzierte intraoperative Hämodynamik, oft aufgrund einer langen Anästhesiezeit | ||
| Schwache Hämodynamik direkt nach Laparotomie | Isofluran-Fluss für die Anästhesie anpassen | |
| Beurteilen Sie die Intubation und die richtige Bewegung des Brustkorbs: Einseitige Intubation, Pneumothorax, Obstruktion des endotrachealen Lumens sind häufige Fehler am Anfang. | ||
| Ratte wacht auf, stirbt aber in den ersten 24 Stunden | Starker Blutverlust während der Operation | |
| Wenn bei der Autopsie im Bauchraum eine erhöhte Blutmenge festgestellt wird, ist dies höchstwahrscheinlich auf ein Versagen der Anastomose zurückzuführen | ||
Tabelle 2: Häufige Fehler und Fehlerbehebung. Eine gründliche Überwachung und Neubewertung erfolgloser Verfahren ist entscheidend, um in diesem Modell eine hohe Überlebensrate zu erreichen.
| Gewicht der Empfängerratte in Gramm, Median [IQR] | 150 [50] |
| Spenderalter in Tagen, Median [IQR] | 3 [1] |
| Spendergewicht in Gramm, Median [IQR] | 9 [2] |
| Transplantat-Ischämiezeit in Minuten, Median [IQR] | 100 [25] |
| Postoperative Erfolgsrate, n | 16/19 (=84%) |
Tabelle 3: Merkmale des Verfahrens. Auswahl des Empfängers und des Spenders, Ischämiezeit des Transplantats und Überlebensrate. Abkürzung: IQR = Interquartilsabstand.
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Discussion
Dieses Tiermodell der heterotopen Transplantation eines neonatalen Spenderrattenherzens in den Bauch des Empfängers schafft die Möglichkeit, die EndMT-abgeleitete Fibrose durch detaillierte histologische Gewebeauswertung zu untersuchen, regulatorische Signalwege zu identifizieren und Behandlungsoptionen zu testen. Da EndMT der zugrundeliegende Mechanismus für fibrotische Erkrankungen des Herzens ist, hat dieses Modell einen großen Wert im Bereich der pädiatrischen Herzchirurgie und darüber hinaus. In diesem Modell können viele Faktoren das Ergebnis des Eingriffs negativ beeinflussen. Daher sind der richtige Umgang mit dem sehr fragilen Gewebe aufgrund der Unreife des Spenderherzens, der richtige Umgang mit den Tieren während der Anästhesie und ein hohes Maß an mikrochirurgischen Fähigkeiten Grundvoraussetzungen für den Erfolg dieses Modells. Bei der Durchführung dieser Experimente sollte ein optimaler technischer Aufbau mit einem Operationsmikroskop, einem Kleintierbeatmungsgerät und mikrochirurgischen Instrumenten verwendet werden. Obwohl nicht unbedingt erforderlich, kann eine grundlegende Überwachung der Herzfrequenz oder der Körpertemperatur insbesondere für unerfahrene Chirurgen von Vorteil sein, um die Hämodynamik und die Tiefe der Anästhesie zu überwachen.
Zu den wichtigen chirurgischen Aspekten, die es zu beachten gilt, gehört die Unreife der neonatalen Spenderherzen, die das Gewebe sehr zerbrechlich macht und die aufsteigende Aorta und den Lungenstamm anfällig für Risse macht. Daher sollte jede Handhabung mit großer Vorsicht erfolgen. Aufgrund der kleinen Gefäße, die für die Anastomose verwendet werden, wird empfohlen, eine arterielle Anastomose mit unterbrochenen Nähten und intermittierender Spülung der Anastomosenstelle mit heparinisierter Kochsalzlösung durchzuführen, was hilft, die Bildung von Thrombus zu vermeiden. Die Auswahl von entsprechend gealterten neugeborenen Ratten ist erforderlich, um das Problem der Verwendung von Herzen zu überwinden, die zu unreif und daher sehr anfällig für eine Anastomosenruptur sind. Andererseits kann EndMT ab einem bestimmten Alter von ca. 7 Tagen in diesem Tiermodell nicht mehr reproduzierbar nachgewiesen werden15.
EndMT wurde als zentraler Mechanismus für verschiedene Arten von Herzfibrose und Atherosklerose identifiziert, aber die Forschung wurde durch einen Mangel an In-vivo-Modellen behindert8. Die wichtigsten Entwicklungen auf dem Gebiet der EndMT-Forschung beschränken sich auf Zellkulturmodelle, die inhärente Einschränkungen aufweisen 3,8,9. Darüber hinaus sind Studien an endokardialen Endothelzellen noch eingeschränkter. Als Alternative werden häufig Koronararterien-Endothelzellen als Ersatz verwendet, da berichtet wurde, dass sie teilweise aus endokardialen Zellen stammen21. Daher kann dieses Tiermodell nicht nur für die kardiale Fibrose verwendet werden, sondern auch für die Untersuchung wichtiger Pathomechanismen der flow-induzierten EndMT bei Atherosklerose. Bei angeborenen Herzfehlern haben wir gezeigt, dass wir in der Lage sind, den Übergang von gesundem Endokard zu EFE-Gewebe durch EndMT in unserem Rattenmodell zu reproduzieren, wobei EFE strukturell menschlichem EFE-Gewebe ähnelt. Es gibt einige Kontroversen über den zellulären Ursprung von mesenchymalen Zellen innerhalb des EFE-Gewebes. Clark et al.22 berichteten, dass Epikardialzellen zur EFE beitragen, aber unsere Daten deuteten darauf hin, dass der Großteil des EFE-Gewebes von endokardialen Endothelzellen stammt, die EndMT3 durchlaufen. Derzeit laufen Experimente auf Einzelzellebene, um den zellulären Ursprung von EFE-Gewebe zu ermitteln.
Durch dieses In-vivo-Modell können die regulatorischen Pfade von EndMT untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass ein Ungleichgewicht, insbesondere ein Anstieg des TGF-ß-Signalwegs und eine Beeinträchtigung der Signalübertragung des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP), eine wichtige Rolle bei der Expression von Transkriptionsfaktoren spielt, die EndMT regulieren. Alternativ wurde auch berichtet, dass der Jagged/NOTCH-Signalweg und Wnt/ß-Catenin EndMT 3,23 induzieren. Der TGF-ß-Signalweg induziert die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie SLUG, SNAIL und TWIST über SMAD-Proteine und reguliert dadurch EndMT20,24. In diesem Tiermodell konnten wir diese Mechanismen rekapitulieren, die durch immunhistochemische Färbungen bestätigt wurden.
Die stimulierenden Faktoren für die EndMT-induzierte Fibrose in diesem Tiermodell sind Unreife und Strömungsstagnation, während andere Modelle so konzipiert sind, dass sie EndMT durch genetische Veränderungen, Bluthochdruck oder diätetische Einschränkungen induzieren 9,25. Im Vergleich zu anderen Spezies sind neugeborene Ratten bei der Geburt sehr unreif und daher besonders anfällig für EndMT.
Wir und andere haben Mäuse verwendet, um die Ursprünge von EFE durch transgene Abstammungsverfolgung besser zu untersuchen, aber es müssen mehrere Einschränkungen diskutiert werden 3,22. Erstens sind aufgrund der Komplexität des Modells die Sterblichkeitsraten bei Mäusen höher als bei Ratten, und die Darstellung der EFE ist heterogener; Daher ist das Rattenmodell zuverlässiger und reproduzierbarer. Echokardiographische Messungen sind entscheidend für die Beurteilung der Transplantatfunktion während des gesamten Untersuchungszeitraums, und wir haben gezeigt, dass mit diesen Messungen neben der Beurteilung der Pulsatilität und Durchgängigkeit der Anastomosen auch die Transplantatfunktion und die Kontraktilität untersucht werden können. Mit mehr Erfahrung könnten noch weitergehende Analysen des transplantierten Herzens, wie z.B. die Stammanalyse des LV, in Rattenmodellen durchgeführt werden. Es ist derzeit unklar, ob derselbe pathophysiologische Zustand auch bei größeren Tieren als Nagetieren ausgelöst werden kann, und dies erfordert weitere Untersuchungen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses pädiatrische Tiermodell die menschliche Erkrankung von EndMT nachahmt und nützlich sein kann, um die Regulation von EndMT zu bestimmen und pharmakologische Interventionen zur Hemmung dieses pathologischen Prozesses zu untersuchen.
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Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde gefördert durch Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) und Single Ventricle Expansion Fund (to I.F.) sowie ein Marietta Blau Stipendium der OeAD-GmbH aus Mitteln des österreichischen Bundesministeriums für Bildung, Wissenschaft und Forschung BMBWFC (an G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
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