Summary
עבודה זו מציגה מודל חייתי של פיברוזיס המושרה על ידי מעבר אנדותל למזנכימלי, כפי שניתן לראות במומים לבביים מולדים כגון היצרות קריטית של אבי העורקים או תסמונת לב שמאל היפופלסטית, המאפשרת הערכה היסטולוגית מפורטת של רקמות, זיהוי מסלולי איתות רגולטוריים ובדיקת אפשרויות טיפול.
Abstract
לפיברואלסטוזיס אנדוקרדיאלי (EFE), המוגדר על ידי הצטברות רקמות תת-אנדוקרדיאליות, יש השפעות משמעותיות על התפתחות החדר השמאלי (LV) ומונע מחולים עם היצרות מולדת קריטית של אבי העורקים ותסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS) תיקון כירורגי אנטומי דו-חדרי מרפא. כריתה כירורגית היא כיום האפשרות הטיפולית היחידה הזמינה, אך EFE חוזר לעתים קרובות, לפעמים עם דפוס גדילה חודר עוד יותר לתוך שריר הלב הסמוך.
כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הבסיסיים של EFE ולחקור אסטרטגיות טיפוליות, פותח מודל בעלי חיים המתאים לניסויים פרה-קליניים. המודל החייתי לוקח בחשבון כי EFE היא מחלה של הלב הלא בוגר והיא קשורה להפרעות זרימה, כפי שנתמך על ידי תצפיות קליניות. לפיכך, השתלת לב הטרוטופית של לב תורם חולדה בילוד היא הבסיס למודל זה.
לב חולדה ילוד מושתל בבטנה של חולדה מתבגרת ומחובר לאבי העורקים האינפרא-כלייתי ולווריד הנבוב התחתון של הנמען. בעוד זילוח של העורקים הכליליים משמר את הכדאיות של הלב התורם, קיפאון זרימה בתוך LV גורם לצמיחת EFE בלב מאוד לא בוגר. המנגנון הבסיסי של היווצרות EFE הוא המעבר של תאי אנדותל אנדוקרדיאליים לתאים מזנכימליים (EndMT), שהוא מנגנון מתואר היטב של התפתחות עוברית מוקדמת של המסתמים והספטה, אך גם הגורם המוביל לפיברוזיס באי ספיקת לב. היווצרות EFE ניתן לראות באופן מאקרוסקופי בתוך ימים לאחר ההשתלה. אקוקרדיוגרפיה טרנס-בטנית משמשת לניטור כדאיות השתל, התכווצות ופטנט האנסטומוזות. לאחר המתת חסד, רקמת EFE נקצרת, והיא מראה את אותם מאפיינים היסטופתולוגיים כמו רקמת EFE אנושית מחולי HLHS.
מודל in vivo זה מאפשר ללמוד את מנגנוני התפתחות EFE בלב ולבחון אפשרויות טיפול למניעת היווצרות רקמה פתולוגית זו ומספק הזדמנות לבדיקה כללית יותר של פיברוזיס המושרה על ידי EndMT.
Introduction
פיברואלסטוזיס אנדוקרדיאלי (EFE), המוגדר על ידי הצטברות קולגן וסיבים אלסטיים ברקמה התת-אנדוקרדיאלית, מציג כאנדוקרדיום מעובה פניני או אטום; EFE עובר את רוב הגדילה הפעילה במהלך תקופת העובר והינקות המוקדמת1. במחקר נתיחה שלאחר המוות, 70% מהמקרים עם תסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS) היו קשורים לנוכחות של EFE2.
תאים המבטאים סמנים לפיברובלסטים הם אוכלוסיית התאים העיקרית ב-EFE, אך תאים אלה מבטאים במקביל גם סמני אנדותל אנדוקרדיאלים, דבר המהווה אינדיקציה למקורם של תאי EFE אלה. הקבוצה שלנו קבעה בעבר כי המנגנון הבסיסי של היווצרות EFE כרוך בשינוי פנוטיפי של תאי אנדותל אנדוקרדיאליים לפיברובלסטים באמצעות מעבר אנדותל למזנכימלי (EndMT)3. ניתן לזהות EndMT באמצעות צביעה כפולה אימונוהיסטוכימית עבור סמני אנדותל כגון אשכול התמיינות (CD) 31 או אנדותל כלי דם (VE)-קדהרין (CD144) וסמנים פיברובלסטים (למשל, אקטין שריר אלפא-חלק, α-SMA). יתר על כן, קבענו בעבר את התפקיד הרגולטורי של מסלול TGF-ß בתהליך זה עם הפעלת גורמי השעתוק SLUG, SNAIL ו- TWIST3.
EndMT הוא תהליך פיזיולוגי המתרחש במהלך התפתחות הלב העוברית ומוביל להיווצרות הספטה והמסתמים מכריות אנדוקרדיאליות4, אך הוא גם גורם לפיברוזיס איברים באי ספיקת לב, פיברוזיס בכליות או סרטן וממלא תפקיד מפתח בטרשת עורקים וסקולרית 5,6,7,8. EndMT בפיברוזיס לב מוסדר בעיקר באמצעות מסלול TGF-β, כפי שאנו ואחרים דיווחנו 3,9. גירויים שונים תוארו כגורמים ל-EndMT: דלקת 10, היפוקסיה 11, שינויים מכניים 12 והפרעות זרימה, כולל שינויים בזרימת הדם התוך-חללית 13, ו-EndMT עשוי להיות גם תוצאה של מחלה גנטית 14.
מודל בעלי חיים זה פותח באמצעות מרכיבי המפתח של התפתחות EFE לבבית, שהם חוסר בשלות ושינויים של זרימת הדם intracavitary, במיוחד קיפאון זרימה. חוסר הבשלות הושג על ידי שימוש בלבבות חולדות ילודים כתורמים, שכן חולדות יילודים ידועות כלא בשלות מבחינה התפתחותית מיד לאחר הלידה. השתלת לב הטרוטופית הציעה מתן הגבלת זרימה תוך חללית15.
מנקודת מבט קלינית, מודל בעלי חיים זה מאפשר לחקור טוב יותר את ההשפעה של EndMT על החדר השמאלי הגדל (LV). מגבלת הגדילה המוטלת על לב העובר והיילוד באמצעות היווצרות EFE16 הנגרמת על ידי EndMT מונעת מחולים עם חסימות בדרכי זרימת החדר השמאלי (LVOTO) כגון היצרות מולדת קריטית של אבי העורקים ותסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS) מתיקון כירורגי אנטומי אנטומי מרפא17. מודל בעלי חיים זה מאפשר את חקר המנגנונים התאיים וויסות היווצרות רקמות באמצעות EndMT ומאפשר בדיקה של אפשרויות טיפול תרופתי 3,18.
אקוקרדיוגרפיה טרנס-בטנית משמשת לניטור כדאיות השתל, התכווצות ופטנט האנסטומוזות. לאחר המתת חסד, היווצרות EFE ניתן לצפות באופן מקרוסקופי בתוך 3 ימים לאחר ההשתלה. רקמת EFE מראה את אותם מאפיינים היסטופתולוגיים כמו רקמת EFE אנושית מחולים עם LVOTO.
לפיכך, מודל בעלי חיים זה, למרות שפותח לשימוש בילדים בספקטרום של HLHS, יכול להיות מיושם בעת חקר מחלות שונות המבוססות על המנגנון המולקולרי של EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם למועצה הלאומית למחקר. 2011. מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה: מהדורה שמינית. הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים לילדים בבוסטון.
לפני הניתוח, כל כלי הניתוח הם autoclaved קיטור, חיץ Krebs-Henseleit שונה, עם ריכוז סופי של 22 mmol / L KCl, מוכן כמו פתרון cardioplegic (טבלה 1). התמיסה עוברת סינון מעוקר ומאוחסנת בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. מיקרוסקופ כירורגי (12.5x) נדרש להליך השתלת לב חולדה הטרוטופית בילוד.
1. הכנה והרדמה
- השתמשו בחולדות לואיס זכר/נקבות במשקל של כ-150 גרם (גיל 5-6 שבועות) כמושתלים.
- בתור התחלה, גלחו בנדיבות את בטנה של החולדה עם סכין גילוח.
- הכניסו את החולדה לתא איזופלורן, והפעילו את זרימת החמצן ב-2 ליטר/דקה עם 2% איזופלורן עד שבעל החיים מורדם כראוי אך עדיין נושם באופן ספונטני. הזריקו 45 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין תוך צפקי (IP), כמו גם 300 U/kg הפרין. יש לוודא הרדמה תקינה באמצעות בדיקת צביטת בוהן.
הערה: עקוב בקפידה אחר הנשימה הספונטנית וקצב הלב באמצעות מישוש החזה כדי להבטיח מצב המודינמי יציב לאורך כל התהליך. - עבור אינטובציה, הניחו את החולדה על מדף אלכסוני (איור 1), הדקו את השיניים הקדמיות באמצעות חוט, והניחו את הראש פונה לכיוון המנתח.
- הניחו את האור בצד החיצוני של הצוואר על אזור מיתרי הקול, תפסו את הלשון בשתי אצבעות ודחפו אותה מעט כלפי מעלה ושמאלה כדי לספק ראייה אופטימלית לאינטובציה. השתמש 18 גרם, 2 בצינורית עבור 100-150 גרם חולדה. אבטח את הצינור intratracheal עם קלטת.
הערה: לופים כירורגיים עם הגדלה של פי 3.5 מומלצים לאינטובציה. - חברו את צינורית האינטובציה למכונת ההנשמה של בעלי החיים הקטנים, והתאימו את ההגדרות בהתאם להוראות היצרן בהתאם לגודל החי.
הערה: השתמש בהגדרות הבאות עבור חולדה של 150 גרם: מצב עוצמת קול; קצב נשימה, 55/דקה; נפח גאות, 1.3 מ"ל 50% יחס I/E, אך ניתן לכוונן זאת בהתאם לצורך. להבטיח תנועת חזה דו-צדדית תקינה ושווה, ולתת איזופלורן ברציפות ב-0.5%-2% דרך מכונת ההנשמה. - הניחו את החולדה על כרית חימום (כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה) במצב שכיבה כשהזנב פונה לכיוון המנתח. לעקר את הבטן שלוש פעמים עם תמיסת betadine ו 70% אתנול לסירוגין. יש לתת סיכה לעיניים, ולכסות את החולדה עם רפש כירורגי סטרילי, משאיר את הבטן חשופה.
2. הכנה כירורגית והשתלה הטרוטופית של לב תורם היילוד בחולדה הנתרמת
- בצע לפרוטומיה בקו האמצע באמצעות אזמל 15 להבים לחתך העור, והשתמש במספריים כדי לפתוח את דופן הבטן הקדמית, ולאחר מכן חשיפה קהה של אבי העורקים הבטני retroperitoneal ו vena cava נחות (IVC) עם אפליקטורים קצה כותנה.
- גייסו את המעיים (כולל המעי הגס היורד), והניחו אותם לכיוון הרביע העליון הימני. מכסים את המעיים בגזה חמה ספוגה במי מלח. השתמש retractors כדי להבטיח חשיפה אופטימלית של IVC ואבי העורקים הבטן.
- בצע דיסקציה קהה של IVC אינפרא כלייתי ואבי העורקים הבטני כלפי מעלה לכיוון הביפורקציה. קשרו את כל העורקים והוורידים המסתעפים האינפרא-כליתיים (למשל, עורק מזנטרי תחתון ועורקי בלוטות הלימפה) בתפר ניילון 10-0.
הערה: קיימת שונות רבה באנטומיה של ענפים צדדיים אלה. נטר את הדופק והדופק של אבי העורקים באופן חזותי כאשר אין ניטור המודינמי אחר זמין. להעריך את עומק ההרדמה הנכון כל 15 דקות באמצעות בדיקת צביטת בוהן. התאימו את ריכוז האיזופלורן בהתאם. - לאחר שהלב התורם נקצר מחולדה ילודית, העבירו את הלב הנכרת בתנאים סטריליים באגן כירורגי המכיל חיץ קרבס-הנסלייט לשדה הניתוח. השקו את לב התורם לסירוגין בתמיסה קרדיופלגית קרה כקרח.
הערה: כאשר מנתח שני זמין, הלב צריך להיות מוכן באותו זמן, כמו מנתח שני מקטין את זמן ההרדמה הכולל של החיה המקבל ואת זמן איסכמיה של הלב התורם. כאשר מנתח שני אינו זמין, כסו את בטנו של המושתל במי מלח חמים, והשגיחו על בעל החיים במהלך הליך הקציר. - החל ארבעה מלחציים קטנים כלי דם א-טראומטיים על המקטעים הדיסטליים והפרוקסימליים של אבי העורקים האינפרא-כלייתי וה- IVC. במידת הצורך, יש לחסום באופן זמני כלי דם שלילי עם תפר משי 7-0, ולשחרר את התפר לאחר ההליך. מניחים תפר ניילון 10-0 אנכית על הקיר הקדמי של אבי העורקים כדי להקל על אבי העורקים. בצע אבי עורקים עם שני חתכים אופקיים קטנים (בצורת טריז) עם מספריים על ידי משיכה קלה למעלה את התפר.
הערה: כדי להסיר קרישי דם, מומלץ לשטוף את לומן אבי העורקים עם מי מלח heparinized. - הניחו את לב התורם בצד שמאל (מנקודת מבטו של בעל החיים) של אבי העורקים והדקו את אבי העורקים האינפרא-כלייתי של המקבל ואת אבי העורקים העולה של התורם מקצה לצד בעמדות 12 ו-6 של אבי העורקים עם תפרים. ממשיכים עם התפרים השלישי והרביעי בעמדות 3 ו-9, הופכים בעדינות את הלב לצד ימין של אבי העורקים לאחר התפר השלישי. השלם את האנסטומוזה העורקית על ידי הוספת תפר אחד או שניים לכל אינטרספייס.
הערה: יש להקפיד להימנע מלגעת באבי העורקים העולה של התורם או באבי העורקים הבטני של המקבל עם מלקחיים בעת יצירת האנסטומוזה כדי למנוע נזק לרקמות. - סובבו את החולדה נגד כיוון השעון, כשהראש פונה לכיוון ידו השמאלית של המנתח. העבר את אבי העורקים של התורם לצד שמאל של אבי העורקים הבטני כדי לאפשר ראייה אופטימלית על IVC.
- בצע venotomy על IVC, מעט פרוקסימלי אנסטומוזה אבי העורקים, באמצעות להב 11 לנקב ו microscissors להתאמת גודל הולם על פי קוטר של תא המטען הראתי של התורם. שוב, לשטוף את לומן intracaval עם מלוחים heparinized.
- התחל באנסטומוזה הוורידית בין ה- IVC של המקבל לבין גזע הריאה של התורם, אשר מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי הנחת תפרי ניילון קטועים 11-0 על הקיר האחורי של כלי השיט, החל מעמדות השעה 12 ו- 6 (הקשורות ל- IVC), ולאחר מכן הנח תפר ניילון רציף 11-0 על הקיר הקדמי (משעה 6 לכיוון השעה 12).
- מכסים את האנסטומוזות ברצועות קטנות של ספוג ג'לטין נספג, ומסירים את מהדקי כלי הדם המתחילים בצורה דיסטלית. השתמשו באפליקטור קצה כותנה כדי לדחוס קלות את הספוגים לקבלת המוסטאזיס אופטימלי.
- שימו לב למילוי כלי הדם הכליליים של השתל בזמן שחרור המלחציים המיקרו-וסקולריים הדיסטליים, וודאו שהלב התורם מתחיל לפעום מיד עם שחרור המהדק הפרוקסימלי.
הערה: ניתן לדרג את כדאיות השתל מ-0 עד 4 תוך ניתוחית על פי ציון סטנפורד שונה19 כדי לאשר תפקוד השתל הולם. - החזירו את המעיים לבטן על ידי הקפדה שלא לעוות את האנסטומוזה העורקית והוורידית.
- יש לתת מלוקסיקאם (1 מ"ג/ק"ג) ואתיקה XR (0.65 מ"ג/ק"ג) באופן תת-עורי בזמן שהחיה מורדמת במלואה כדי לברר שיכוך כאבים לאחר הניתוח. לאחר מכן, סגור את דופן הבטן עם תפר ויקריל רציף נספג 5-0 לפני סגירת העור עם תפר ויקריל נספג 6-0 תוך עורית.
הערה: הנחיות לגבי כשלים נפוצים ופתרון בעיות מוצגות בטבלה 2.
3. קצירת לב תורם היילוד
- הניחו את החולדה התורמת היילודית בתא עם איזופלורן (2%) לצורך הרגעה. מתן קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג), כמו גם הפרין (300 U/kg) תוך צפק.
- אשרו את עומק ההרדמה על ידי צביטת אצבע, והניחו את החולדה במצב שכיבה כשהזנב פונה אליכם. לעקר את כל בית החזה ואת דופן הבטן עם בטאדין ואתנול 70% שלוש פעמים לחילופין. כסו את החולדה בשפשוף כירורגי סטרילי.
- באמצעות מיקרוסקופ כירורגי 12.5x, הסר את כל דופן בית החזה הקדמי על ידי התחלה עם חתך אופקי באמצעות אזמל 15 להבים ב xyphoid ואחריו חתכים אנכיים לרוחב עד בית השחי משני הצדדים עם מספריים. לאחר מכן ניתן להסיר את דופן בית החזה הקדמי על ידי המשך חתך אופקי נוסף ממש מתחת לצוואר.
- לנתח את IVC, ימין ושמאל vena cavae, וכלי ריאה עם מספריים, ולאחר מכן להקיף ולקשור את כל כלי הדם עם תפר משי 7-0. יש לתת 3 מ"ל של תמיסת קרבס-הנסלייט קרה כקרח, עתירת אשלגן לאטריום הימני על ידי ניקוב IVC עם מחט 30 גרם ודחיפה קלה של הסרעפת כלפי מטה עם מלקחיים.
- חותכים את IVC, SVCs, כלי ריאה, אבי העורקים עם מספריים. העבר את עורקי הריאה רחוק ככל האפשר ואת אבי העורקים הדיסטלי לגזע הברכיוצפלי כדי להבטיח אורך תקין באמצעות אזמל 11 להבים.
- להפריד את תא המטען הריאתי ואת אבי העורקים עולה עם microscissors, ולשטוף את הלב עם פתרון cardioplegic קר כקרח באמצעות מזרק 3 מ"ל.
4. שחזור הנמען וניטור השתל
- לאחר הניתוח, תנו לחולדה מספיק זמן להתעורר, מה שקורה בדרך כלל בחלון זמן של 15 דקות, ותנו לה להתאושש על כרית חימום.
הערה: אין צורך באנטיביוטיקה בשל הסיכון הנמוך מאוד לזיהום וכדי לא לפגוע במודל הניסוי, ולא חלה הגבלה על מזון או מים. - לאחר ההשתלה, עקוב אחר תפקוד השתל על ידי מישוש הלב המושתל מדי יום, אך קח בחשבון שלפעמים זה יכול להיות קשה להערכה בגלל כיסוי המעי.
הערה: אקוקרדיוגרפיה בטנית יכולה למדוד בצורה מדויקת יותר את כדאיות השתל. עבור אקוקרדיוגרפיה, להרדים מעט את החולדה עם איזופלורן (1-2%) בשאיפה דרך חרוט האף, ולמקם אותו על כרית חימום. אקוקרדיוגרפיה מבוצעת בדרך כלל ביום שלאחר הניתוח (POD) 1, POD 7 ו- POD 14. כדי לאפשר הערכה של הדופק וההתכווצות, אפשר לקבל בקלות תצוגות של ציר ארוך וציר קצר (איור 2A, B). כדי להעריך את האנסטומוזות, השתמשו באקוקרדיוגרפיה של דופלר (איור 3A), ואשרו את היווצרות רקמת EFE כפי שהיא נראית כשכבה אנדוקרדיאלית בהירה בתוך חלל החדר השמאלי (איור 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדאיות השתל והכאה
בעבודה זו, כדאיות השתל הוערכה חזותית לאחר שכל המהדקים הוסרו, והותר זמן זילוח משוער של 10-15 דקות עם בטן פתוחה לתצפית על השתל. אותה מערכת ניקוד לאימות אובייקטיבי של כדאיות השתל שימשה להערכה חזותית בסוף הניתוח ולאקוקרדיוגרפיה ב- POD 1, POD 7 ו- POD 14.
0 = אין תפקוד איבר; 1 = (מנוחה) תפקוד איברים, רק התכווצות מינימלית; 2 = תפקוד איברים חלש או חלקי; 3 = קצב התכווצות או עוצמה מופחתת, אך תפקוד איברים הומוגני; 4 = כיווץ אופטימלי של אטריום וחדר (120-160 פעימות לדקה). ציון של 3 או 4 דורג כהצלחה. הערכה מישושית של השתל התורם הבטני שימשה למעקב אחר כדאיות השתל בין נקודות הזמן של הערכה אקוקרדיוגרפית.
תמותה ושיעור הצלחה של כדאיות השתל
ההליך הוצג לצוות כירורגי חדש במרכז המחקר בין אוקטובר 2022 לדצמבר 2022, ובמרכז המחקר בוצעו 19 השתלות לב הטרוטופיות של חולדות יילודים בתקופה זו. שיעור ההישרדות הניתוחית המיידית היה 79%, ושיעור ההצלחה של כדאיות השתל (הצגת לב תורם בר קיימא ופועם) היה 84%. מאפייני ההליך מוצגים בטבלה 3.
מבין 12 בעלי החיים ששרדו, 2 נזקקו להמתת חסד לפני נקודת הסיום של המחקר שנמשכה שבועיים, 1 עקב אילאוס (n = 1), והשני עקב כאב שלא הוקל באמצעות משככי כאבים (n = 1), ו-2 הומתו על ידי תכנון שבוע לאחר הניתוח.
בשלוש חולדות, הציון המותאם של סטנפורד עלה מ-3 ל-4 בין דירוג ראייה מיידי לאחר הניתוח לבין הערכה אקוקרדיוגרפית ב-POD 1. מבין שמונה החולדות ששרדו בנקודת הסיום של 14 הימים, הציונים המתוקנים של סטנפורד באקוקרדיוגרפיה היו ארבעה עבור שבעה בעלי חיים ושלושה עבור חיה אחת. סיבת המוות השכיחה ביותר בסדרה זו הייתה כשל המודינמי עקב איבוד דם מוגזם כתוצאה מהלב המאוד לא בשל, ולכן כלי תורם שבריריים לאנסטומוזה או זמני הרדמה ארוכים.
הערכה היסטולוגית של רקמת EFE
לאחר המתת חסדCO2 של החולדה המושתלת, בוצעה כריתת לפרוטו מחדש בהכנה סטרילית. השתל התורם נכרת והוכנס מיד לתמיסת מלח פיזיולוגית על קרח להמשך עיבוד. פרוסה אופקית נכרתה ברמת החדר האמצעי של החדר הימני והשמאלי, הונחה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בהטבעה בינונית, וקפאה בחנקן נוזלי (איור 4A). כל שאר הרקמה הוקפאה בחנקן נוזלי ואוחסנה במקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לניתוח נוסף. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 4B-D).
צביעה אימונוהיסטוכימית כתקן הזהב לזיהוי EndMT בוצעה באמצעות 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול), VE-Cadherin כסמן אנדותל (אדום), ו- α-SMA כסמן פיברובלסט (ירוק). חלבוני SMAD זרחניים וגורם השעתוק SLUG/SNAIL הוכתמו גם ברקמת EFE (איור 5A-E)3,20.
איור 1: מדף אלכסוני לאינטובציה. החולדה מונחת על גבה, כאשר השיניים הקדמיות מאובטחות בחוט והראש פונה לכיוון המנתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מבט אקוקרדיוגרפי ארוך ציר של LV . (A) לב חולדה מקומי המצביע על מילוי תקין במהלך דיאסטולה. (B) השתלת תורם עם קיפאון זרימה בתוך LV. עומס נפח מופחת במהלך דיאסטולה. קיצורים: LV = החדר השמאלי; MV = שסתום מיטרלי; LVOT = מערכת זרימת החדר השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אנסטומוזות והערכת EFE. (A) מחקר דופלר צבע אקוקרדיוגרפי המצביע על אנסטומוזות עורקי פטנט (חץ אדום) וורידים (חץ כחול). (B,C): משטח אנדוקרדיאלי אקו-בהיר בתוך חלל LV המעיד על EFE (חיצים לבנים). קיצורים: LV = החדר השמאלי; EFE = פיברואלסטוזיס אנדוקרדיאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכת רקמות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות . (A) חתך חדר אמצעי דרך ה-LV וה-RV. החצים הלבנים מצביעים לעבר רקמת EFE. (B) Hematoxylin-eosin, (C) טריכרום של Masson (MTS), ו-(D) צביעה של Elastin van Gieson (EVG). ההגדלה הגדולה מצביעה על כך שרקמת EFE (חיצים שחורים) מכילה כמויות גבוהות של קולגן מאורגן (כחול ב-MTS) וסיבי אלסטין (שחור ב-EVG). קיצורים: LV = החדר השמאלי; RV = החדר הימני; EFE = פיברואלסטוזיס אנדוקרדיאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואה בין תמונות היסטולוגיות ואימונוהיסטולוגיות. (A) צביעת Hematoxylin-eosin. (ב-ה) צביעה אימונוהיסטוכימית; רקמת EFE מוכתמת פעמיים עבור (B,C) VE-Cadherin ו- α-SMA, (D) CD31 ו- phospho-SMAD2/SMAD3 (לוקליזציה עם הגרעינים המוכתמים ב- DAPI בכחול), ו- (E) CD31 ו- SLUG/SNAIL (לוקליזציה עם הגרעינים המוכתמים ב- DAPI בכחול), המציין EndMT, כפי שמוצג על ידי החצים הלבנים. קיצורים: LV = החדר השמאלי; EFE = פיברואלסטוזיס אנדוקרדיאל; EndMT = מעבר אנדותל למזנכימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| 1 ליטר מים מעוקרים ומזוקקים | |
| NaCl | 118 מילימול/ליטר |
| KCl | 22 מילימול מול/ליטר |
| KH2PO4 | 1.2 mmol / ליטר |
| MgSO4 | 1.2 מילימול/ליטר |
| NaHCO3 | 25 מילימול/ליטר |
| גלוקוז | 11 מילימול מול / ליטר |
| CaCl2 | 2.5 מילימול/ליטר |
טבלה 1: הרכב חיץ קרבס-הנסלייט המתוקן. תמיסה קרדיופלגית עתירת אשלגן (22 mmol / L KCl) מוכנה, מסוננת ומאוחסנת ב -4 ° C למשך הלילה.
| כשלים נפוצים ופתרון בעיות | ||
| השתל אינו מתחיל לפעום / העורקים הכליליים אינם מתמלאים לאחר שחרור המלחציים | בדוק היווצרות פקקת באנסטומוזה עורקית | |
| בדוק זמן איסכמיה (= זמן מעצר כולל) (לא יעלה על 100 דקות) | ||
| זמן התעוררות ארוך או חולדה אינה מתעוררת לאחר ניתוח | עקוב אחר עוצמת הדופק ותדירותו במהלך הניתוח והפחת את שאיפת האיזופלורן, אם המודינמיקה חלשה | |
| מעיים חיים או נמקיים מיד לאחר הניתוח חשודים להמודינמיקה תוך ניתוחית מופחתת, לעתים קרובות עקב זמן הרדמה ארוך | ||
| המודינמיקה חלשה מיד לאחר laparotomy | התאמת זרימת איזופלורן להרדמה | |
| הערכת אינטובציה ותנועה נכונה של החזה: אינטובציה חד צדדית, דלקת ריאות, לומן אנדוטרכאלי חסום הם כישלונות נפוצים בהתחלה. | ||
| חולדה מתעוררת אך מתה ב-24 השעות הראשונות | איבוד דם נרחב במהלך הניתוח | |
| אם כמות מוגברת של דם נמצאת בנתיחה שלאחר המוות בבטן, זה כנראה בגלל כישלון של אנסטומוזה | ||
טבלה 2: כשלים נפוצים ופתרון בעיות. ניטור יסודי והערכה מחדש של הליכים לא מוצלחים חיוניים להשגת שיעור הישרדות גבוה במודל זה.
| משקל חולדה מושתלת בגרמים, חציון [IQR] | 150 [50] |
| גיל התורם בימים, חציון [IQR] | 3 [1] |
| משקל התורם בגרמים, חציון [IQR] | 9 [2] |
| זמן איסכמיה השתל בדקות, חציון [IQR] | 100 [25] |
| שיעור הצלחה לאחר הניתוח, n | 16/19 (=84%) |
טבלה 3: מאפייני הנוהל. בחירת המקבל והתורם, זמן איסכמיה של השתל ושיעור הישרדות. קיצור: IQR = טווח בין-רבעוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל חייתי זה של השתלה הטרוטופית של לב חולדה תורם יילוד לתוך בטנו של המקבל יוצר את האפשרות לחקור פיברוזיס שמקורו ב- EndMT באמצעות הערכה היסטולוגית מפורטת של רקמות, לזהות מסלולי איתות רגולטוריים ולבחון אפשרויות טיפול. מכיוון ש- EndMT הוא המנגנון הבסיסי למחלות פיברוטיות של הלב, למודל זה יש ערך רב בתחום ניתוחי לב ילדים ומעבר לו. במודל זה, גורמים רבים יכולים להשפיע לרעה על תוצאות ההליך. לפיכך, טיפול נכון ברקמה השברירית מאוד עקב חוסר בשלות הלב התורם, טיפול נכון בבעלי חיים במהלך ההרדמה ומיומנויות מיקרוכירורגיות ברמה גבוהה הן דרישות בסיסיות להצלחת מודל זה. יש להשתמש במערך טכני אופטימלי, הכולל מיקרוסקופ כירורגי, מכונת הנשמה לבעלי חיים קטנים ומכשירים מיקרוכירורגיים, בעת ביצוע ניסויים אלה. למרות שאינו חיוני, ניטור בסיסי של קצב הלב או טמפרטורת הגוף יכול להיות מועיל, במיוחד עבור מנתחים חסרי ניסיון, על מנת לפקח על המודינמיקה ועומק ההרדמה.
היבטים כירורגיים חשובים שיש לזכור כוללים את חוסר הבשלות של לב תורם היילוד, מה שהופך את הרקמה לשברירית מאוד ומשאיר את אבי העורקים העולה ואת גזע הריאה פגיעים לקרעים. לכן, כל טיפול צריך להתבצע בזהירות רבה. בשל כלי הדם הקטנים המשמשים אנסטומוזיס, מומלץ לבצע אנסטומוזה עורקית עם תפרים קטועים ושטיפה לסירוגין של אתר אנסטומוזה עם מלוחים heparinized, אשר מסייע למנוע היווצרות פקקת. נדרשת ברירה של חולדות יילודים בגיל המתאים כדי להתגבר על הבעיה של שימוש בלבבות שאינם בוגרים מדי, ולכן רגישים מאוד לקרע אנסטומוזיס. מצד שני, לאחר גיל מסוים של כ -7 ימים, EndMT כבר לא ניתן להראות באופן משוחזר במודל בעלי חיים זה15.
EndMT זוהה כמנגנון המרכזי לסוגים שונים של פיברוזיס לב וטרשת עורקים, אך המחקר התעכב בשל מחסור במודלים in vivo 8. ההתפתחויות העיקריות בתחום מחקר EndMT מוגבלות למודלים של תרביות תאים, שיש להם מגבלות מובנות 3,8,9. יתר על כן, מחקרים על תאי אנדותל אנדוקרדיאליים מוגבלים עוד יותר. כחלופה, תאי אנדותל של העורקים הכליליים משמשים לעתים קרובות כתחליף, כפי שדווח כי מקורם בחלקו בתאים אנדוקרדיאליים21. לפיכך, מודל בעלי חיים זה יכול לשמש לא רק עבור פיברוזיס לב, אלא גם כדי לחקור פתומנגנונים חשובים של EndMT המושרה על ידי זרימה בטרשת עורקים. עבור מחלות לב מולדות, הראינו את היכולת לשחזר את המעבר מרקמת אנדוקרדיום בריאה לרקמת EFE באמצעות EndMT במודל החולדות שלנו, עם EFE הדומה מבחינה מבנית לרקמת EFE אנושית. קיימת מחלוקת לגבי המקור התאי של תאים מזנכימליים ברקמת EFE. Clark et al.22 דיווחו כי תאים אפיקרדיאליים תורמים ל- EFE, אך הנתונים שלנו הצביעו על כך שרוב רקמת EFE נגזרת באמצעות תאי אנדותל אנדוקרדיאליים העוברים EndMT3. ניסויים ברמת תא בודד מתבצעים כעת כדי לברר את המקור התאי של רקמת EFE.
באמצעות מודל in vivo זה, ניתן ללמוד את מסלולי הרגולציה של EndMT. חוסר איזון, במיוחד עלייה במסלול TGF-ß ופגיעה באיתות החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP), הוכח כממלא תפקיד מרכזי בתאים אנדוקרדיאליים המבטאים גורמי שעתוק המווסתים EndMT. לחלופין, איתות Jagged/NOTCH ו-Wnt/ß-Catenin דווחו גם הם כגורמים ל-EndMT 3,23. מסלול TGF-ß גורם להפעלת גורמי שעתוק כמו SLUG, SNAIL ו-TWIST באמצעות חלבוני SMAD, ובכך מווסת את EndMT20,24. במודל זה של בעלי חיים, הצלחנו לשחזר מנגנונים אלה, אשר אושרו על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית.
הגורמים הממריצים לפיברוזיס המושרה על ידי EndMT במודל בעלי חיים זה הם חוסר בשלות וקיפאון זרימה, בעוד שמודלים אחרים מתוכננים לגרום ל- EndMT באמצעות שינויים גנטיים, יתר לחץ דם או הגבלות תזונתיות 9,25. בהשוואה למינים אחרים, חולדות ילודים מאוד לא בוגרות בלידתן, ולכן הן רגישות במיוחד לעבור EndMT.
אנו ואחרים השתמשנו בעכברים כדי לחקור טוב יותר את מקורות EFE באמצעות מעקב אחר שושלות טרנסגניות, אך יש לדון במספר מגבלות 3,22. ראשית, בשל מורכבות המודל, שיעורי התמותה גבוהים יותר בעכברים בהשוואה לחולדות, והצגת EFE הטרוגנית יותר; לכן, מודל ה-RAT אמין יותר וניתן לשחזור. אמצעים אקוקרדיוגרפיים חיוניים להערכת תפקוד השתל לאורך כל תקופת המחקר, והראינו כי באמצעות אמצעים אלה, כמו גם הערכת הפעימה והפטנטיות של האנסטומוזות, ניתן לחקור גם את תפקוד השתל ואת ההתכווצות. עם ניסיון רב יותר, ניתוחים מתקדמים עוד יותר של הלב המושתל, כגון ניתוח זנים של LV, יכולים להתבצע במודלים של חולדות. נכון לעכשיו לא ברור אם אותו מצב פתופיזיולוגי יכול להיגרם בבעלי חיים גדולים יותר שאינם מכרסמים, וזה דורש חקירה נוספת.
לסיכום, מודל זה של בעלי חיים לילדים מחקה את המחלה האנושית של EndMT ויכול להיות שימושי כדי לקבוע את הרגולציה של EndMT וללמוד התערבויות פרמקולוגיות כדי לעכב את התהליך הפתולוגי הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מיזמים נוספים - Single Ventricle Research Fund (SVRF) ו-Single Ventricle Expansion Fund (ל-I.F.) ומלגת מריאטה בלאו של OeAD-GmbH מקרנות שסופקו על ידי המשרד הפדרלי האוסטרי לחינוך, מדע ומחקר BMBWFC (ל-G.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
