Summary
この研究は、重症大動脈弁狭窄症や左心低形成症候群などの先天性心疾患に見られる内皮から間葉への移行誘発性線維症の動物モデルを提示し、詳細な組織学的組織評価、調節シグナル伝達経路の同定、および治療オプションのテストを可能にします。
Abstract
心内膜線維弾性症(EFE)は、心内膜下組織の蓄積によって定義され、左心室(LV)の発達に大きな影響を与え、先天性重症大動脈弁狭窄症および低形成性左心症候群(HLHS)の患者を治癒的解剖学的両心室外科的修復から排除します。現在、外科的切除が唯一の治療法であるが、EFEはしばしば再発し、時には隣接する心筋へのさらに浸潤的な増殖パターンを伴う。
EFEの根底にあるメカニズムをよりよく理解し、治療戦略を探求するために、前臨床試験に適した動物モデルが開発されました。動物モデルは、EFEが未熟な心臓の病気であり、臨床観察によって裏付けられているように、流れの乱れに関連していることを考慮に入れています。したがって、新生仔ラットドナー心臓の異所性心臓移植は、このモデルの基礎です。
新生仔ラットの心臓を思春期ラットの腹部に移植し、レシピエントの腎下大動脈と下大静脈に接続します。冠状動脈の灌流はドナーの心臓の生存率を維持しますが、LV内の流れの停滞は非常に未熟な心臓のEFE増殖を誘発します。EFE形成の根底にあるメカニズムは、心内皮細胞から間葉系細胞への移行(EndMT)であり、これは弁と中隔の初期胚発生のよく知られたメカニズムですが、心不全における線維症の主な原因でもあります。EFEの形成は、移植後数日以内に肉眼的に観察できます。経腹心エコー検査は、移植片の生存率、収縮性、および吻合の開存性を監視するために使用されます。安楽死後、EFE組織が採取され、HLHS患者のヒトEFE組織と同じ組織病理学的特徴を示します。
この in vivo モデルにより、心臓におけるEFE発症のメカニズムを研究し、この病理学的組織形成を予防するための治療オプションをテストすることができ、EndMT誘発性線維症のより一般的な検査の機会を提供します。
Introduction
心内膜線維弾性症(EFE)は、心内膜下組織におけるコラーゲンおよび弾性線維の蓄積によって定義され、真珠状または不透明な肥厚した心内膜として現れる。EFEは、胎児期と乳児期初期に最も活発な成長を遂げます1。剖検研究では、左心低形成症候群(HLHS)の症例の70%がEFE2の存在と関連していました。
線維芽細胞のマーカーを発現する細胞はEFEの主要な細胞集団であるが、これらの細胞は同時に心内膜内皮マーカーも発現しており、これはこれらのEFE細胞の起源を示すものである。私たちのグループは、EFE形成の根底にあるメカニズムには、内皮から間葉への移行(EndMT)3を介した心内皮内皮細胞から線維芽細胞への表現型の変化が関与していることを以前に確立しました。EndMTは、分化クラスター(CD)31や血管内皮(VE)-カドヘリン(CD144)などの内皮マーカーと線維芽細胞マーカー(α-平滑筋アクチン、α-SMAなど)の免疫組織化学的二重染色を使用して検出できます。さらに、このプロセスにおけるTGF-β経路の調節的役割は、転写因子であるSLUG、SNAIL、およびTWIST3の活性化によって確立されました。
EndMTは、胎児期の心臓の発達中に発生し、心内膜クッションから中隔と弁の形成につながる生理学的プロセスですが4、心不全、腎線維症、または癌の臓器線維化も引き起こし、血管アテローム性動脈硬化症に重要な役割を果たします5,6,7,8。心線維症における末期MTは、主にTGF-β経路を介して調節されており、私たちらは3,9を報告しています。炎症10、低酸素症11、機械的変化12、および腔内血流の変化13を含む流れの乱れなど、様々な刺激がEndMTを誘発するために説明されており、EndMTもまた遺伝性疾患14の結果である可能性がある。
この動物モデルは、心筋電波発生の重要な要素である、空洞内血流の未熟さと変化、特に流れの停滞を使用して開発されました。新生仔ラットは出生直後から発達的に未熟であることが知られているため、新生仔ラットの心臓をドナーとして用いることで未熟さを補った。異所性心臓移植では、腔内血流制限が提供された15。
臨床的観点から、この動物モデルは、成長する左心室(LV)に対するEndMTの影響をよりよく調査することを可能にします。EndMT誘発性EFE形成16を介して胎児および新生児の心臓に課せられる成長制限は、先天性重症大動脈弁狭窄症や左心低形成症候群(HLHS)などの左心室流出路閉塞(LVOTO)を有する患者を治癒的解剖学的両心室外科的修復から排除する17。この動物モデルは、EndMTによる組織形成の細胞メカニズムと調節の研究を容易にし、薬理学的治療オプションのテストを可能にします3,18。
経腹心エコー検査は、移植片の生存率、収縮性、および吻合の開存性を監視するために使用されます。安楽死後、EFEの形成は移植後3日以内に肉眼的に観察できます。EFE組織は、LVOTO患者のヒトEFE組織と同じ組織病理学的特徴を示します。
したがって、この動物モデルは、HLHSのスペクトルにおける小児用として開発されましたが、EndMTの分子メカニズムに基づいてさまざまな疾患を研究するときに適用できます。
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Protocol
すべての動物実験は、全米研究評議会(National Research Council)に従って実施されました。2011. 実験動物のケアと使用に関するガイド: 第 8 版。動物のプロトコルは、ボストン小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。
手術前に、すべての手術器具を蒸気オートクレーブ滅菌し、最終濃度が22 mmol / L KClの修飾されたKrebs-Henseleitバッファーを心臓麻痺溶液として調製します(表1)。溶液をフィルター滅菌し、4°Cで一晩保存します。異所性新生仔ラットの心臓移植手術には手術用顕微鏡(12.5倍)が必要です。
1.準備と麻酔
- レシピエントとして、体重約150 g(5〜6週齢)の雄/雌のルイスラットを使用します。
- まず、ネズミの腹部をカミソリでたっぷりと剃ります。
- ラットをイソフルランチャンバーに入れ、動物が適切に鎮静され、自発呼吸するまで、2%イソフルランで2 L / minの酸素流量をオンにします。45 mg / kgのケタミンと5 mg / kgのキシラジンを腹腔内(IP)、および300 U / kgのヘパリンに注射します。.つま先のつまみテストで適切な麻酔を確認します。
注意: 胸部の触診を通じて自発呼吸と心拍数を注意深く監視し、プロセス全体を通して安定した血行動態状態を確保します。 - 挿管の場合は、ラットを斜めの棚に置き(図1)、前歯を紐で固定し、頭を外科医の方に向けます。
- 首の外側にあるライトを声帯の領域に置き、2本の指で舌をつかみ、わずかに上と左に押して、挿管に最適な視界を提供します。100〜150gのラットには、18 g、2 inカニューレを使用します。気管内チューブをテープで固定します。
注:挿管には、倍率3.5倍の手術用ループが推奨されます。 - 挿管カニューレを小動物用人工呼吸器に接続し、動物のサイズに基づいて製造元の指示に従って設定を調整します。
注意: 150gのラットには、次の設定を使用します。呼吸数、55 /分;一回換気量、1.3 mL 50% I/E比ですが、これは必要に応じて適切に調整できます。適切な両側で均等な胸の動きを保証し、人工呼吸器を介して0.5%〜2%でイソフルランを継続的に投与します。. - ラットを加熱パッドの上に置き(正常な体温を維持するため)、尾を外科医の方に向けて仰臥位にします。ベタジン溶液と70%のエタノールで腹部を交互に3回殺菌する。眼に潤滑油を投与し、ラットを滅菌手術用ドレープで覆い、腹部を覆わないようにします。
2.レシピエントラットにおける新生児ドナー心臓の外科的準備と異所性移植
- 皮膚切開に15枚刃のメスを使用して正中開腹術を行い、ハサミを使用して前腹壁を開き、続いて綿の先端アプリケーターを使用して後腹膜腹部大動脈と下大静脈(IVC)を鈍く露出させます。
- 腸(下行結腸を含む)を動員し、右上象限に向けて配置します。生理食塩水を染み込ませた温かいガーゼで腸を覆います。リトラクターを使用して、IVCと腹部大動脈の最適な露出を確保します。
- 分岐部に向かって、腎下IVCと腹部大動脈の鈍解剖を行います。すべての腎下分岐動脈および静脈(例:下腸間膜動脈およびリンパ節動脈)を10-0ナイロン縫合糸で結紮する。
注:これらの側枝の解剖学的構造には大きなばらつきがあります。大動脈の脈拍と心拍数を視覚的に監視します 他の血行動態モニタリングが利用できない場合。つま先のつまみテストを通じて、15分ごとに麻酔の適切な深さを評価します。イソフルラン濃度を適宜調整してください。 - 新生仔ラットからドナーの心臓を採取した後、切除した心臓をKrebs-Henseleit緩衝液を含む外科用洗面器で無菌状態で手術野に送達します。ドナーの心臓を氷冷した心臓麻痺溶液で断続的に灌漑します。
注:2人目の外科医がいる場合は、2人目の外科医がレシピエント動物の総麻酔時間とドナー心臓の虚血時間を短縮するため、心臓を同時に準備する必要があります。2人目の外科医がいない場合は、レシピエントの腹部を温かい生理食塩水で覆い、採取手順中に動物を監視します。 - 4つの小さな非外傷性血管クランプを、腎下大動脈およびIVCの遠位および近位セグメントに適用します。必要に応じて、7-0シルク縫合糸で好ましくない腎血管を一時的に閉塞し、処置後に縫合糸を解放します。大動脈切開を容易にするために、大動脈の前壁に10-0ナイロン縫合糸を垂直に配置します。縫合糸を少し引き上げて、マイクロハサミで2つの小さな水平カット(くさび形)で大動脈切開を行います。
注意: 血栓を取り除くには、ヘパリン化生理食塩水で大動脈内腔を洗い流すことをお勧めします。 - ドナーの心臓を大動脈の左側(動物の視点から見て)に配置し、レシピエントの腎下大動脈とドナーの上行大動脈を大動脈切開術の12時と6時の位置に端から側まで縫合糸で固定します。3時と9時の位置で3番目と4番目の縫合を続け、3回目の縫合の後に心臓を大動脈の右側に静かにひっくり返します。すべての隙間に1〜2本の縫合糸を追加することで、動脈吻合を完成させます。
注:組織の損傷を避けるために、吻合を作成するときは、ドナーの上行大動脈またはレシピエントの腹部大動脈に鉗子で触れないように注意する必要があります。 - ラットを反時計回りに回転させ、頭を外科医の左手に向けています。ドナーの大動脈を腹部大動脈の左側に移動して、IVCを最適に視認できるようにします。
- 大動脈吻合部にわずかに近位のIVCで静脈切開を行い、穿刺には11ブレードを使用し、ドナーの肺幹の直径に応じて適切なサイズ調整のためにマイクロハサミを使用します。再び、ヘパリン化生理食塩水で腔内腔を洗い流します。
- レシピエントのIVCとドナーの肺幹の間の静脈吻合から始めて、12時と6時の位置(IVCに関連)から始めて、血管の後壁に中断された11-0ナイロン縫合糸を配置することによって最もよく達成され、次に前壁に連続した11-0ナイロン縫合糸を配置します(6時から12時の位置に向かって)。
- 吸収性ゼラチンスポンジの小さなストリップで吻合部を覆い、遠位から始めて微小血管クランプを取り外します。綿の先端アプリケーターを使用してスポンジを軽く圧縮し、最適な止血を実現します。
- 遠位微小血管クランプの解放時に移植片の冠状血管が満ちるのを観察し、近位クランプが解放されたときにドナーの心臓がすぐに鼓動し始めることを確認します。
注: 移植片の生存率は、適切な移植片機能を確認するために、修正されたスタンフォード スコア19 に従って術中に 0 から 4 までスコアリングできます。 - 動脈と静脈の吻合が歪まないようにして、腸を腹部に戻します。
- メロキシカム(1mg / kg)とエチカXR(0.65 mg / kg)を皮下投与し、動物が完全に麻酔されている間、術後の鎮痛を確認します。次に、6-0吸収性ビクリル縫合糸で皮膚を閉じる前に、連続した5-0吸収性ビクリル縫合糸で腹壁を皮内閉じます。
メモ: 一般的な障害とトラブルシューティングに関するガイダンスを 表 2 に示します。
3. 新生児ドナーの心臓の採取
- 新生児ドナーラットをイソフルラン(2%)を注入したチャンバーに入れて鎮静させます。ケタミン(75 mg / kg)とキシラジン(5 mg / kg)、およびヘパリン(300 U / kg)を腹腔内に投与します。.
- つま先をつまんで麻酔の深さを確認し、尻尾を手前に向けて仰臥位にします。胸部と腹壁全体をベタジンと70%エタノールで交互に3回殺菌します。無菌の外科用ドレープでラットを覆います。
- 12.5倍の手術用顕微鏡を使用して、胸壁前部全体を切開し、15枚刃のメスを使用して頬状部を水平に切開し、次にハサミで両側の腋窩まで横方向に切開します。その後、頸部のすぐ下に別の水平切開を続けることで、前胸壁を除去することができます。
- IVC、左右の上大静脈、肺血管をハサミで解剖し、7-0の絹糸ですべての血管を囲んで結紮します。30 Gの針でIVCに穴を開け、鉗子で横隔膜をわずかに押し下げて、3 mLの氷冷高カリウム修飾クレブスヘンセライト溶液を右心房に投与します。.
- IVC、SVC、肺血管、大動脈をハサミで切断します。肺動脈を可能な限り切断し、腕頭幹から遠位の大動脈を切断し、11枚刃のメスを使用して適切な長さを確保します。
- 肺幹と上行大動脈をマイクロハサミで分離し、3mLの注射器を使用して氷冷した心筋麻痺溶液で心臓を洗い流します。
4.レシピエントの回復と移植片のモニタリング
- 手術後、ラットが目を覚ますのに十分な時間を与え(通常は15分の時間枠で発生します)、加熱パッドで回復させます。
注:感染のリスクが非常に低く、実験モデルを損なわないために抗生物質は不要であり、食物や水に制限は適用されません。 - 移植後、移植した心臓の触診で移植片の機能を毎日観察しますが、腸の重なりにより評価が困難な場合があることを考慮してください。
注:腹部心エコー検査は、移植片の生存率をより正確に測定できます。心エコー検査では、鼻錐から吸入したイソフルラン(1〜2%)でラットをわずかに鎮静させ、加熱パッドの上に置きます。.心エコー検査は通常、術後日(POD)1、POD7、およびPOD14に実施されます。心拍数と収縮性の評価を可能にするために、長軸と短軸のビューを簡単に取得できます(図2A、B)。吻合を評価するには、ドップラー心エコー検査(図3A)を使用し、左心室腔内のエコーブライト心内膜層として見られるEFE組織の形成を確認します(図3B、C)。
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Representative Results
移植片の生存率と鼓動
この作業では、すべてのクランプが取り外された後、移植片の生存率を視覚的に評価し、移植片の観察のために腹部を開いた状態で約10〜15分の再灌流時間を許可しました。移植片の生存率を客観的に検証するための同じスコアリングシステムが、手術終了時の視覚的評価と、POD 1、POD 7、および POD 14 の心エコー検査に使用されました。
0 = 臓器機能なし。1 =(安静時)臓器機能、最小限の収縮のみ。2 =弱いまたは部分的な臓器機能;3 =収縮速度または収縮強度は低下しているが、臓器機能は均一である。4 =最適な心房と心室の収縮(120〜160拍/分)。3 または 4 のスコアは成功と評価されました。腹部ドナー移植片の触診評価は、心エコー検査評価の時点間の移植片の生存率を監視するために使用されました。
死亡率と移植片の生存率
この手順は、2022 年 10 月から 2022 年 12 月の間に研究センターの新しい外科チームに導入され、この期間中に研究センターで 19 件の新生児異所性ラット心臓移植が実施されました。手術の即時生存率は79%であり、移植片の生存率(生存可能で鼓動するドナーの心臓を示す)は84%でした。手順の特性を 表 3 に示します。
生き残った12匹のうち、2匹は2週間の研究エンドポイントの前に安楽死を必要とし、1匹はイレウス(n = 1)、もう1匹は鎮痛剤で緩和されない痛み(n = 1)のために、2匹は手術の1週間後に設計により安楽死させた。
3匹のラットでは、適用された修正スタンフォードスコアが、術後即時の視覚的等級付けとPOD 1の心エコー検査評価の間で3から4に増加しました。.14日間のエンドポイントで生き残った8匹のラットのうち、心エコー検査で修正されたスタンフォードスコアは、7匹で4匹、1匹で3でした。このシリーズで最も一般的な死因は、非常に未熟な心臓の結果としての過剰な失血による血行動態不全であり、したがって、吻合または長い麻酔時間のための脆弱なドナー血管でした。
EFE組織の組織学的評価
レシピエントラットのCO2安楽死に続いて、再開腹術を滅菌準備下で実施した。ドナー移植片を切除し、直ちに氷上の生理食塩水に入れ、さらなる処理を行った。右心室と左心室の心室中央レベルで水平切片を切除し、最適な切削温度(OCT)包埋培地に入れ、液体窒素で凍結しました(図4A)。他のすべての組織を液体窒素で急速凍結し、さらなる分析のために-80°Cの冷凍庫に保存しました。画像は倒立顕微鏡を使用して取得しました(図4B-D)。
EndMTを同定するためのゴールドスタンダードとしての免疫組織化学的染色は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(青)、VE-カドヘリンを内皮マーカー(赤)、線維芽細胞マーカー(緑)としてα-SMAを用いて実施しました。リン酸化SMADタンパク質および転写因子SLUG/SNAILもEFE組織で染色された(図5A-E)3,20。
図1:挿管用の斜めの棚。 ネズミを仰向けに寝かせ、前歯を紐で固定し、頭を外科医の方に向けます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:LVの心エコー検査長軸図。 (A)拡張期の正常な充満を示す天然ラットの心臓。(B)LV内で流れが停滞しているドナー移植片。 拡張期の体積負荷の減少。略語:LV =左心室;MV = 僧帽弁;LVOT = 左心室流出路。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:吻合とEFEの評価 。 (A)心エコー検査によるカラードップラー検査で、特許動脈(赤矢印)および静脈(青矢印)の吻合が示されています。(B、C):EFEを示すLV腔内のエコーブライト心内膜表面(白い矢印)。略語:LV =左心室;EFE = 心内膜線維弾性症。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:巨視的および顕微鏡的組織評価 。 (A)LVとRVを通る心室中央断面。白い矢印はEFE組織を指しています。(B)ヘマトキシリン-エオシン、(C)マッソントリクローム(MTS)、および(D)エラスチン・ファン・ギーソン(EVG)染色。大きな倍率は、EFE組織(黒い矢印)に大量の組織化されたコラーゲン(MTSの青)とエラスチン繊維(EVGの黒)が含まれていることを示しています。略語:LV =左心室;RV = 右心室;EFE = 心内膜線維弾性症。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:組織学的画像と免疫組織学的画像の比較。 (A)ヘマトキシリン-エオシン染色。(B-E)免疫組織化学的染色;(B,C)VE-カドヘリンおよびα-SMA、(D)CD31およびリン酸化-SMAD2/SMAD3(青色はDAPIで染色した核と共局在)、(E)CD31およびSLUG/SNAIL(青色はDAPIで染色した核と共局在)を二重染色したEFE組織は、白矢印で示すようにEndMTを示しています。略語:LV =左心室;EFE = 心内膜線維弾性症;EndMT = 内皮から間葉への移行。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 1リットルの滅菌蒸留水 | |
| NaCl(ナトリウム) | 118ミリモル/L |
| KClの | 22ミリモル/L |
| KH2PO4 | 1.2ミリモル/リットル |
| MgSO4(ミリセムソウ4) | 1.2ミリモル/L |
| NaHCO3(ナノカーボン) | 25ミリモル/L |
| グルコース | 11ミリモル/L |
| CaCl2(ケイアルアル) | 2.5ミリモル/L |
表1:修飾Krebs-Henseleitバッファーの組成。 高カリウム(22 mmol / L KCl)心麻痺溶液を調製し、フィルター滅菌し、4°Cで一晩保存します。
| 一般的な障害とトラブルシューティング | ||
| 移植片が鼓動を開始しない/クランプを解除した後、冠動脈が満たされない | 動脈吻合時の血栓形成の確認 | |
| 虚血時間(=合計停止時間)を確認します(100分を超えてはなりません) | ||
| 覚醒時間が長い、またはラットが手術後に目を覚まさない | 手術中の脈拍の強さと頻度を監視し、血行動態が弱い場合はイソフルランの吸入を減らします | |
| 術直後の生気性または壊死性の腸は、多くの場合、麻酔時間が長いために術中の血行動態の低下が疑われます | ||
| 開腹直後の血行動態が弱い | 麻酔用のイソフルラン流量の調整 | |
| 挿管と適切な胸部運動を評価する:片側挿管、気胸、気管内腔閉塞は、最初のうちは一般的な失敗です。 | ||
| ネズミは目を覚ましますが、最初の24時間で死にます | 手術中の大量の出血 | |
| 剖検で腹部に血液量の増加が見つかった場合は、吻合の失敗が原因である可能性が最も高いです | ||
表 2: 一般的な障害とトラブルシューティング。 このモデルで高い生存率を達成するには、失敗した手順の徹底的なモニタリングと再評価が不可欠です。
| レシピエントラットの体重(グラム)、中央値[IQR] | 150 [50] |
| ドナーの年齢(日数、中央値)[IQR] | 3 [1] |
| ドナー重量(グラム)、中央値 [IQR] | 9 [2] |
| 移植片虚血時間(分)、中央値[IQR] | 100 [25] |
| 術後成功率、n | 16/19 (=84%) |
表3:プロシージャの特性。 レシピエントとドナーの選択、移植片虚血時間、および生存率。略語:IQR =四分位範囲。
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Discussion
レシピエントの腹部に新生仔ドナーラットの心臓を異所性移植するこの動物モデルは、詳細な組織学的組織評価を通じてEndMT由来の線維症を研究し、調節シグナル伝達経路を特定し、治療オプションをテストする可能性を生み出します。EndMTは心臓の線維化性疾患の根底にあるメカニズムであるため、このモデルは小児心臓外科の分野やそれ以降の分野で大きな価値があります。このモデルでは、多くの要因が手順の結果に悪影響を与える可能性があります。したがって、ドナーの心臓の未熟さによる非常に脆弱な組織の適切な取り扱い、麻酔中の適切な動物の取り扱い、および高度なマイクロサージェリースキルは、このモデルの成功のための基本的な要件です。これらの実験を行う際には、手術用顕微鏡、小動物用人工呼吸器、マイクロサージェリー機器など、最適な技術的セットアップを使用する必要があります。必須ではありませんが、心拍数や体温の基本的なモニタリングは、特に経験の浅い外科医にとって、血行動態や麻酔の深さをモニタリングするために有益です。
心に留めておくべき重要な外科的側面には、新生児ドナーの心臓が未熟であり、組織が非常に脆弱になり、上行大動脈と肺幹が裂傷に対して脆弱になることがあります。したがって、取り扱いには細心の注意を払う必要があります。吻合に使用される血管は小さいため、血栓の形成を避けるのに役立つヘパリン化生理食塩水による吻合部位の断続的な洗い流しと断続的な縫合を伴う動脈吻合を行うことをお勧めします。適切に年齢を上げた新生仔ラットの選択は、未熟すぎて吻合破裂を起こしやすい心臓を使用するという問題を克服するために必要です。一方、約7日という一定の月齢を過ぎると、この動物モデル15ではEndMTを再現性を持って示すことができなくなる。
EndMTは、様々な種類の心臓線維症やアテローム性動脈硬化症の中心的なメカニズムとして同定されているが、in vivoモデルがないため、研究は妨げられてきた8。EndMT研究の分野における主な開発は、固有の制限がある細胞培養モデルに限定されています3,8,9。さらに、心内皮内皮細胞の研究はさらに制限されています。代替として、冠動脈内皮細胞は、心内膜細胞に部分的に由来することが報告されているため、代替としてしばしば使用される21。したがって、この動物モデルは、心臓線維症だけでなく、アテローム性動脈硬化症における血流誘発性EndMTの重要な病態メカニズムを研究するためにも使用できます。先天性心疾患については、ラットモデルにおいて、ヒトEFE組織に構造的に類似したEFEを用いて、EndMTにより健康な心内膜からEFE組織への移行を再現できることを示しました。EFE組織内の間葉系細胞の細胞起源については、いくつかの論争があります。Clarkら22は、心外膜細胞がEFEに寄与することを報告しましたが、私たちのデータは、EFE組織の大部分がEndMT3を受けている心内皮細胞に由来することを示しました。現在、EFE組織の細胞起源を確認するために、単一細胞レベルでの実験が進行中です。
このin vivoモデルにより、EndMTの調節経路を研究することができます。不均衡、特にTGF-β経路の増加と骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の障害は、EndMTを調節する転写因子を発現する心内膜細胞に大きな役割を果たすことが示されています。あるいは、ギザギザ/NOTCHシグナル伝達およびWnt/β-カテニンもEndMT 3,23を誘導することが報告されています。TGF-β経路は、SMADタンパク質を介してSLUG、SNAIL、TWISTなどの転写因子の活性化を誘導し、それによってEndMT20,24を調節します。この動物モデルでは、免疫組織化学的染色によって確認されたこれらのメカニズムを再現することができました。
この動物モデルにおけるEndMT誘発性線維症の刺激因子は未熟さと流れの停滞であるが、他のモデルは遺伝子組み換え、高血圧、または食事制限を通じてEndMTを誘発するように設計されている9,25。他の種と比較して、新生仔ラットは出生時に非常に未熟であるため、特にEndMTを受けやすいです。
私たちらは、トランスジェニック系統追跡を介してEFEの起源をよりよく研究するためにマウスを使用しましたが、いくつかの制限について議論する必要があります3,22。第一に、モデルの複雑さにより、マウスの死亡率はラットと比較して高く、EFEの提示はより不均一です。したがって、ラットモデルはより信頼性が高く、再現性があります。心エコー検査は、研究期間中の移植片機能を評価するために重要であり、これらの測定により、吻合の拍動と開存性を評価するだけでなく、移植片機能と収縮性も研究できることを示しました。経験を積めば、LVの菌株解析など、移植された心臓のより高度な解析をラットモデルで行えるようになる。げっ歯類以外の大型動物でも同様の病態生理学的状態が誘発されるかどうかは現在のところ不明であり、さらなる調査が必要である。
結論として、この小児動物モデルはEndMTのヒト疾患を模倣しており、EndMTの調節を決定し、この病理学的プロセスを阻害するための薬理学的介入を研究するのに役立ちます。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
この研究は、オーストリア連邦教育科学研究省BMBWFCから提供された資金から、追加のベンチャーである単心室研究基金(SVRF)および単心室拡張基金(IFへ)とOeAD-GmbHのマリエッタブラウ奨学金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
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