Summary
В этой работе представлена животная модель фиброза, индуцированного эндотелиально-мезенхимальным переходом, наблюдаемого при врожденных пороках сердца, таких как критический аортальный стеноз или синдром гипоплазии левых отделов сердца, что позволяет провести детальную гистологическую оценку тканей, идентифицировать регуляторные сигнальные пути и протестировать варианты лечения.
Abstract
Эндокардиальный фиброэластоз (ЭФЭ), определяемый накоплением субэндокардиальной ткани, оказывает значительное влияние на развитие левого желудочка (ЛЖ) и не позволяет пациентам с врожденным критическим аортальным стенозом и синдромом гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС) проводить анатомическую бивентрикулярную хирургическую операцию. Хирургическая резекция в настоящее время является единственным доступным терапевтическим вариантом, но ЭФЭ часто рецидивирует, иногда с еще более инфильтративным характером роста в соседний миокард.
Для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе ЭФЭ, и изучения терапевтических стратегий, была разработана модель на животных, пригодная для доклинических испытаний. Животная модель учитывает, что ЭФЭ является заболеванием незрелого сердца и связано с нарушениями кровотока, что подтверждается клиническими наблюдениями. Таким образом, гетеротопическая трансплантация сердца неонатальных донорских сердец крыс является основой для данной модели.
Неонатальное сердце крысы трансплантируется в брюшную полость крысы-подростка и соединяется с инфраренальной аортой реципиента и нижней полой веной. В то время как перфузия коронарных артерий сохраняет жизнеспособность донорского сердца, застой потока в ЛЖ индуцирует рост EFE в очень незрелом сердце. Основным механизмом образования ЭФЭ является переход эндотелиальных клеток эндокарда в мезенхимальные клетки (EndMT), что является хорошо описанным механизмом раннего эмбрионального развития клапанов и перегородок, а также ведущей причиной фиброза при сердечной недостаточности. Образование ЭФЭ можно макроскопически наблюдать в течение нескольких дней после трансплантации. Трансабдоминальная эхокардиография используется для контроля жизнеспособности, сократительной способности и проходимости анастомозов трансплантата. После эвтаназии забор ткани EFE, которая демонстрирует те же гистопатологические характеристики, что и ткань EFE человека у пациентов с HLHS.
Эта модель in vivo позволяет изучать механизмы развития ЭФЭ в сердце и тестировать варианты лечения для предотвращения этого патологического тканевого образования, а также дает возможность для более обобщенного исследования фиброза, индуцированного EndMT.
Introduction
Эндокардиальный фиброэластоз (ЭФЭ), определяемый накоплением коллагеновых и эластических волокон в субэндокардиальной ткани, проявляется в виде перламутрового или непрозрачного утолщенного эндокарда; ЭФЭ наиболее активно развивается во внутриутробном периоде и в раннем младенчестве1. В аутопсийном исследовании 70% случаев с синдромом гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС) были связаны с наличием EFE2.
Клетки, экспрессирующие маркеры фибробластов, являются основной клеточной популяцией в EFE, но эти клетки также одновременно экспрессируют эндотелиальные маркеры эндокарда, что является признаком происхождения этих EFE-клеток. Наша группа ранее установила, что основной механизм образования EFE включает фенотипическое изменение эндотелиальных клеток эндокарда в фибробласты через эндотелиально-мезенхимальный переход (EndMT)3. EndMT может быть обнаружен с помощью иммуногистохимического двойного окрашивания для эндотелиальных маркеров, таких как кластер дифференцировки (CD) 31 или эндотелиальный (VE)-кадгерин (CD144) и маркеры фибробластов (например, альфа-гладкомышечный актин, α-SMA). Кроме того, ранее мы также установили регуляторную роль пути TGF-ß в этом процессе с активацией транскрипционных факторов SLUG, SNAIL и TWIST3.
EndMT — это физиологический процесс, который происходит во время эмбрионального развития сердца и приводит к образованию перегородок и клапанов из эндокардиальных подушек4, но он также вызывает фиброз органов при сердечной недостаточности, фиброзе почек или раке и играет ключевую роль в атеросклерозе сосудов 5,6,7,8. EndMT при фиброзе сердца в основном регулируется через TGF-β путь, о чем мы и другие сообщали 3,9. Были описаны различные стимулы, индуцирующие EndMT: воспаление 10, гипоксия 11, механические изменения 12 и нарушения кровотока, включая изменения внутриполостного кровотока 13, и EndMT также может быть следствием генетического заболевания 14.
Эта животная модель была разработана с использованием ключевых компонентов развития сердечного ЭФЭ, которыми являются незрелость и изменения внутриполостного кровотока, в частности, застой кровотока. Незрелость была восполнена за счет использования сердец новорожденных крыс в качестве доноров, поскольку известно, что неонатальные крысы являются незрелыми в развитии сразу после рождения. Гетеротопическая трансплантация сердца обеспечивала ограничение внутриполостного кровотока15.
С клинической точки зрения эта животная модель позволяет лучше изучить влияние ЭндМТ на растущий левый желудочек (ЛЖ). Задержка роста, налагаемая на сердце плода и новорожденного путем индуцированного EndMT формирования EFE16, не позволяет пациентам с обструкцией выводящих путей левого желудочка (LVOTO), такими как врожденный критический аортальный стеноз и синдром гипоплазии левых отделов сердца (СГЛО), лечить анатомическую бивентрикулярную хирургическую операцию17. Эта животная модель облегчает изучение клеточных механизмов и регуляции формирования тканей с помощью EndMT и позволяет тестировать варианты фармакологического лечения 3,18.
Трансабдоминальная эхокардиография используется для контроля жизнеспособности, сократительной способности и проходимости анастомозов трансплантата. После эвтаназии образование ЭФЭ можно макроскопически наблюдать в течение 3 дней после трансплантации. Ткань EFE демонстрирует те же гистопатологические характеристики, что и ткань EFE человека у пациентов с LVOTO.
Таким образом, эта животная модель, хотя и разработанная для педиатрического использования в спектре HLHS, может быть применена при изучении различных заболеваний на основе молекулярного механизма EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных проводились в соответствии с Национальным исследовательским советом. 2011. Руководство по уходу и использованию лабораторных животных: восьмое издание. Протоколы содержания животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Бостонской детской больнице.
Перед операцией все хирургические инструменты проходят автоклавирование паром, а модифицированный буфер Кребса-Хенселейта с конечной концентрацией 22 ммоль/л KCl готовят в виде кардиоплегического раствора (табл. 1). Раствор стерилизуют фильтром и хранят при температуре 4 °С в течение ночи. Хирургический микроскоп (12,5x) необходим для процедуры гетеротопической трансплантации сердца новорожденной крысы.
1. Подготовка и анестезия
- Используйте самцов/самок крыс Льюиса весом около 150 г (в возрасте 5-6 недель) в качестве реципиентов.
- Для начала щедро побрейте живот крысы бритвой.
- Поместите крысу в изофлурановую камеру и включите поток кислорода со скоростью 2 л/мин с 2% изофлураном до тех пор, пока животное не получит надлежащие седативные препараты, но все еще будет самопроизвольно дышать. Вводят 45 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно (ВП), а также 300 ЕД/кг гепарина. Подтвердите надлежащую анестезию с помощью теста на защемление пальца ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте спонтанное дыхание и частоту сердечных сокращений путем пальпации грудной клетки, чтобы обеспечить стабильный гемодинамический статус на протяжении всего процесса. - Для интубации поместите крысу на наклонную полку (рис. 1), зафиксируйте передние зубы веревкой и положите голову лицом к хирургу.
- Поместите свет с внешней стороны шеи на область голосовых связок, захватите язык двумя пальцами и слегка надавите на него вверх и влево, чтобы обеспечить оптимальный обзор для интубации. Используйте канюлю 18 г, 2 г для крысы весом 100-150 г. Закрепите внутритрахеальную трубку скотчем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для интубации рекомендуются хирургические лупы с 3,5-кратным увеличением. - Подключите интубационную канюлю к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких животных и отрегулируйте настройки в соответствии с инструкциями производителя в зависимости от размера животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие настройки для крысы весом 150 г: режим громкости; частота дыхания, 55/мин; дыхательный объем, 1,3 мл 50 % соотношение I/E, но при необходимости его можно соответствующим образом отрегулировать. Обеспечьте правильное двустороннее и равномерное движение грудной клетки и непрерывно вводите изофлуран в дозе 0,5–2% через аппарат искусственной вентиляции легких. - Положите крысу на грелку (для поддержания нормальной температуры тела) в лежачем положении хвостом к хирургу. Трижды простерилизуйте брюшную полость раствором бетадина и 70% этиловым спиртом попеременно. Введите глазную смазку и накройте крысу стерильной хирургической простыней, оставив брюшную полость открытой.
2. Хирургическая подготовка и гетеротопическая трансплантация неонатального донорского сердца крысе-реципиенту
- Выполните срединную лапаротомию с использованием скальпеля с 15 лезвиями для разреза кожи и используйте ножницы, чтобы вскрыть переднюю брюшную стенку, с последующим тупым обнажением забрюшинной брюшной аорты и нижней полой вены (IVC) с помощью аппликаторов с ватным наконечником.
- Мобилизуйте кишечник (включая нисходящую ободочную кишку) и поместите его в правый верхний квадрант. Накройте кишечник теплой марлей, пропитанной физиологическим раствором. Используйте ретракторы, чтобы обеспечить оптимальную экспозицию НПВ и брюшной аорты.
- Выполняют тупое рассечение инфраренальной НПВ и брюшной аорты вверх по направлению к бифуркации. Перевязать все инфраренальные ветвящиеся артерии и вены (например, нижнюю брыжеечную артерию и артерии лимфатических узлов) нейлоновым швом 10-0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует большая вариативность анатомии этих боковых ветвей. Визуально контролируйте пульс и частоту сердечных сокращений аорты, когда другие методы гемодинамического мониторинга недоступны. Каждые 15 минут оценивайте надлежащую глубину анестезии с помощью теста на защемление пальца ноги. Отрегулируйте концентрацию изофлурана соответствующим образом. - После того, как донорское сердце будет извлечено у неонатальной крысы, доставьте вырезанное сердце в стерильных условиях в хирургический бассейн, содержащий буфер Кребса-Хенселейта, в операционное поле. Периодически орошать донорское сердце ледяным кардиоплегическим раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии второго хирурга сердце должно быть подготовлено одновременно, так как второй хирург сокращает общее время анестезии животного-реципиента и время ишемии донорского сердца. Если второй хирург недоступен, покройте живот реципиента теплым физиологическим раствором и наблюдайте за животным во время процедуры забора. - Наложите четыре небольших атравматических сосудистых зажима на дистальный и проксимальный сегменты инфраренальной аорты и НПВК. При необходимости временно окклюзировать неблагоприятный почечный сосуд шелковым швом 7-0 и снять шов после процедуры. Наложите нейлоновый шов 10-0 вертикально на переднюю стенку аорты, чтобы облегчить аортотомию. Выполняют микроножницами аортотомию с двумя небольшими горизонтальными разрезами (клиновидными), слегка подтягивая шов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления тромбов рекомендуется промывание просвета аорты гепаринизированным физиологическим раствором. - Поместите донорское сердце на левую (с точки зрения животного) сторону аорты и закрепите инфраренальную аорту реципиента и восходящую аорту донора встык в положениях «12 часов» и «6 часов» аортотомии с помощью швов. Продолжайте накладывать третий и четвертый швы в положениях «3 часа» и «9 часов», осторожно переворачивая сердце на правую сторону аорты после наложения третьего шва. Завершите артериальный анастомоз, наложив один-два шва на каждое промежутк.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать прикосновения щипцами к восходящей аорте донора или брюшной аорте реципиента при создании анастомоза, чтобы избежать повреждения тканей. - Поверните крысу против часовой стрелки так, чтобы голова была обращена к левой руке хирурга. Переместите донорскую аорту в левую сторону брюшной аорты, чтобы обеспечить оптимальный обзор НПВК.
- Выполните венотомию на НПВ, немного проксимальнее аортального анастомоза, используя лезвие 11 для прокола и микроножницы для адекватной регулировки размера в соответствии с диаметром легочного ствола донора. Снова промойте внутрикавальный просвет гепаринизированным физиологическим раствором.
- Начните с венозного анастомоза между НПВ реципиента и легочным стволом донора, что лучше всего достигается путем наложения прерывистых нейлоновых швов 11-0 на заднюю стенку сосуда, начиная с положений «12 часов» и «6 часов» (связанных с НПВ), а затем наложите непрерывный нейлоновый шов 11-0 на переднюю стенку (от положения «6 часов» к положению «12 часов»).
- Накройте анастомозы небольшими полосками рассасывающейся желатиновой губки и снимите микрососудистые зажимы, начиная дистально. Используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы слегка сжать губки для достижения оптимального гемостаза.
- Понаблюдайте за наполнением коронарных сосудов трансплантата в момент освобождения дистальных микрососудистых зажимов, и убедитесь, что донорское сердце начинает биться сразу после освобождения проксимального зажима.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность трансплантата может быть оценена от 0 до 4 во время операции в соответствии с модифицированным Стэнфордским баллом19 для подтверждения адекватной функции трансплантата. - Поместите кишечник обратно в брюшную полость, следя за тем, чтобы не деформировать артериальный и венозный анастомоз.
- Мелоксикам (1 мг/кг) и этика XR (0,65 мг/кг) вводят подкожно, пока животное находится под полным наркозом, чтобы убедиться в послеоперационной анальгезии. Затем закройте брюшную стенку непрерывным рассасывающимся швом 5-0, а затем закройте кожу рассасывающимся швом с викрилом 6-0 внутрикожно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации по распространенным неисправностям и устранению неполадок представлены в таблице 2.
3. Забор сердца неонатального донора
- Поместите крысу-донора новорожденного в камеру, инсуффляцию изофлураном (2%) для седации. Вводят кетамин (75 мг/кг) и ксилазин (5 мг/кг), а также гепарин (300 ЕД/кг) внутрибрюшинно.
- Подтвердите глубину анестезии, ущипнув пальцы ног, и уложите крысу в положение лежа на спине хвостом к себе. Стерилизовать всю грудную клетку и брюшную стенку бетадином и 70% этанолом поочередно три раза. Накройте крысу стерильной хирургической простыней.
- Используя 12,5-кратный хирургический микроскоп, удалите всю переднюю грудную стенку, начав с горизонтального разреза скальпелем с 15 лезвиями в ксифозе с последующими вертикальными разрезами ножницами латерально до подмышечных впадин с обеих сторон. Затем переднюю грудную стенку можно удалить, сделав еще один горизонтальный разрез прямо под шеей.
- Рассекают ножницами НПВК, правую и левую верхнюю полую вену и легочные сосуды, а затем окружают и перевязывают все сосуды шелковым швом 7-0. Введите 3 мл ледяного модифицированного раствора Кребса-Хенселейта с высоким содержанием калия в правое предсердие, проколов НПВ иглой 30 G и слегка надавливая щипцами на диафрагму.
- Разрежьте ножницами IVC, SVC, легочные сосуды и аорту. Пересеките легочные артерии как можно дальше и аорту дистальнее брахиоцефального ствола, чтобы обеспечить правильную длину, используя скальпель с 11 лезвиями.
- Отделить легочный ствол и восходящую аорту микроножницами и промыть сердце ледяным кардиоплегическим раствором с помощью шприца объемом 3 мл.
4. Восстановление реципиента и мониторинг трансплантата
- После операции дайте крысе достаточно времени, чтобы проснуться, что обычно происходит в течение 15 минут, и дайте ей восстановиться на грелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики не требуются из-за очень низкого риска инфекции и для того, чтобы не скомпрометировать экспериментальную модель, и не применяются ограничения в пище или воде. - После трансплантации ежедневно контролируйте функцию трансплантата, пальпируя пересаженное сердце, но учтите, что иногда это может быть трудно оценить из-за наложения кишечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиография брюшной полости позволяет более точно измерить жизнеспособность трансплантата. Для проведения эхокардиографии слегка успокойте крысу изофлураном (1-2%), вдыхаемым через носовой конус, и положите ее на грелку. Эхокардиография обычно проводится на 1-й, 7-й и 14-й сутки послеоперационного периода. Для оценки частоты сердечных сокращений и сократительной способности можно легко получить изображения по длинной и короткой осям (рис. 2A, B). Для оценки анастомозов используют допплеровскую эхокардиографию (рис. 3А) и подтверждают образование ткани ЭФЭ в виде эхо-яркого эндокардиального слоя в полости левого желудочка (рис. 3Б, В).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жизнеспособность привоя и биение
В данной работе проводилась визуальная оценка жизнеспособности трансплантата после снятия всех зажимов, а при открытой брюшной полости для наблюдения за трансплантатом допускалось приблизительное время реперфузии 10-15 мин. Та же система оценки для объективной проверки жизнеспособности трансплантата использовалась для визуальной оценки в конце операции и для эхокардиографии на POD 1, POD 7 и POD 14.
0 = нет функции органа; 1 = функция органа (покоя), только минимальное сокращение; 2 = слабая или частичная функция органа; 3 = сократительная скорость или интенсивность снижена, но однородная функция органа; 4 = оптимальное сокращение предсердий и желудочков (120-160 уд/мин). Оценка в 3 или 4 балла была оценена как успешная. Пальпаторная оценка абдоминального донорского трансплантата использовалась для контроля жизнеспособности трансплантата между временными точками эхокардиографической оценки.
Смертность и жизнеспособность трансплантата
В период с октября 2022 года по декабрь 2022 года процедура была представлена новой хирургической бригаде в исследовательском центре, и за этот период в исследовательском центре было выполнено 19 неонатальных гетеротопических трансплантаций сердца крыс. Немедленная операционная выживаемость составила 79%, а успешность жизнеспособности трансплантата (наличие жизнеспособного, бьющегося донорского сердца) составила 84%. Характеристики процедуры представлены в таблице 3.
Среди 12 выживших животных 2 нуждались в эвтаназии до 2-недельной конечной точки исследования, 1 из-за кишечной непроходимости кишечника (n = 1), а еще один из-за боли, не облегченной обезболивающими препаратами (n = 1), и 2 были усыплены намеренно через 1 неделю после операции.
У трех крыс примененная модифицированная оценка по шкале Стэнфорда увеличилась с 3 до 4 баллов между непосредственной послеоперационной визуальной оценкой и эхокардиографической оценкой на POD 1. Среди восьми выживших крыс в конечной точке через 14 дней модифицированные стэнфордские баллы при эхокардиографии составляли четыре для семи животных и три для одного животного. Наиболее частой причиной смерти в этой серии была гемодинамическая недостаточность из-за чрезмерной кровопотери как следствие очень незрелого сердца и, следовательно, хрупкости донорских сосудов для анастомоза или длительного времени анестезии.
Гистологическое исследование ткани EFE
После эвтаназииСО2 крысы-реципиента была проведена повторная лапаротомия в условиях стерильной подготовки. Донорский трансплантат иссекали и сразу помещали в физиологический раствор на лед для дальнейшей обработки. Горизонтальный срез резецировали на уровне среднего желудочка правого и левого желудочков, помещали в среду для встраивания с оптимальной температурой резания (ОКТ) и замораживали в жидком азоте (рис. 4А). Все остальные ткани замораживали жидким азотом и хранили в морозильной камере при температуре −80°C для дальнейшего анализа. Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа (рис. 4B-D).
Иммуногистохимическое окрашивание в качестве золотого стандарта для идентификации EndMT проводили с использованием 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (синий), VE-кадгерина в качестве эндотелиального маркера (красный) и α-SMA в качестве маркера фибробластов (зеленый). Фосфорилированные белки SMAD и транскрипционный фактор SLUG/SPLAIN также окрашивали в ткани EFE (рис. 5A-E)3,20.
Рисунок 1: Наклонная полка для интубации. Крысу укладывают на спину, передние зубы закрепляют веревкой, а голову смотрят в сторону хирурга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Эхокардиографическое изображение ЛЖ по длинной оси . (А) Нативное сердце крысы, указывающее на нормальное наполнение во время диастолы. (Б) Донорский трансплантат с застоем потока в ЛЖ. Уменьшение объемной нагрузки во время диастолы. Сокращения: ЛЖ = левый желудочек; MV = митральный клапан; LVOT = выходной тракт левого желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка анастомозов и ЭФЭ. (А) Эхокардиографическое цветное допплеровское исследование с указанием открытого артериального (красная стрелка) и венозного (синяя стрелка) анастомозов. (B,C): Эхо-яркая поверхность эндокарда в полости ЛЖ, указывающая на ЭФЭ (белые стрелки). Сокращения: ЛЖ = левый желудочек; EFE = эндокардиальный фиброэластоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Макроскопическая и микроскопическая оценка тканей . (А) Поперечное сечение среднего желудочка через ЛЖ и ПЖ. Белые стрелки указывают на ткань EFE. (Б) Гематоксилин-эозин, (В) трихром Массона (MTS) и (D) Окрашивание по Эластину ван Гизону (EVG). Большое увеличение указывает на то, что ткань EFE (черные стрелки) содержит большое количество организованных коллагеновых волокон (синие в MTS) и эластиновые волокна (черные в EVG). Сокращения: ЛЖ = левый желудочек; ПЖ = правый желудочек; EFE = эндокардиальный фиброэластоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение гистологических и иммуногистологических изображений. (А) Окрашивание гематоксилин-эозином. (Б-Е) Иммуногистохимическое окрашивание; Ткань EFE, дважды окрашенная на (B,C) VE-кадгерин и α-SMA, (D) CD31 и фосфо-SMAD2/SMAD3 (локализованные с ядрами, окрашенными DAPI синего цвета), и (E) CD31 и SLUG/SLAY (локализованы с ядрами, окрашенными DAPI синего цвета), что указывает на EndMT, как показано белыми стрелками. Сокращения: ЛЖ = левый желудочек; EFE = эндокардиальный фиброэластоз; EndMT = эндотелиально-мезенхимальный переход. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| 1 литр стерилизованной, дистиллированной воды | |
| NaCl | 118 ммоль/л |
| KCl | 22 ммоль/л |
| Х2ПО4 | 1,2 ммоль/л |
| MgSO4 | 1,2 ммоль/л |
| NaHCO3 | 25 ммоль/л |
| Глюкоза | 11 ммоль/л |
| CaCl2 | 2,5 ммоль/л |
Таблица 1: Состав модифицированного буфера Кребса-Хенселейта. Кардиоплегический раствор с высоким содержанием калия (22 ммоль/л KCl) готовят, стерилизуют фильтром и хранят при температуре 4 °C в течение ночи.
| Распространенные сбои и устранение неполадок | ||
| Трансплантат не начинает биться/коронарные артерии не заполняются после отпускания зажимов | Проверка на тромбообразование при артериальном анастомозе | |
| Проверка времени ишемии (=общее время остановки) (не должно превышать 100 минут) | ||
| Долгое пробуждение или крыса не просыпается после операции | Контролируйте силу и частоту пульса во время операции и уменьшайте ингаляцию изофлурана, если гемодинамика слабая | |
| Немедленный послеоперационный покрасневший или некротический кишечник вызывает подозрение на снижение интраоперационной гемодинамики, часто из-за длительного времени анестезии | ||
| Слабая гемодинамика сразу после лапаротомии | Отрегулируйте поток изофлурана для анестезии | |
| Оцените интубацию и правильное движение грудной клетки: односторонняя интубация, пневмоторакс, обструкция эндотрахеального просвета являются распространенными неудачами в начале. | ||
| Крыса просыпается, но умирает в первые 24 часа | Обширная кровопотеря во время операции | |
| Если при вскрытии в брюшной полости обнаружено повышенное количество крови, то, скорее всего, это связано с нарушением анастомоза | ||
Таблица 2: Распространенные сбои и устранение неисправностей. Тщательный мониторинг и повторная оценка неудачных процедур имеют решающее значение для достижения высокого уровня выживаемости в этой модели.
| Вес крысы-реципиента в граммах, медиана [IQR] | 150 [50] |
| Возраст донора в днях, медиана [IQR] | 3 [1] |
| Вес донора в граммах, медиана [IQR] | 9 [2] |
| Время ишемии трансплантата в минутах, медиана [IQR] | 100 [25] |
| Частота послеоперационных успехов, n | 16/19 (=84%) |
Таблица 3: Характеристика процедуры. Выбор реципиента и донора, время ишемии трансплантата и выживаемость. Аббревиатура: IQR = интерквартильный размах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта животная модель гетеротопической трансплантации сердца новорожденного донора крысы в брюшную полость реципиента создает возможность изучать фиброз, полученный из EndMT, путем детальной гистологической оценки тканей, определения регуляторных сигнальных путей и тестирования вариантов лечения. Поскольку EndMT является основным механизмом фиброзных заболеваний сердца, эта модель имеет большое значение в области детской кардиохирургии и за ее пределами. В этой модели многие факторы могут негативно повлиять на результат процедуры. Таким образом, правильное обращение с очень хрупкими тканями из-за незрелости донорского сердца, правильное обращение с животными во время анестезии и высокий уровень микрохирургических навыков являются основными требованиями для успеха этой модели. При проведении этих экспериментов должна использоваться оптимальная техническая установка, включающая операционный микроскоп, аппарат искусственной вентиляции легких мелких животных и микрохирургические инструменты. Хотя это и не обязательно, базовый мониторинг частоты сердечных сокращений или температуры тела может быть полезен, особенно для неопытных хирургов, для контроля гемодинамики и глубины анестезии.
К важным хирургическим аспектам, которые следует учитывать, относится незрелость сердца неонатального донора, что делает ткань очень хрупкой и делает восходящую аорту и легочный ствол уязвимыми для разрывов. Таким образом, любое обращение должно осуществляться с большой осторожностью. Из-за мелких сосудов, используемых для анастомоза, рекомендуется выполнять артериальный анастомоз с прерывистыми швами и прерывистым промыванием места анастомоза гепаринизированным физиологическим раствором, что помогает избежать тромбообразования. Отбор новорожденных крыс соответствующего возраста необходим для решения проблемы использования слишком незрелых сердец и, следовательно, сильно восприимчивых к разрыву анастомоза. С другой стороны, после определенного возраста, составляющего около 7 дней, EndMT больше не может быть воспроизведен на этой животной модели15.
EndMT был идентифицирован как центральный механизм различных видов сердечного фиброза и атеросклероза, но исследования были затруднены из-заотсутствия моделей in vivo. Основные разработки в области исследований EndMT ограничены моделями клеточных культур, которым присущи ограничения 3,8,9. Кроме того, исследования эндотелиальных клеток эндокарда еще более ограничены. В качестве альтернативы эндотелиальные клетки коронарных артерий часто используются в качестве заменителя, поскольку, как сообщается, они частично происходят из эндокардиальных клеток21. Таким образом, эта животная модель может быть использована не только для лечения фиброза сердца, но и для изучения важных патомеханизмов индуцированного потоком EndMT при атеросклерозе. Что касается врожденных пороков сердца, мы показали способность воспроизводить переход от здоровой эндокарда к ткани EFE через EndMT на нашей модели крысы, с EFE, которая структурно напоминает ткань EFE человека. Существуют некоторые разногласия относительно клеточного происхождения мезенхимальных клеток в ткани EFE. Clark et al.22 сообщили, что клетки эпикарда вносят свой вклад в EFE, но наши данные показали, что большая часть ткани EFE происходит через эндотелиальные клетки эндокарда, подвергающиеся EndMT3. В настоящее время проводятся эксперименты на уровне одной клетки для выяснения клеточного происхождения ткани EFE.
С помощью этой модели in vivo можно изучать регуляторные пути EndMT. Было показано, что дисбаланс, в частности, увеличение пути TGF-ß и нарушение передачи сигналов костного морфогенетического белка (BMP), играет важную роль в эндокардиальных клетках, экспрессирующих транскрипционные факторы, регулирующие EndMT. Кроме того, сообщалось, что передача сигналов Jagged/NOTCH и Wnt/ß-катенин индуцируют EndMT 3,23. Путь TGF-ß индуцирует активацию транскрипционных факторов, таких как SLUG, SLAY и TWIST, через белки SMAD, тем самым регулируя EndMT20,24. В этой животной модели мы смогли повторить эти механизмы, которые были подтверждены иммуногистохимическим окрашиванием.
Стимулирующими факторами для фиброза, индуцированного EndMT, в этой животной модели являются незрелость и застой потока, в то время как другие модели предназначены для индуцирования EndMT посредством генетических модификаций, гипертонии или диетических ограничений 9,25. По сравнению с другими видами, неонатальные крысы очень незрелые при рождении, и поэтому они особенно восприимчивы к EndMT.
Мы и другие ученые использовали мышей для лучшего изучения происхождения EFE с помощью отслеживания трансгенных линий, но необходимо обсудить несколько ограничений. Во-первых, из-за сложности модели показатели смертности у мышей выше, чем у крыс, а проявления EFE более неоднородны; Поэтому модель крысы более надежна и воспроизводима. Эхокардиографические измерения имеют решающее значение для оценки функции трансплантата на протяжении всего периода исследования, и мы показали, что с помощью этих измерений, наряду с оценкой пульсации и проходимости анастомозов, также можно изучать функцию трансплантата и сократительную способность. С большим опытом можно было бы проводить еще более сложные анализы трансплантированного сердца, такие как анализ деформации ЛЖ, на крысах. В настоящее время неясно, может ли такое же патофизиологическое состояние быть индуцировано у более крупных животных, кроме грызунов, и это требует дальнейшего изучения.
В заключение, эта педиатрическая животная модель имитирует заболевание человека EndMT и может быть полезна для определения регуляции EndMT и изучения фармакологических вмешательств для ингибирования этого патологического процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Дополнительными предприятиями - Фондом исследований одного желудочка (SVRF) и Фондом расширения одного желудочка (для И.Ф.), а также стипендией Мариетты Блау от OeAD-GmbH из средств, предоставленных Федеральным министерством образования, науки и исследований Австрии BMBWFC (G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
