Summary
Bu çalışma, kritik aort darlığı veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi konjenital kardiyak defektlerde görüldüğü gibi, endotelyal-mezenkimal geçişe bağlı fibrozun bir hayvan modelini sunar, bu da ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesine, düzenleyici sinyal yollarının tanımlanmasına ve tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır.
Abstract
Subendokardiyal doku birikimi ile tanımlanan endokardiyal fibroelastoz (EFE), sol ventrikül (LV) gelişimi üzerinde önemli etkilere sahiptir ve konjenital kritik aort darlığı ve hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) olan hastaların küratif anatomik biventriküler cerrahi onarımını engeller. Cerrahi rezeksiyon şu anda mevcut tek terapötik seçenektir, ancak EFE sıklıkla tekrarlar, bazen komşu miyokarda daha da infiltratif bir büyüme paterni ile.
EFE'nin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak ve terapötik stratejileri araştırmak için klinik öncesi testlere uygun bir hayvan modeli geliştirilmiştir. Hayvan modeli, EFE'nin olgunlaşmamış kalbin bir hastalığı olduğunu ve klinik gözlemlerle desteklendiği gibi akış bozuklukları ile ilişkili olduğunu dikkate alır. Bu nedenle, yenidoğan sıçan donör kalplerinin heterotopik kalp nakli bu modelin temelidir.
Bir yenidoğan sıçan kalbi, bir ergen sıçanın karnına nakledilir ve alıcının infrarenal aortuna ve inferior vena kavasına bağlanır. Koroner arterlerin perfüzyonu donör kalbin canlılığını korurken, LV içindeki akış durgunluğu çok olgunlaşmamış kalpte EFE büyümesini indükler. EFE oluşumunun altında yatan mekanizma, endokardiyal endotel hücrelerinin, kapakların ve septanın erken embriyonik gelişiminin iyi tanımlanmış bir mekanizması olan ve aynı zamanda kalp yetmezliğinde fibrozisin önde gelen nedeni olan mezenkimal hücrelere (EndMT) geçişidir. EFE oluşumu transplantasyondan sonraki günler içinde makroskopik olarak gözlenebilir. Transabdominal ekokardiyografi, greft canlılığını, kontraktilitesini ve anastomozların açıklığını izlemek için kullanılır. Ötenaziyi takiben, EFE dokusu alınır ve HLHS hastalarından alınan insan EFE dokusu ile aynı histopatolojik özellikleri gösterir.
Bu in vivo model, kalpte EFE gelişim mekanizmalarının incelenmesine ve bu patolojik doku oluşumunu önlemek için tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır ve EndMT ile indüklenen fibrozisin daha genel bir incelemesi için fırsat sağlar.
Introduction
Subendokardiyal dokuda kollajen ve elastik liflerin birikmesiyle tanımlanan endokardiyal fibroelastoz (EFE), inci veya opak kalınlaşmış bir endokard olarak ortaya çıkar; EFE, fetal dönemde ve erken bebeklik döneminde en aktif büyümeye uğrar1. Bir otopsi çalışmasında, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) olan vakaların %70'i EFE2 varlığı ile ilişkilendirilmiştir.
Fibroblastlar için belirteçleri eksprese eden hücreler, EFE'deki ana hücre popülasyonudur, ancak bu hücreler aynı zamanda bu EFE hücrelerinin kökeninin bir göstergesi olan endokardiyal endotelyal belirteçleri de eksprese eder. Grubumuz daha önce EFE oluşumunun altında yatan mekanizmanın, endotelyal-mezenkimal geçiş (EndMT) yoluyla endokardiyal endotel hücrelerinin fibroblastlara fenotipik bir değişimini içerdiğini tespit etmiştir3. EndMT, farklılaşma kümesi (CD) 31 veya vasküler endotelyal (VE)-kaderin (CD144) ve fibroblast belirteçleri (örneğin, alfa-düz kas aktini, α-SMA) gibi endotelyal belirteçler için immünohistokimyasal çift boyama kullanılarak tespit edilebilir. Ayrıca, daha önce SLUG, SNAIL ve TWIST3 transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu ile TGF-ß yolunun bu süreçteki düzenleyici rolünü de belirlemiştik.
EndMT, embriyonik kardiyak gelişim sırasında meydana gelen ve endokardiyal yastıklardansepta ve kapakçıkların oluşumuna yol açan fizyolojik bir süreçtir 4, ancak aynı zamanda kalp yetmezliği, böbrek fibrozu veya kanserde organ fibrozuna neden olur ve vasküler aterosklerozda anahtar rol oynar 5,6,7,8. Kardiyak fibrozda EndMT, biz ve diğerlerininbildirdiği gibi, esas olarak TGF-β yolu ile düzenlenir 3,9. EndMT'yi indüklemek için çeşitli uyaranlar tanımlanmıştır: inflamasyon10, hipoksi 11, mekanik değişiklikler12 ve intrakaviter kan akışındakideğişiklikler 13 dahil olmak üzere akış bozuklukları ve EndMT ayrıca genetik bir hastalığın14 sonucu olabilir.
Bu hayvan modeli, olgunlaşmamışlık ve intrakaviter kan akışındaki değişiklikler, özellikle akış durgunluğu olan kardiyak EFE gelişiminin temel bileşenleri kullanılarak geliştirilmiştir. Yenidoğan sıçanlarının doğumdan hemen sonra gelişimsel olarak olgunlaşmamış oldukları bilindiğinden, olgunlaşmamışlık yenidoğan sıçan kalplerinin donör olarak kullanılmasıyla yerine getirildi. Heterotopik kalp nakli, intrakaviter akım kısıtlamasısağlanmasını önerdi 15.
Klinik açıdan bakıldığında, bu hayvan modeli, EndMT'nin büyüyen sol ventrikül (LV) üzerindeki etkisinin daha iyi araştırılmasına olanak tanır. EndMT ile indüklenen EFE oluşumu16 yoluyla fetal ve neonatal kalbe uygulanan büyüme kısıtlaması, konjenital kritik aort darlığı ve hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) gibi sol ventrikül çıkış yolu tıkanıklıkları (LVOTO) olan hastaların küratif anatomik biventriküler cerrahi onarımdan17 etkilenmesini engellemektedir. Bu hayvan modeli, EndMT aracılığıyla hücresel mekanizmaların incelenmesini ve doku oluşumunun düzenlenmesini kolaylaştırır ve farmakolojik tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır 3,18.
Transabdominal ekokardiyografi, greft canlılığını, kontraktilitesini ve anastomozların açıklığını izlemek için kullanılır. Ötenazi sonrası 3 gün içinde makroskopik olarak EFE oluşumu gözlenebilir. EFE dokusu, LVOTO'lu hastalardan alınan insan EFE dokusu ile aynı histopatolojik özellikleri gösterir.
Bu nedenle, bu hayvan modeli, HLHS spektrumunda pediatrik kullanım için geliştirilmiş olsa da, EndMT'nin moleküler mekanizmasına dayalı çeşitli hastalıklar incelenirken uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Araştırma Konseyi'ne uygun olarak yürütülmüştür. 2011. Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu: Sekizinci Baskı. Hayvan protokolleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
Ameliyattan önce, tüm cerrahi aletler buharla otoklavlanır ve nihai konsantrasyonu 22 mmol / L KCl olan modifiye Krebs-Henseleit tamponu kardiyoplejik bir çözelti olarak hazırlanır (Tablo 1). Çözelti filtre ile sterilize edilir ve gece boyunca 4 °C'de saklanır. Heterotopik neonatal sıçan kalp nakli işlemi için cerrahi mikroskop (12.5x) gereklidir.
1. Hazırlık ve anestezi
- Alıcı olarak yaklaşık 150 g (5-6 haftalık) ağırlığa sahip erkek / dişi Lewis sıçanlarını kullanın.
- Başlamak için, farenin karnını bir usturayla cömertçe tıraş edin.
- Sıçanı bir izofluran odasına yerleştirin ve hayvan uygun şekilde sakinleşene ancak yine de kendiliğinden nefes alana kadar% 2 izofluran ile 2 L / dk'da oksijen akışını açın. İntraperitoneal (IP) 45 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ve ayrıca 300 U / kg heparin enjekte edin. Ayak parmağı sıkışma testi ile uygun anesteziyi onaylayın.
NOT: Tüm süreç boyunca stabil bir hemodinamik durum sağlamak için göğsün palpasyonu yoluyla spontan solunum ve kalp atış hızını dikkatlice izleyin. - Entübasyon için, fareyi eğik bir rafa yerleştirin (Şekil 1), ön dişleri bir ip ile sabitleyin ve başı cerraha bakacak şekilde yerleştirin.
- Entübasyon için en uygun görüşü sağlamak için boynun dışındaki ışığı ses tellerinin bulunduğu bölgeye yerleştirin, dili iki parmağınızla tutun ve hafifçe yukarı ve sola doğru itin. 100-150 g sıçan için 18 G, 2 in kanül kullanın. İntratrakeal tüpü bantla sabitleyin.
NOT: Entübasyon için 3.5x büyütmeli cerrahi loblar önerilir. - Entübasyon kanülünü küçük hayvan ventilatörüne bağlayın ve hayvan boyutuna göre üreticinin talimatlarına göre ayarları yapın.
NOT: 150 g'lık bir sıçan için aşağıdaki ayarları kullanın: ses modu; solunum hızı, 55 / dak; gelgit hacmi, 1.3 mL %50 I/E oranı, ancak bu gerektiğinde uygun şekilde ayarlanabilir. Uygun bilateral ve eşit göğüs hareketini sağlayın ve ventilatörden sürekli% 0.5 -% 2 oranında izofluran uygulayın. - Fareyi, kuyruğu cerraha bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına (normal vücut ısısını korumak için) yerleştirin. Karnı üç kez betadin çözeltisi ve% 70 etanol ile dönüşümlü olarak sterilize edin. Göz yağını uygulayın ve fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün ve karnı açıkta bırakın.
2. Alıcı sıçanda yenidoğan donör kalbinin cerrahi hazırlığı ve heterotopik transplantasyonu
- Deri insizyonu için 15 bıçaklı bir neşter kullanarak orta hat laparotomi yapın ve karın ön duvarını açmak için makas kullanın, ardından retroperitoneal abdominal aort ve inferior vena kava'nın (IVC) pamuk uçlu aplikatörlerle künt olarak ortaya çıkarılması.
- Bağırsakları (inen kolon dahil) harekete geçirin ve sağ üst kadrana doğru yerleştirin. Bağırsakları ılık tuzlu suya batırılmış gazlı bezle örtün. IVC ve abdominal aortun optimum maruziyetini sağlamak için ekartörler kullanın.
- İnfrarenal IVC ve abdominal aortun bifurkasyona doğru künt diseksiyonunu yapın. Tüm infrarenal dallanan arterleri ve venleri (örn., inferior mezenterik arter ve lenf nodu arterleri) 10-0 naylon sütür ile bağlayın.
NOT: Bu yan dalların anatomisinde büyük değişkenlik vardır. Başka bir hemodinamik izleme olmadığında aortun nabzını ve kalp atış hızını görsel olarak izleyin. Her 15 dakikada bir ayak parmağı sıkışma testi ile uygun anestezi derinliğini değerlendirin. İzofluran konsantrasyonunu buna göre ayarlayın. - Donör kalbi yenidoğan bir sıçandan alındıktan sonra, eksize edilen kalbi steril koşullarda Krebs-Henseleit tamponu içeren bir cerrahi havzada cerrahi alana teslim edin. Donör kalbi aralıklı olarak buz gibi kardiyoplejik solüsyonla sulayın.
NOT: İkinci bir cerrah mevcut olduğunda, ikinci bir cerrah alıcı hayvanın toplam anestezi süresini ve donör kalbin iskemi süresini azalttığı için kalp aynı anda hazırlanmalıdır. İkinci bir cerrah bulunmadığında, alıcının karnını ılık tuzlu su ile örtün ve hasat prosedürü sırasında hayvanı izleyin. - İnfrarenal aort ve IVC'nin distal ve proksimal segmentlerine dört küçük atravmatik vasküler klemp uygulayın. Gerekirse, elverişsiz bir böbrek damarını 7-0 ipek sütür ile geçici olarak kapatın ve işlemden sonra dikişi serbest bırakın. Aortotomiyi kolaylaştırmak için aortun ön duvarına dikey olarak 10-0 naylon sütür yerleştirin. Sütürü hafifçe yukarı çekerek mikromakasla iki küçük yatay kesikle (kama şeklinde) bir aortotomi yapın.
NOT: Herhangi bir kan pıhtısını gidermek için aort lümeninin heparinize salin ile yıkanması önerilir. - Donör kalbini aortun sol tarafına (hayvanın bakış açısından) yerleştirin ve alıcının infrarenal aortunu ve vericinin yükselen aortunu aortotominin saat 12 ve saat 6 pozisyonlarında uçtan uca dikişlerle sabitleyin. Üçüncü ve dördüncü dikişlere saat 3 ve 9 pozisyonlarında devam edin, üçüncü dikişten sonra kalbi nazikçe aortun sağ tarafına çevirin. Her ara boşluğa bir ila iki sütür ekleyerek arteriyel anastomozu tamamlayın.
NOT: Doku hasarını önlemek için anastomoz oluştururken donörün çıkan aortuna veya alıcının abdominal aortuna forseps ile dokunmaktan kaçınmaya özen gösterilmelidir. - Fareyi, başı cerrahın sol eline bakacak şekilde saat yönünün tersine çevirin. IVC'de en iyi görüşü sağlamak için donörün aortunu abdominal aortun sol tarafına taşıyın.
- Vericinin pulmoner gövdesinin çapına göre yeterli boyut ayarı için ponksiyon için bir 11 bıçak ve mikromakas kullanarak, aort anastomozuna hafif proksimalde IVC üzerinde bir venotomi gerçekleştirin. Yine, intrakaval lümeni heparinize salin ile yıkayın.
- Alıcının IVC'si ile donörün pulmoner gövdesi arasındaki venöz anastomoz ile başlayın, bu en iyi şekilde saat 12 ve saat 6 konumlarından başlayarak damarın arka duvarına kesintili 11-0 naylon sütürler yerleştirerek elde edilir (IVC ile ilgili) ve ardından ön duvara (saat 6'dan saat 12'ye doğru) sürekli bir 11-0 naylon sütür yerleştirin.
- Anastomozları emilebilir bir jelatin süngerin küçük şeritleri ile örtün ve distal olarak başlayan mikrovasküler kelepçeleri çıkarın. Optimal hemostaz elde etmek için süngerleri hafifçe sıkıştırmak için pamuklu uçlu bir aplikatör kullanın.
- Distal mikrovasküler klemplerin serbest bırakılması sırasında greftin koroner damarlarının dolduğunu gözlemleyin ve proksimal klemp serbest bırakıldığında donör kalbin hemen atmaya başladığından emin olun.
NOT: Greftin canlılığı, yeterli greft fonksiyonunu doğrulamak için modifiye edilmiş bir Stanford skoru19'a göre intraoperatif olarak 0'dan 4'e kadar puanlanabilir. - Arteriyel ve venöz anastomozun bozulmamasına dikkat ederek bağırsakları tekrar karın içine yerleştirin.
- Postoperatif analjeziyi tespit etmek için hayvan tamamen uyuşturulurken meloksikam (1 mg / kg) ve ethiqa XR (0.65 mg / kg) subkutan olarak uygulayın. Daha sonra karın duvarını sürekli 5-0 emilebilir bir vicryl sütür ile kapatın ve cildi intrakutan olarak 6-0 emilebilir bir vicryl sütür ile kapatın.
NOT: Yaygın hatalar ve sorun giderme ile ilgili yönergeler Tablo 2'de sunulmuştur.
3. Yenidoğan donör kalbinin toplanması
- Yenidoğan donör sıçanını sedasyon için izofluran (% 2) ile şişirilmiş bir odaya yerleştirin. İntraperitoneal olarak ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) ve heparin (300 U / kg) uygulayın.
- Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın ve fareyi kuyruğu size bakacak şekilde sırtüstü pozisyona getirin. Tüm göğüs ve karın duvarını alternatif olarak üç kez betadin ve% 70 etanol ile sterilize edin. Fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün.
- 12.5x cerrahi mikroskop kullanarak, ksifoidde 15 bıçaklı bir neşter kullanarak yatay bir kesi ile başlayarak tüm ön torasik duvarı çıkarın, ardından makasla her iki taraftaki koltuk altına kadar yanal olarak dikey kesiler yapın. Ön göğüs duvarı daha sonra boynun hemen altında başka bir yatay kesi ile devam edilerek çıkarılabilir.
- IVC, sağ ve sol superior vena kava ve pulmoner damarları makasla inceleyin ve ardından tüm damarları 7-0 ipek sütür ile çevreleyin ve bağlayın. IVC'yi 30 G'lik bir iğne ile delerek ve diyaframı forseps ile hafifçe aşağı iterek sağ atriyuma 3 mL buz gibi, yüksek potasyumlu modifiye Krebs-Henseleit solüsyonu uygulayın.
- IVC'yi, SVC'leri, pulmoner damarları ve aortu makasla kesin. 11 bıçaklı bir neşter kullanarak uygun uzunluğu sağlamak için pulmoner arterleri mümkün olduğunca ve aortu brakiyosefalik gövdenin distalini kesin.
- Pulmoner gövdeyi ve çıkan aortu mikromakasla ayırın ve 3 mL'lik bir şırınga kullanarak kalbi buz gibi soğuk kardiyoplejik solüsyonla yıkayın.
4. Alıcının iyileşmesi ve greft izleme
- Ameliyattan sonra, fareye uyanması için yeterli zaman verin, bu genellikle 15 dakikalık bir zaman aralığında gerçekleşir ve bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin.
NOT: Enfeksiyon riskinin çok düşük olması ve deney modelinden ödün vermemesi için antibiyotiğe gerek yoktur ve yiyecek veya su kısıtlaması uygulanmaz. - Transplantasyondan sonra, nakledilen kalbin günlük palpasyonuyla greft fonksiyonunu izleyin, ancak bağırsak kaplaması nedeniyle bunun bazen değerlendirilmesinin zor olabileceğini göz önünde bulundurun.
NOT: Abdominal ekokardiyografi greft canlılığını daha doğru bir şekilde ölçebilir. Ekokardiyografi için, sıçanı bir burun konisinden solunan izofluran (% 1-2) ile hafifçe sakinleştirin ve bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Ekokardiyografi genellikle postoperatif gün (POD) 1, POD 7 ve POD 14'te yapılır. Kalp atış hızı ve kasılmanın değerlendirilmesine izin vermek için, uzun eksen ve kısa eksen görünümleri kolayca elde edilebilir (Şekil 2A, B). Anastomozları değerlendirmek için Doppler ekokardiyografi (Şekil 3A) kullanın ve sol ventrikül boşluğu içinde eko-parlak endokardiyal tabaka olarak görülen EFE dokusunun oluşumunu doğrulayın (Şekil 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Greft canlılığı ve dayak
Bu çalışmada, tüm klempler çıkarıldıktan sonra greft canlılığı görsel olarak değerlendirildi ve greftin gözlemlenmesi için açık bir karın ile yaklaşık 10-15 dakikalık bir reperfüzyon süresine izin verildi. Greft canlılığını objektif olarak doğrulamak için aynı skorlama sistemi ameliyat sonunda görsel değerlendirme ve POD 1, POD 7 ve POD 14'te ekokardiyografi için kullanıldı.
0 = organ fonksiyonu yok; 1 = (dinlenme) organ fonksiyonu, sadece minimum kasılma; 2 = zayıf veya kısmi organ fonksiyonu; 3 = kasılma hızı veya yoğunluğu azalır, ancak homojen organ fonksiyonu; 4 = optimal atriyum ve ventrikül kasılması (120-160 atım/dk). 3 veya 4 puan başarı olarak değerlendirildi. Ekokardiyografik değerlendirmenin zaman noktaları arasındaki greft canlılığını izlemek için abdominal donör greftin palpatuar değerlendirmesi kullanıldı.
Mortalite ve greft canlılığı başarı oranı
Ekim 2022 ile Aralık 2022 tarihleri arasında çalışma merkezinde yeni bir cerrahi ekibe işlem tanıtıldı ve bu dönemde çalışma merkezinde 19 yenidoğan heterotopik sıçan kalp nakli gerçekleştirildi. Acil operatif sağkalım oranı %79 ve greft canlılığı başarı oranı (canlı, atan bir donör kalbi gösteren) %84 idi. Prosedür özellikleri Tablo 3'te sunulmuştur.
Hayatta kalan 12 hayvandan 2'si 2 haftalık çalışma bitiş noktasından önce ötenazi gerektirdi, 1'i ileus (n = 1) ve diğeri ağrı kesici ilaçla (n = 1) giderilmeyen ağrı nedeniyle ve 2'si ameliyattan 1 hafta sonra tasarım gereği ötenazi yapıldı.
Üç sıçanda, uygulanan modifiye Stanford skoru, hemen postoperatif görsel derecelendirme ve POD 1'de ekokardiyografik değerlendirme arasında 3'ten 4'e yükseldi. 14 günlük son noktada hayatta kalan sekiz sıçan arasında, ekokardiyografide modifiye edilmiş Stanford skorları yedi hayvan için dört ve bir hayvan için üç idi. Bu seride en sık ölüm nedeni, çok olgunlaşmamış kalbin bir sonucu olarak aşırı kan kaybına bağlı hemodinamik yetmezlik ve dolayısıyla anastomoz veya uzun anestezi süreleri için kırılgan donör damarlardı.
EFE dokusunun histolojik değerlendirilmesi
Alıcı sıçanın CO2 ötenazisini takiben, steril preparat altında yeniden laparotomi yapıldı. Donör grefti eksize edildi ve daha sonraki işlemler için hemen buz üzerinde fizyolojik bir salin solüsyonuna yerleştirildi. Sağ ve sol ventrikülün orta ventrikül seviyesinde yatay bir kesit rezeke edildi, optimal kesme sıcaklığı (OCT) gömme ortamına yerleştirildi ve sıvı nitrojen içinde donduruldu (Şekil 4A). Diğer tüm dokular sıvı nitrojen ile donduruldu ve daha fazla analiz için −80 ° C'lik bir dondurucuda saklandı. Görüntüler ters mikroskop kullanılarak elde edildi (Şekil 4B-D).
EndMT'yi tanımlamak için altın standart olarak immünohistokimyasal boyama, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi), endotelyal belirteç olarak VE-Cadherin (kırmızı) ve fibroblast belirteci olarak α-SMA (yeşil) kullanılarak yapıldı. EFE dokusunda fosforile SMAD proteinleri ve transkripsiyon faktörü SLUG/SNAIL de boyandı (Şekil 5A-E)3,20.
Şekil 1: Entübasyon için eğik raf. Sıçan, ön dişleri bir iple sabitlenmiş ve başı cerraha bakacak şekilde sırt üstü yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LV'nin ekokardiyografik uzun eksen görünümü . (A) Diyastol sırasında normal dolumu gösteren yerli sıçan kalbi. (B) LV içinde akış durgunluğu olan donör grefti. Diyastol sırasında azalan hacim yüklemesi. Kısaltmalar: LV = sol ventrikül; MV = mitral kapak; LVOT = sol ventrikül çıkış yolu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Anastomozlar ve EFE değerlendirmesi. (A) Patent arteriyel (kırmızı ok) ve venöz (mavi ok) anastomozları gösteren ekokardiyografik renkli Doppler çalışması. (B,C): EFE'yi gösteren LV boşluğu içinde eko-parlak endokardiyal yüzey (beyaz oklar). Kısaltmalar: LV = sol ventrikül; EFE = endokardiyal fibroelastoz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Makroskopik ve mikroskobik doku değerlendirmesi . (A) LV ve RV boyunca orta ventriküler kesit. Beyaz oklar EFE dokusunu gösterir. (B) Hematoksilen-eozin, (C) Masson'un trikrom (MTS) ve (D) Elastin van Gieson (EVG) boyama. Büyük büyütme, EFE dokusunun (siyah oklar) yüksek miktarda organize kollajen (MTS'de mavi) ve elastin lifleri (EVG'de siyah) içerdiğini gösterir. Kısaltmalar: LV = sol ventrikül; RV = sağ ventrikül; EFE = endokardiyal fibroelastoz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Histolojik ve immünohistolojik görüntülerin karşılaştırılması. (A) Hematoksilen-eozin boyama. (B-E) İmmünohistokimyasal boyama; EFE dokusu (B,C) VE-Cadherin ve α-SMA, (D) CD31 ve fosfo-SMAD2/SMAD3 (mavi renkte DAPI ile boyanmış çekirdeklerle birlikte lokalize) ve (E) CD31 ve SLUG/SNAIL (mavi renkte DAPI ile boyanmış çekirdeklerle birlikte lokalize) için çift boyanmıştır. Kısaltmalar: LV = sol ventrikül; EFE = endokardiyal fibroelastoz; EndMT = endotelyalden mezenkimal geçiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 1 litre sterilize edilmiş, damıtılmış su | |
| NaCl (Sıvı Değeri) | 118 mmol/L |
| Kartal | 22 mmol/L |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| MgSO4 | 1,2 mmol/L |
| NaHCO3 | 25 mmol/L |
| Glikoz | 11 mmol/L |
| CaCl2 | 2,5 mmol/L |
Tablo 1: Modifiye Krebs-Henseleit tamponunun bileşimi. Yüksek potasyumlu (22 mmol/L KCl) kardiyoplejik çözelti hazırlanır, filtreyle sterilize edilir ve gece boyunca 4 °C'de saklanır.
| Yaygın arızalar ve sorun giderme | ||
| Greft atmaya başlamıyor/koroner arterler klempler serbest bırakıldıktan sonra dolmuyor | Arteriyel anastomozda trombüs oluşumunu kontrol edin | |
| İskemi süresini kontrol edin (=toplam durma süresi) (100 dakikayı geçmemelidir) | ||
| Uzun uyanma süresi veya sıçan ameliyattan sonra uyanmıyor | Ameliyat sırasında nabız gücünü ve sıklığını izleyin ve hemodinamik zayıfsa izofluran inhalasyonunu azaltın | |
| Ameliyat sonrası hemen livid veya nekrotik bağırsaklar, genellikle uzun anestezi süresi nedeniyle intraoperatif hemodinamide azalma açısından şüphelidir | ||
| Laparotomiden hemen sonra zayıf hemodinamik | Anestezi için izofluran akışını ayarlayın | |
| Entübasyon ve uygun göğüs hareketini değerlendirin: tek taraflı entübasyon, pnömotoraks, obstrüktif endotrakeal lümen başlangıçta sık görülen başarısızlıklardır. | ||
| Sıçan uyanır ama ilk 24 saat içinde ölür | Ameliyat sırasında yoğun kan kaybı | |
| Otopside karında kan miktarında artış bulunursa, bunun nedeni büyük olasılıkla anastomozun başarısızlığıdır | ||
Tablo 2: Yaygın hatalar ve sorun giderme. Başarısız prosedürlerin kapsamlı bir şekilde izlenmesi ve yeniden değerlendirilmesi, bu modelde yüksek bir sağkalım oranı elde etmek için çok önemlidir.
| Gram cinsinden alıcı sıçan ağırlığı, medyan [IQR] | 150 [50] |
| Gün cinsinden donör yaşı, medyan [IQR] | 3 [1] |
| Gram cinsinden donör ağırlığı, medyan [IQR] | 9 [2] |
| Dakika cinsinden greft iskemi süresi, medyan [IQR] | 100 [25] |
| Ameliyat sonrası başarı oranı, n | 16/19 (=%84) |
Tablo 3: Prosedür özellikleri. Alıcı ve donör seçimi, greft iskemi süresi ve sağkalım oranı. Kısaltma: IQR = çeyrekler arası aralık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yenidoğan donör sıçan kalbinin alıcının karnına heterotopik transplantasyonuna ilişkin bu hayvan modeli, ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesi yoluyla EndMT kaynaklı fibrozu inceleme, düzenleyici sinyal yollarını belirleme ve tedavi seçeneklerini test etme imkanı yaratır. EndMT, kalbin fibrotik hastalıklarının altında yatan mekanizma olduğundan, bu model pediatrik kalp cerrahisi alanında ve ötesinde büyük değere sahiptir. Bu modelde, birçok faktör prosedürün sonucunu olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, donör kalbin olgunlaşmamış olması nedeniyle çok kırılgan dokunun uygun şekilde ele alınması, anestezi sırasında uygun hayvan kullanımı ve üst düzey mikrocerrahi becerileri bu modelin başarısı için temel gereksinimlerdir. Bu deneyler yapılırken cerrahi mikroskop, küçük hayvan ventilatörü ve mikrocerrahi aletler dahil olmak üzere optimal bir teknik kurulum kullanılmalıdır. Gerekli olmasa da, kalp atış hızının veya vücut sıcaklığının temel olarak izlenmesi, özellikle deneyimsiz cerrahlar için hemodinamiği ve anestezi derinliğini izlemek için faydalı olabilir.
Akılda tutulması gereken önemli cerrahi hususlar arasında, dokuyu çok kırılgan hale getiren ve yükselen aort ve pulmoner gövdeyi yırtılmalara karşı savunmasız bırakan yenidoğan donör kalplerinin olgunlaşmamış olması yer alır. Bu nedenle, herhangi bir işlem büyük bir özenle yapılmalıdır. Anastomoz için kullanılan küçük damarlar nedeniyle, arteriyel anastomozun kesintili dikişlerle yapılması ve anastomoz bölgesinin heparinize salin ile aralıklı olarak yıkanması önerilir, bu da trombüs oluşumunu önlemeye yardımcı olur. Uygun yaştaki yenidoğan sıçanlarının seçimi, çok olgunlaşmamış ve bu nedenle anastomoz rüptürüne oldukça duyarlı kalplerin kullanılması sorununun üstesinden gelmek için gereklidir. Öte yandan, yaklaşık 7 günlük belirli bir yaştan sonra, EndMT artık bu hayvan modelinde tekrarlanabilir olarak gösterilemez15.
EndMT, çeşitli kardiyak fibroz ve ateroskleroz türleri için merkezi mekanizma olarak tanımlanmıştır, ancak in vivo modellerin olmaması nedeniyle araştırmalar engellenmiştir8. EndMT araştırma alanındaki ana gelişmeler, doğal sınırlamaları olan hücre kültürü modelleriyle sınırlıdır 3,8,9. Ayrıca, endokardiyal endotel hücreleri üzerindeki çalışmalar daha da kısıtlıdır. Alternatif olarak, koroner arter endotel hücreleri, kısmen endokardiyal hücrelerden kaynaklandıkları bildirildiğinden, sıklıkla ikame olarak kullanılır21. Bu nedenle, bu hayvan modeli sadece kardiyak fibroz için değil, aynı zamanda aterosklerozda akışla indüklenen EndMT'nin önemli patomekanizmalarını incelemek için de kullanılabilir. Konjenital kalp hastalığı için, sıçan modelimizde EndMT yoluyla sağlıklı endokarddan EFE dokusuna geçişi, yapısal olarak insan EFE dokusuna benzeyen EFE ile çoğaltma yeteneğini gösterdik. EFE dokusu içindeki mezenkimal hücrelerin hücresel kökeni ile ilgili bazı tartışmalar vardır. Clark ve ark.22 epikardiyal hücrelerin EFE'ye katkıda bulunduğunu bildirmiştir, ancak verilerimiz EFE dokusunun çoğunluğunun EndMT3 geçiren endokardiyal endotel hücrelerinden kaynaklandığını göstermiştir. EFE dokusunun hücresel kökenini belirlemek için tek hücre düzeyinde deneyler şu anda devam etmektedir.
Bu in vivo model sayesinde, EndMT'nin düzenleyici yolları incelenebilir. Bir dengesizliğin, özellikle TGF-ß yolağında bir artış ve bozulmuş kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyalizasyonunun, EndMT'yi düzenleyen transkripsiyon faktörlerini eksprese eden endokardiyal hücrelerde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Alternatif olarak, Pürüzlü/Çentik sinyali ve Wnt/ß-Katenin'in de EndMT 3,23'ü indüklediği bildirilmiştir. TGF-ß yolu, SMAD proteinleri aracılığıyla SLUG, SNAIL ve TWIST gibi transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonunu indükler ve böylece EndMT20,24'ü düzenler. Bu hayvan modelinde, immünohistokimyasal boyama ile doğrulanan bu mekanizmaları özetleyebildik.
Bu hayvan modelinde EndMT kaynaklı fibroz için uyarıcı faktörler olgunlaşmamışlık ve akış durgunluğudur, oysa diğer modeller genetik modifikasyonlar, hipertansiyon veya diyet kısıtlamaları yoluyla EndMT'yi indüklemek için tasarlanmıştır 9,25. Diğer türlerle karşılaştırıldığında, yenidoğan sıçanlar doğumda çok olgunlaşmamıştır ve bu nedenle EndMT geçirmeye özellikle duyarlıdırlar.
Biz ve diğerleri, transgenik soy takibi yoluyla EFE'nin kökenlerini daha iyi incelemek için fareler kullandık, ancak bazı sınırlamaların tartışılması gerekiyor 3,22. İlk olarak, modelin karmaşıklığı nedeniyle, farelerde ölüm oranları sıçanlara kıyasla daha yüksektir ve EFE'nin sunumu daha heterojendir; Bu nedenle, sıçan modeli daha güvenilir ve tekrarlanabilirdir. Ekokardiyografik ölçümler, çalışma süresi boyunca greft fonksiyonunu değerlendirmek için çok önemlidir ve bu önlemlerle anastomozların pulsatilitesini ve açıklığını değerlendirmenin yanı sıra greft fonksiyonu ve kontraktilitenin de çalışılabileceğini gösterdik. Daha fazla deneyimle, LV'nin gerinim analizi gibi nakledilen kalbin daha da gelişmiş analizleri sıçan modellerinde gerçekleştirilebilir. Aynı patofizyolojik durumun kemirgenler dışındaki daha büyük hayvanlarda indüklenip indüklenemeyeceği şu anda belirsizdir ve bu daha fazla araştırma gerektirir.
Sonuç olarak, bu pediatrik hayvan modeli, EndMT'nin insan hastalığını taklit eder ve EndMT'nin regülasyonunu belirlemek ve bu patolojik süreci inhibe etmek için farmakolojik müdahaleleri incelemek için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ek Girişimler - Tek Ventrikül Araştırma Fonu (SVRF) ve Tek Ventrikül Genişletme Fonu (I.F.) ve Avusturya Federal Eğitim, Bilim ve Araştırma Bakanlığı BMBWFC (G.G.'ye) tarafından sağlanan fonlardan OeAD-GmbH'nin Marietta Blau bursu tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
