Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udføre to-foton calciumbilleddannelse i den dorsale forhjerne hos voksne zebrafisk.
Abstract
Voksne zebrafisk (Danio rerio) udviser et rigt repertoire af adfærd til at studere kognitive funktioner. De har også en miniaturehjerne, der kan bruges til at måle aktiviteter på tværs af hjerneområder gennem optiske billeddannelsesmetoder. Imidlertid har rapporter om registrering af hjerneaktivitet i opførende voksne zebrafisk været sparsomme. Denne undersøgelse beskriver procedurer til udførelse af to-foton calciumbilleddannelse i den dorsale forhjerne hos voksne zebrafisk. Vi fokuserer på trin til at forhindre voksne zebrafisk i at bevæge hovedet, hvilket giver stabilitet, der muliggør laserscanningsbilleddannelse af hjerneaktiviteten. De hovedfastholdte dyr kan frit bevæge deres kropsdele og trække vejret uden hjælpemidler. Proceduren sigter mod at forkorte tiden for nakkestøttekirurgi, minimere hjernens bevægelse og maksimere antallet af registrerede neuroner. En opsætning til præsentation af et fordybende visuelt miljø under calciumbilleddannelse er også beskrevet her, som kan bruges til at studere neurale korrelater underliggende visuelt udløst adfærd.
Introduction
Calciumfluorescensbilleddannelse med genetisk kodede indikatorer eller syntetiske farvestoffer har været en kraftfuld metode til måling af neuronal aktivitet i dyr, herunder ikke-menneskelige primater, gnavere, fugle og insekter1. Aktiviteten af hundredvis af celler, op til ca. 800 μm under hjerneoverfladen, kan måles samtidigt ved hjælp af multifotonbilleddannelse 2,3. Aktiviteten af specifikke celletyper kan også måles ved at udtrykke calciumindikatorer i genetisk definerede neuronale populationer. Anvendelse af billeddannelsesmetoden til små hvirveldyrmodeller åbner nye muligheder inden for neuronal beregning på tværs af hjerneområder.
Zebrafisk er et meget anvendt modelsystem inden for neurovidenskabelig forskning. Larvezebrafisk omkring 6 dage efter befrugtning er blevet brugt til calciumbilleddannelse på grund af deres miniaturehjerne og gennemsigtige krop4. Unge zebrafisk (3-4 uger gamle) bruges også til at studere de neurale mekanismer, der ligger til grund for sensorimotoriske veje 5,6. Imidlertid nås det maksimale præstationsniveau for kompleks adfærd, herunder associativ læring og social adfærd, i en ældre alder 7,8. Således kræves en pålidelig protokol for at studere flere kognitive funktioner i hjernen hos voksne zebrafisk ved hjælp af billeddannelsesmetoder. Mens zebrafisklarve og unge zebrafisk kan indlejres i agarose til in vivo-billeddannelse, lider voksne zebrafisk på 2 måneder eller ældre af hypoxi under sådanne forhold og er fysisk for stærke til at blive fastholdt af agarose. Derfor kræves en kirurgisk procedure for at stabilisere hjernen og gøre det muligt for dyret at trække vejret frit gennem gællerne.
Her beskriver vi en nakkestøtteprotokol, der involverer et nyt design af en enkelt hovedstang. Den reducerede operationstid på 25 min er dobbelt så hurtig som den tidligere metode9. Vi beskriver også designet af optagekammeret (semi-sekskantet tank), hovedtrinnet og en hurtiglåsemekanisme til at kombinere de to dele9. Endelig beskrives opsætningen til at præsentere en fordybende visuel stimulus til at studere visuelt udløst hjerneaktivitet og adfærd også. Samlet set kan de procedurer, der er beskrevet her, bruges til at udføre to-foton calciumbilleddannelse i genetisk definerede cellepopulationer i en hovedbehersket voksen zebrafisk, hvilket muliggør undersøgelse af hjerneaktiviteter under forskellige adfærdsparadigmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica. Detaljer om forskningsværktøjerne findes i materialefortegnelsen.
1. Klargøring af optagekammer
- Forbered en halvsekskantet tank, en bundplade og et hovedtrin (figur 1A; Supplerende filer 1-3). Hovedscenen består af to metalstolper fastgjort til en cirkulær plade. Den cirkulære plade indeholder riller, der kan låses fast på bundpladen. Efter at være blevet låst sammen, lægges hovedtrinnet og bundpladen i bunden af den halvsekskantede tank.
- Placer den halvsekskantede tank på mikroskopets eksperimentelle platform. Platformen skal kunne bevæge sig i X- og Y-retningen uden at ramme grænsen for oversættelsesfasen.
- Ret det 810 nm infrarøde (IR) lys og kameraet mod hovedscenen for adfærdsoptagelse. Sørg for, at kameraets synsfelt er stort nok til at passe til en voksen zebrafisk.
- For at forhindre, at to-fotonlaseren og den visuelle stimulus forstyrrer adfærdsoptagelse, skal du oprette henholdsvis et 875 nm kortpasfilter og et 700 nm langpasfilter foran kameraet.
- For at præsentere den visuelle stimulus skal du fastgøre tilbageprojektionsfilm til indersiden af de tre vægge i den halvsekskantede tank (figur 1A).
- Ret de tre projektorer mod tankens tre overflader. De tre billeder skal justeres for at danne en kontinuerlig visuel scene. For at forhindre projektorlys i at forurene calciumfluorescenssignalet skal du placere et neutralt densitetsfilter og et rødt farvefilter (600 nm, long-pass) foran hver projektor og placere et båndpasfilter (510/80 nm) foran fotomultiplikatorrøret (PMT).
Figur 1: Instrumenter, der kræves til nakkestøttekirurgi. A) Quick-lock-mekanismen mellem hovedtrinnets cirkulære plade og bundpladen inde i den halvsekskantede tank. Computer-aided design (CAD) filer af de specialfremstillede dele kan findes i supplerende filer 1-4. B) Ω hovedbøjle til nakkestøtten. C) Den treaksede mikromanipulator, der anvendes til at placere hovedbøjlen til fastgørelsesstedet. Indsat: orientering af hovedstangen i leret. D) Kanoner til at holde fisken under operationen. Indsat: orientering af fisk i kanonen. E) Indlæsningsmodulet for fisk og den mikromanipulator, der anvendes til at læsse fisken på hovedstadiet. Indsat: orientering af fisk inden for modulet. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Operation af nakkestøtte
- Forbered en Ω-formet hovedstang (figur 1B; Supplerende fil 4) til zebrafiskens nakkestøtte. For at gøre dette skal du fastgøre et stykke oliebaseret modellervoks til en treakset mikromanipulator. Sørg for, at leret er solidt nok til at holde hovedstangen, men blødt nok til at løsne sig fra hovedstangen efter nakkestøtten.
- Indsæt en arm af hovedstangen i leret, og vend hovedstangen vandret (figur 1C). Dette vil sikre, at den senere fastgørelse af hovedstangen på zebrafisken vil være plan.
BEMÆRK: Hovedstangen kan være lavet af titanium (24 mg) eller rustfrit stål (43 mg) og kan genbruges til flere eksperimenter. Hovedstangsmaterialet påvirker ikke adfærden hos voksne zebrafisk (vægtintervaller fra 300-1.000 mg) under en nakkestøtte. - Forbered kanonen, et hult rør til at holde fiskekroppen på plads under operationen (figur 1D).
- Forbered 0,03% og 0,01% tricainmethansulfonat (TMS; se materialetabel) i akvariumvand. Dette vil blive brugt til at bedøve og opretholde fisken i en bedøvet tilstand under operationen.
- Forbered fire vævspindler for at fjerne overskydende hud og vand fra fastgørelsesstederne på kraniet. For at forberede hver vatpind skal du skære et papirhåndklæde i en 3 cm firkant og folde langs diagonalen for at producere en rørlignende struktur. Drej enderne af røret til et fint punkt. Fastgørelsesstedet er meget lille, så et fint punkt giver finere kontrol over vatpinden.
- Forbered et fiskepåfyldningsmodul til mikromanipulatoren (figur 1E).
BEMÆRK: Modulet består af to stålstolper, der holdes sammen af en retvinklet stolpeklemme. Den ene stolpe fastgøres til mikromanipulatoren, mens den anden stolpe holder en roterende stolpeklemme, der bærer fisken. Modulet bruges til at placere fisken på hovedscenen med fin kontrol. Den roterende stolpeklemme fungerer som en tonehøjdejustering for at ændre fiskens stigningsvinkel. - Bedøv fisken med 0,03% TMS i akvariumvand. I løbet af de følgende trin skal du bruge en sprøjte til at levere 0,01% TMS i akvariumvand til munden i korte pulser hver 90. s. Vandstrøm fra perfusionen skal fremkalde gillbevægelse. Dette vil gøre det muligt for fisken at overleve i mere end 40 minutter under operationen.
BEMÆRK: Tg [neuroD: GCaMP6f] bruges på grund af dets brede udtryk for calciumindikatoren i forhjernen på både larve- og voksenstadierne10.
BEMÆRK: Brug eventuelt tyngdekraftsperfusion til at give konstant vandgennemstrømning til munden i perioder i kirurgi, hvor begge hænder er optaget. - Pak fisken ind i en kapsel (figur 2A), der holder fisken inde i kanonen.
- Pak den bedøvede fisk ind i et stykke fugtigt papirvæv startende fra spidsen af halen til ca. 1 mm kaudal til gill. Sørg for, at indpakningen er tæt for at forhindre, at fisken glider ud af vævet.
- Sæt en blød plastslange med en langsgående slids (f.eks. En mellemstor varmekrympeslange, der er skåret op) rundt om papirservietten for at dække fisken fra enden af halen til ca. 2 mm kaudal til gillen. Slangen sikrer, at fiskens krop forbliver lige under hele operationen.
- Sæt et papirhåndklæde rundt om slangen til en diameter, der stort set svarer til kanonens diameter.
- Sæt et blødt plastrør, der er skåret ud af pæren på en plastoverførselspipette, rundt om køkkenrullet. Dette sikrer, at kapslen kan læsses jævnt ind i kanonen.
- Læg fisken i kanonen.
- Brug en skalpel til at fjerne huden, der dækker fastgørelsesstederne, to trekantede områder af kraniet rostrolateralt til lillehjernen og over gællerne (figur 2B), og fjern derefter huden, der dækker området mellem fastgørelsesstederne. Brug vævspindler til at tørre fastgørelsesstederne ud og fjerne eventuel resterende hud.
- Brug en justerbar platform til at støtte hovedet under hudfjerning, men platformen må ikke komme i kontakt med øjnene for at undgå øjenskader under operationen.
BEMÆRK: Grundig fjernelse af huden på fastgørelsesstederne er afgørende for at reducere bevægelsesartefakter under billeddannelse.
- Brug en justerbar platform til at støtte hovedet under hudfjerning, men platformen må ikke komme i kontakt med øjnene for at undgå øjenskader under operationen.
- Påfør en dråbe vævslim (se materialetabellen) i midten af hvert fastgørelsessted ved hjælp af en 10 μL pipettespids.
BEMÆRK: Vævslim dækker fastgørelsesstederne og tørrer hurtigt ud. Vævslimet giver en bindingsgrænseflade mellem kraniet og tandcementen, der bruges til at lime hovedstangen, og forhindrer vand fra gællerne i at nå fastgørelsesstedet. - Sæt fiskekroppen i opretstående position, og placer hovedstangen lidt over og kaudale til fastgørelsesstederne som forberedelse til limning af hovedstangen.
- Forbered tandcement (se materialetabel), og brug den straks til at lime hovedstangen på kraniet (figur 2C). Proceduren er tidsfølsom og skal udføres inden for 45 s.
- Bland en lille ske polymer med fire dråber hurtig monomer og en dråbe katalysator V. Rør blandingen jævnt i 15 s.
- Brug en mikropipette og en 10 μL pipettespids til at påføre blandingen på fastgørelsesstederne og området mellem stederne. Undgå at dække gællerne og øjnene.
- Tryk forsigtigt hovedstangen på cementen ved hjælp af mikromanipulatoren. Dæk hovedstangen med den resterende cement.
- Vent i 12 minutter for at tillade hærdning af tandcementen. Undgå vandkontakt med cementen.
- For at forbedre optisk adgang til forhjernen til calciumbilleddannelse skal du fjerne huden over telencephalon. Hudfjerning kan udføres på 3 minutter med fem snit ved hjælp af en skalpel (figur 2D). Sørg for, at lipiddråber, der klæber til overfladen af kranierne, fjernes.
- Efter hærdning fjernes leret fra hovedstangen.
- Overfør hele kapslen fra kanonen til tonehøjdejusteringen i mikromanipulatorens fiskepåfyldningsmodul.
- Brug mikromanipulatoren til at placere fisken. Hovedstangen skal placeres oven på metalstolperne på hovedtrinnet. Forøg fiskens stigningsvinkel lidt, så overfladen af forhjernen kan justeres bedre til det optiske plan under to-fotonbilleddannelse.
- Lim hovedstangen på metalstolperne med ultraviolet (UV)-hærdelig lim. En 15 s UV-eksponering er tilstrækkelig til hærdning.
- Træk fisken ud af kapslen, og lås hovedtrinnet fast på bundpladen i den halvsekskantede tank.
- Dyp dyret i akvariumvand. Fisken skal begynde at trække vejret og komme sig efter anæstesi inden for 1-2 minutter.
BEMÆRK: Brug eventuelt sprøjteperfusion til at levere ferskvand til munden.
Figur 2: Vigtige trin under nakkestøttekirurgi . (A) Sammensætning af kapslen inde i kanonen. (B) Fastgørelsessteder på kraniet (rød). Røde pile angiver blodkarsteder. (C) Top: hovedstang fastgjort til fiskekraniet. Nederst: fisk læsset på hovedscenen. (D) Nedskæringer, der er nødvendige for at fjerne huden over forhjernen. Tal angiver skæresekvensen. Undgå hudfjernelse på det markerede sted (pilespids) for at forhindre blødning af dyret. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. To-foton-billeddannelse
- Tænd laseren, og vent i 30 minutter på, at strømmen stabiliseres. Indstil bølgelængden til 920 nm og effekten til omkring 50 mW ved prøven.
BEMÆRK: Laserstrålen, der styres af resonansscanneren, bevæger sig langsomt ved vendepunkterne på scanningsstien. For at forhindre vævsskade bruges en Pockels-celle til at reducere lasereffekten ved vendepunkterne. - Registreringskammeret med den fastspændte zebrafisk anbringes på forsøgsplatformen (figur 3A). Platformen skal kunne bevæge sig i X- og Y-retningen uden at ramme grænsen for oversættelsesfasen.
- Placer objektivlinsen så tæt som muligt på forhjernens overflade. Objektivlinsen skal være rettet mod pupillens forkant (figur 3B).
- Åbn laserlukkeren, og aktiver PMT. Løft gradvist objektivlinsen (~ 1 mm), indtil den dorsale forhjerne afsløres i fluorescensbilledet (figur 3C).
- For at øge antallet af registrerede neuroner skal du bruge en piezoaktuator til at erhverve billeder på flere dybder (seks billedplaner, 15 μm fra hinanden). Dette vil øge dataudbyttet på bekostning af billedhastigheden. Aktivér hurtig Z-aksescanning for at styre piezoaktuatoren (ensartet tilstand, antal skiver = 6, trinstørrelse = 15 μm, bølgeform = savtand, flyback-tid = 4 ms, aktuatorforsinkelse = 8 ms).
- For adfærdsregistrering skal du tænde 810 nm infrarøde (IR) lys på begge sider af tanken. Juster vinklen for at belyse hele kroppen, hvilket skal være tydeligt synligt i kameraet.
- Tænd projektorerne.
- Start optagelse af data.
Figur 3: Opsætning til at udføre calciumbilleddannelse, adfærdsregistrering og visuel stimulusvisning . (A) Tre projektorer præsenterer en visuel stimulus på væggene i den halvsekskantede tank. IR-lys på siden bruges til at belyse zebrafiskens krop. (B) Placering af objektivlygteglasset. Venstre: set forfra. Til højre: set fra siden. Afstanden mellem 16x objektivlinsen og det målrettede hjerneområde er omkring 2,5 mm. (C) Eksempel på to-fotonbillede. Til venstre: maksimal projektion af hele den dorsale forhjerne i Tg [neuroD: GCaMP6f]. Til højre: zoomet billede for at afsløre neuroner på tværs af flere hjerneområder. Indsat: en højere forstørrelse fra et andet hjerneområde. Billeder er gennemsnit af 10 s data optaget ved 5Hz. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen består af to dele: nakkestøttekirurgi og to-foton calciumbilleddannelse af neuronale aktiviteter i forhjernen. Operationens succes er defineret af dyrets overlevelse og nakkestøttens stabilitet. Overlevelsesraten kan forbedres betydeligt ved hyppig perfusion af 0,01% TMS-opløsning gennem munden under operationen. Fisk skal komme sig efter anæstesi og trække vejret aktivt inden for 1-2 minutter efter at være nedsænket i akvariumvand. To-foton calciumbilleddannelse muliggør aktivitetsregistrering af individuelle neuroner i den dorsale forhjerne i en dybde op til 200 μm fra hjerneoverfladen gennem intakte kranier (~ 40 μm i tykkelse). Dette billeddannelsesområde dækker flere zoner i dorsal telencephalon (D), herunder den mediale zone (Dm), den rostrale del af den centrale zone (rDc), den kaudale del af den centrale zone (cDc) og den laterale zone (Dl). Tilsammen udgør de 30% af telencephalonen hos voksne zebrafisk (fig. 3C). Med volumetrisk billeddannelse ved hjælp af piezoaktuatoren registrerer vi typisk aktiviteten af 150 neuroner i Dl eller cDc og 300 neuroner i Dm og rDc i Tg [neuroD: GCaMP6f] 10. Samtidig adfærdsmæssig optagelse udføres under hjernebilleddannelse, hvilket muliggør identifikation af neuronale korrelater af motoriske udgange (figur 4).
Under to-foton-billeddannelse bør halebevægelser ikke fremkalde en synlig bevægelsesartefakt i billedet. En lille (<1 μm) og forbigående bevægelse kan observeres under ekstrem kamp. Disse bevægelser er typisk reversible, så billeddannelse kan fortsættes bagefter. Vi observerer også en langsom drift (<1 μm min-1) i lateral og aksial retning9. For at forhindre tab af neuroner på grund af aksial prøvedrift begrænser vi typisk vores billeddannelsessession til 10 minutter. Fotoblegning af calciumindikatoren bør ikke observeres efter en 10 minutters billeddannelsessession under den specificerede lasereffekt.
Figur 4: Adfærdssporing og neuralt aktivitetsmønster hos voksne zebrafisk. (A) Et eksempel på en ramme for kameraoptagelse af adfærd (ventral visning). (B) Aktivitet af forhjerneneuroner (ΔF / F, sort) og halebevægelsesintensitet (blå). Intensiteten af halebevægelsen blev kvantificeret ved middelværdien af den absolutte pixelvise forskel mellem successive videobilleder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Udformning af bundpladen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Udformning af den cirkulære plade. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Design af den halvsekskantede tank. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Hovedstangens udformning. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Oplysninger om fejlfinding. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at fastholde hovedet af voksne zebrafisk til to-foton calciumbilleddannelse. Der er to kritiske trin for at opnå en nakkestøtte, der er stabil nok til laserscanningsbilleddannelse. Først skal hovedstangen limes på kraniernes specifikke fastgørelsessteder. Andre dele af kraniet er ofte for tynde til at give mekanisk stabilitet og kan endda blive brudt under stærke kropsbevægelser. For det andet skal huden over fastgørelsesstederne fjernes grundigt. Resterende vand skal også tørres grundigt. Dette gør det muligt for kraniet at binde tæt til vævslimen. Der findes en tabel med en liste over potentielle problemer, deres årsager og løsninger (supplerende tabel 1).
På grund af zebrafiskens forhjernes buede geometri bevæger excitationsstrålen og den resulterende emission sig gennem forskellige tykkelser af hjernevævet over billeddannelsesplanet. Således varierer fluorescensen af neuroner afbildet inden for et optisk afsnit baseret på neuronens afstand fra hjernegrænsen. Dette fører til lavt dataudbytte inden for en optagelsessession. Problemet er særligt alvorligt ved billeddannelse af Dl og cDc (figur 3C). Her bruger vi en piezoaktuator til at udføre optagelser på tværs af flere aksiale positioner, hvilket kompromitterer billedhastigheden, men øger antallet af registrerede neuroner. Det er vigtigt, at da neuronale aktiviteter i flere aksiale positioner registreres inden for en enkelt adfærdssession, har dataene en højere statistisk effekt sammenlignet med aktivitetsdata registreret fra flere adfærdsmæssige sessioner. Alternativt kan tre-fotonbilleddannelse2 og adaptiv optik11 registrere neuronale aktiviteter i dybe væv og slappe af problemet med høj krumning. Imidlertid bør gentagelseshastigheden for tre-fotonlasere og den heterogene struktur af kranier overvejes.
I sammenligning med tidligere metoder 9,12, der bruger flere metaldele til at stabilisere hovedet, gjorde den nuværende tilgang en betydelig forbedring ved at bruge et enkelt stykke af en Ω-formet hovedstang. Dette forenklede design reducerer operationstiden med 50%. Protokollen er også lettere at lære og kan typisk mestres inden for 2 ugers træning. Selvom operationstiden stort set er reduceret i forhold til den tidligere protokol9, observerede vi ikke åbenlyse forskelle i overlevelsesrate eller adfærd under nakkestøtten. For eksempel er varigheden af den tid, hvor dyret forbliver aktivt under mikroskopet, ens (3-8 timer afhængigt af dyret). Den tid, der kræves for dyret at vågne op fra anæstesi efter operationen, er også ens (1-2 min). Den transgene linje10, der anvendes i denne protokol, involverer et enkelt transgen, der koder for calciumindikatoren i forhjernen fra larvestadiet til voksenalderen, svarende til ekspressionstidslinjen for den tredobbelte transgene linje, der blev brugt i en tidligere undersøgelse12.
I øjeblikket har protokollen følgende begrænsninger. For det første kan neuronal aktivitet afbildes gennem kraniet i en dybde op til 200 μm fra hjerneoverfladen ved hjælp af et to-fotonmikroskop. Billedkvaliteten på forskellige dybder er tidligere blevet kvantificeret 9,12. Disse billeddannelsesdybder giver adgang til de dorsale forhjerneområder Dm, DC og Dl, men udelukker potentielt de ventrale forhjerneområder Vv, Vs, Vp og Vd hos voksne zebrafisk. Derudover er optisk adgang til størstedelen af mellemhjernen og baghjernen blokeret af tilstedeværelsen af hovedstangen og tandcement. Yderligere ændringer af protokollen er nødvendige for at udføre billeddannelse i disse hjerneområder. Desuden begrænser vi typisk en billedbehandlingssession til 10 minutter for at forhindre betydelig prøvedrift. Den potentielle årsag til driften er svækkelsen af bindingen mellem kraniet og vævslimet efter kraftige halebevægelser. Hvis der er behov for længere optagelsessessioner, kan volumetrisk billeddannelse med små aksiale trin efterfulgt af 3D-billedregistrering udføres.
Denne nakkestøtteprotokol åbner op for flere fremtidige anvendelser. For det første kan to-foton calciumbilleddannelse, optogenetiske manipulationer, elektrofysiologi eller endda ultralydsbilleddannelse udføres in vivo. Med tre-foton-billeddannelse kan neuronal aktivitet på tværs af hele forhjernen også registreres2. Derudover kan en mekanisk enhed konstrueres til reversibelt at gribe og frigøre de to ender af hovedstangen, hvilket muliggør langsgående undersøgelse af neural aktivitet og kredsløbsmorfologi over dage. Endelig giver den visuelle displayopsætning, vi beskrev, et 180° vandret synsfelt til dyret. Opsætningen kan bruges til at konstruere et fordybende virtual reality-miljø, der interagerer med hovedfastholdt fisk9. Samlet set muliggør denne protokol aktivitetsmåling af neuronale populationer på tværs af pallium af opførte voksne zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Institute of Molecular Biology, Academia Sinica og National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinværkstedet ved Institut for Fysik, Academia Sinica hjalp med at fremstille specialdesignede dele. Vi vil også gerne takke P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) for designet af hurtiglåsemekanismen på hovedscenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P.
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
