वयस्क ज़ेब्राफिश के व्यवहार में फोरब्रेन गतिविधि की दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग
Summary
यहां, हम वयस्क ज़ेबराफिश के पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
वयस्क ज़ेब्राफ़िश (डेनियो रेरियो) संज्ञानात्मक कार्यों का अध्ययन करने के लिए व्यवहार का एक समृद्ध प्रदर्शन प्रदर्शित करता है। उनके पास एक लघु मस्तिष्क भी है जिसका उपयोग ऑप्टिकल इमेजिंग विधियों के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों में गतिविधियों को मापने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, वयस्क ज़ेबराफ़िश के व्यवहार में मस्तिष्क गतिविधि की रिकॉर्डिंग पर रिपोर्ट दुर्लभ रही है। वर्तमान अध्ययन वयस्क ज़ेबराफिश के पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। हम वयस्क ज़ेब्राफ़िश को अपने सिर को हिलाने से रोकने के कदमों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो स्थिरता प्रदान करता है जो मस्तिष्क गतिविधि की लेजर स्कैनिंग इमेजिंग को सक्षम बनाता है। सिर-नियंत्रित जानवर स्वतंत्र रूप से अपने शरीर के अंगों को हिला सकते हैं और एड्स के बिना सांस ले सकते हैं। प्रक्रिया का उद्देश्य सिर संयम सर्जरी के समय को कम करना, मस्तिष्क की गति को कम करना और दर्ज न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करना है। कैल्शियम इमेजिंग के दौरान एक इमर्सिव दृश्य वातावरण प्रस्तुत करने के लिए एक सेटअप भी यहां वर्णित है, जिसका उपयोग नेत्रहीन ट्रिगर व्यवहार ों के अंतर्निहित तंत्रिका सहसंबंधों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतक या सिंथेटिक रंगों के साथ कैल्शियम फ्लोरेसेंस इमेजिंग गैर-मानव प्राइमेट्स, कृन्तकों, पक्षियों और कीड़ों सहित व्यवहार करने वाले जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि को मापने का एक शक्तिशाली तरीका रहाहै। मस्तिष्क की सतह के नीचे लगभग 800 μm तक सैकड़ों कोशिकाओं की गतिविधि को मल्टी-फोटॉन इमेजिंग 2,3 का उपयोग करके एक साथ मापा जा सकता है। आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरोनल आबादी में कैल्शियम संकेतक व्यक्त करके विशिष्ट सेल प्रकारों की गतिविधि को भी मापा जा सकता है। छोटे कशेरुक मॉडल के लिए इमेजिंग विधि का अनुप्रयोग मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरोनल गणना के क्षेत्र में नई संभावनाएं खोलता है।
जेब्राफिश तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल सिस्टम है। निषेचन के लगभग 6 दिनों के बाद लार्वा जेब्राफिश का उपयोग उनके लघु मस्तिष्क औरपारदर्शी शरीर के कारण कैल्शियम इमेजिंग के लिए किया गया है। किशोर ज़ेब्राफ़िश (3-4 सप्ताह पुराना) का उपयोग सेंसरिमोटर मार्ग 5,6 के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। हालांकि, साहचर्य सीखने और सामाजिक व्यवहार सहित जटिल व्यवहारों के लिए अधिकतम प्रदर्शन स्तर, 7,8 वर्ष की आयु में पहुंच जाता है। इस प्रकार, इमेजिंग विधियों का उपयोग करके वयस्क ज़ेब्राफिश के दिमाग में कई संज्ञानात्मक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। जबकि जेब्राफिश लार्वा और किशोर जेब्राफिश को विवो इमेजिंग में अगारोस में एम्बेडेड किया जा सकता है, 2 महीने या उससे अधिक उम्र की वयस्क ज़ेब्राफ़िश ऐसी स्थितियों में हाइपोक्सिया से पीड़ित होती हैं और शारीरिक रूप से इतनी मजबूत होती हैं कि उन्हें अगारोस द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, मस्तिष्क को स्थिर करने और जानवर को गलफड़ों के माध्यम से स्वतंत्र रूप से सांस लेने में सक्षम बनाने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।
यहां, हम एक हेड संयम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एकल हेड बार का एक नया डिजाइन शामिल है। 25 मिनट का कम सर्जरी का समय पिछली विधि9 की तुलना में दोगुना तेज है। हम रिकॉर्डिंग कक्ष (अर्ध-हेक्सागोनल टैंक), हेड स्टेज औरदो भागों 9 को संयोजित करने के लिए एक त्वरित-लॉक तंत्र के डिजाइन का भी वर्णन करते हैं। अंत में, नेत्रहीन ट्रिगर मस्तिष्क गतिविधि और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक इमर्सिव दृश्य उत्तेजना पेश करने के लिए सेटअप भी वर्णित है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग सिर-संयमित वयस्क ज़ेबराफ़िश में आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल आबादी में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न व्यवहार प्रतिमानों के दौरान मस्तिष्क की गतिविधियों की जांच सक्षम हो सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग के लिए वयस्क ज़ेबराफिश के सिर को रोकने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सिर संयम प्राप्त करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं जो लेजर स्कैनिंग इमेजिंग के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आणविक जीव विज्ञान संस्थान, एकेडेमिया सिनिका, और राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद, ताइवान द्वारा समर्थित किया गया था। भौतिकी संस्थान, एकेडेमिया सिनिका में मशीन शॉप ने कस्टम-डिज़ाइन किए गए भागों को बनाने में मदद की। हम हेड स्टेज के त्वरित-लॉक तंत्र के डिजाइन के लिए पी आर्गास्ट (फ्रेडरिक मिशर इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल रिसर्च, बेसल, स्विट्जरलैंड) को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen – GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
