Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i den dorsala framhjärnan hos vuxna zebrafiskar.
Abstract
Vuxna zebrafiskar (Danio rerio) uppvisar en rik repertoar av beteenden för att studera kognitiva funktioner. De har också en miniatyrhjärna som kan användas för att mäta aktiviteter i olika hjärnregioner genom optiska avbildningsmetoder. Rapporter om registrering av hjärnaktivitet hos vuxna zebrafiskar har dock varit knapphändiga. Den aktuella studien beskriver procedurer för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i den dorsala framhjärnan hos vuxna zebrafiskar. Vi fokuserar på åtgärder för att hindra vuxna zebrafiskar från att röra på huvudet, vilket ger stabilitet som möjliggör laserskanning av hjärnaktiviteten. De fastspända djuren kan röra sina kroppsdelar fritt och andas utan hjälpmedel. Proceduren syftar till att förkorta tiden för huvudstödsoperation, minimera hjärnans rörelser och maximera antalet neuroner som registreras. Här beskrivs också ett upplägg för att presentera en uppslukande visuell miljö under kalciumavbildning, som kan användas för att studera neurala korrelat som ligger till grund för visuellt utlösta beteenden.
Introduction
Kalciumfluorescensavbildning med genetiskt kodade indikatorer eller syntetiska färgämnen har varit en kraftfull metod för att mäta neuronal aktivitet hos djur som beter sig, inklusive icke-mänskliga primater, gnagare, fåglar och insekter1. Aktiviteten hos hundratals celler, upp till cirka 800 μm under hjärnans yta, kan mätas samtidigt med hjälp av multifotonavbildning 2,3. Aktiviteten hos specifika celltyper kan också mätas genom att uttrycka kalciumindikatorer i genetiskt definierade neuronala populationer. Tillämpning av avbildningsmetoden för modeller av små ryggradsdjur öppnar nya möjligheter inom neuronala beräkningar över hjärnregioner.
Zebrafiskar är ett mycket använt modellsystem inom neurovetenskaplig forskning. Zebrafisklarver cirka 6 dagar efter befruktning har använts för kalciumavbildning på grund av deras miniatyrhjärna och genomskinliga kropp4. Juvenila zebrafiskar (3-4 veckor gamla) används också för att studera de neurala mekanismer som ligger till grund för sensomotoriska banor 5,6. Den maximala prestationsnivån för komplexa beteenden, inklusive associativ inlärning och sociala beteenden, uppnås dock vid en högre ålderpå 7,8 år. Därför krävs ett tillförlitligt protokoll för att studera flera kognitiva funktioner i hjärnan hos vuxna zebrafiskar med hjälp av avbildningsmetoder. Medan zebrafisklarver och unga zebrafiskar kan bäddas in i agaros för in vivo-avbildning, lider vuxna zebrafiskar vid 2 månader eller äldre av hypoxi under sådana förhållanden och är fysiskt för starka för att hållas tillbaka av agaros. Därför krävs ett kirurgiskt ingrepp för att stabilisera hjärnan och göra det möjligt för djuret att andas fritt genom gälarna.
Här beskriver vi ett nackstödsprotokoll som innebär en ny design av en enda huvudbåge. Den förkortade operationstiden på 25 minuter är dubbelt så snabb som den tidigare metoden9. Vi beskriver också utformningen av inspelningskammaren (semi-sexkantig tank), huvudsteget och en snabblåsmekanism för att kombinera de två delarna9. Slutligen beskrivs också upplägget för att presentera en uppslukande visuell stimulans för att studera visuellt utlöst hjärnaktivitet och beteenden. Sammantaget kan de procedurer som beskrivs här användas för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i genetiskt definierade cellpopulationer i en vuxen zebrafisk med fastspända huvud, vilket möjliggör undersökning av hjärnaktiviteter under olika beteendeparadigm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica. Detaljer om forskningsverktygen finns i materialförteckningen.
1. Förberedelse av inspelningskammaren
- Förbered en halvsexkantig tank, en bottenplatta och ett huvudsteg (Figur 1A; Kompletterande filer 1-3). Huvudsteget består av två metallstolpar som är fästa på en cirkulär platta. Den cirkulära plattan innehåller spår som kan låsas fast på bottenplattan. Efter att ha låsts ihop läggs huvudsteget och bottenplattan i botten av den halvsexkantiga tanken.
- Placera den halvsexkantiga tanken på mikroskopets experimentplattform. Plattformen ska kunna röra sig i X- och Y-riktningarna utan att nå gränsen för översättningssteget.
- Rikta det 810 nm infraröda (IR) ljuset och kameran mot huvudet stage för beteendeinspelning. Se till att kamerans synfält är tillräckligt stort för att passa en vuxen zebrafisk.
- För att förhindra att tvåfotonlasern och den visuella stimulansen stör beteendeinspelningen, ställ in ett 875 nm kortpassfilter respektive ett 700 nm långpassfilter framför kameran.
- För att presentera den visuella stimulansen, fäst bakprojektionsfilmer på insidan av de tre väggarna i den halvsexkantiga tanken (figur 1A).
- Rikta de tre projektorerna mot tankens tre ytor. De tre bilderna ska justeras för att bilda en kontinuerlig visuell scen. För att förhindra att projektorlampor kontaminerar kalciumfluorescenssignalen, placera ett neutralt densitetsfilter och ett rött färgfilter (600 nm, långpass) framför varje projektor och placera ett bandpassfilter (510/80 nm) framför fotomultiplikatorröret (PMT).
Figur 1: Instrument som krävs för huvudstödskirurgi. (A) Snabblåsmekanismen mellan huvudstegets cirkulära platta och bottenplattan inuti den halvsexkantiga tanken. CAD-filer (computer-aided design) för de specialtillverkade delarna finns i tilläggsfilerna 1-4. (B) Ω-formad huvudbåge för huvudstödet. (C) Den treaxliga mikromanipulatorn som används för att placera huvudstången mot fästplatsen. Infälld: huvudstångens orientering i leran. (D) Kanon för att hålla fisken under operationen. Infälld: orientering av fisken i kanonen. E) Fiskladdningsmodul och den mikromanipulator som används för att lasta fisken på huvudstadiet. Infälld: orientering av fisken i modulen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Kirurgi av nackstöd
- Förbered en Ω-formad huvudstång (Figur 1B; Kompletterande fil 4) för zebrafiskens nackstöd. För att göra detta, fäst en bit oljebaserad modellera på en treaxlig mikromanipulator. Se till att leran är tillräckligt fast för att hålla fast huvudstången, men tillräckligt mjuk för att lossna från huvudstången efter nackstödet.
- Sätt in en arm på huvudstången i leran och rikta huvudstången horisontellt (Figur 1C). Detta kommer att säkerställa att den senare fastsättningen av huvudstången på zebrafisken kommer att vara jämn.
OBS: Huvudstången kan vara gjord av titan (24 mg) eller rostfritt stål (43 mg) och kan återanvändas för flera experiment. Materialet i huvudstången påverkar inte beteendet hos vuxna zebrafiskar (vikten varierar mellan 300-1 000 mg) under ett nackstöd. - Förbered kanonen, ett ihåligt rör för att hålla fiskkroppen på plats under operationen (Figur 1D).
- Bered 0,03 % och 0,01 % tricaine metansulfonat (TMS; se materialtabell) i akvariumvatten. Detta kommer att användas för att bedöva och hålla fisken i ett sederat tillstånd under operationen.
- Förbered fyra vävnadspinnar för att ta bort överflödig hud och vatten från fästställena på skallen. För att förbereda varje pinne, skär en pappershandduk i en 3 cm fyrkant och vik längs dess diagonal för att få en rörliknande struktur. Vrid rörets ändar till en fin spets. Fästplatsen är mycket liten, så en fin spets ger finare kontroll över pinnen.
- Förbered en fiskladdningsmodul för mikromanipulatorn (Figur 1E).
OBS: Modulen består av två stålstolpar som hålls samman av en rätvinklig stolpe clamp. En stolpe fästs på mikromanipulatorn, medan den andra stolpen håller en roterande stolpklämma som bär fisken. Modulen används för att placera fisken på huvudsteget med fin kontroll. Den roterande stolpklämman fungerar som en tonhöjdsjusterare för att ändra fiskens stigningsvinkel. - Bedöva fisken med 0,03 % TMS i akvarievatten. Under de följande stegen ska du använda en spruta för att tillföra 0,01 % TMS i akvarievatten till munnen i korta pulser var 90:e sekund. Vattenflödet från perfusionen bör framkalla gälrörelser. Detta gör att fisken kan överleva i mer än 40 minuter under operationen.
OBS: Tg[neuroD:GCaMP6f] används på grund av dess breda uttryck av kalciumindikatorn i framhjärnan i både larv- och vuxenstadiet10.
OBS: Alternativt kan du använda gravitationsperfusion för att ge konstant vattenflöde till munnen under perioder under operationen där båda händerna är upptagna. - Linda in fisken i en kapsel (Figur 2A) som håller fisken inuti kanonen.
- Linda in den sövda fisken i en bit fuktig pappersduk från stjärtspetsen till cirka 1 mm stjärtfena till gälarna. Se till att förpackningen är tät för att förhindra att fisken glider ut ur vävnaden.
- Linda en mjuk plastslang med en längsgående skåra (t.ex. en medelstor krympslang som skärs upp) runt pappersduken så att den täcker fisken från slutet av stjärten till cirka 2 mm stjärtfena till gälen. Slangen ser till att fiskens kropp förblir rak under hela operationen.
- Linda en pappershandduk runt slangen till en diameter som ungefär motsvarar kanonens diameter.
- Linda ett mjukt plaströr som klippts ut från glödlampan på en plastöverföringspipett runt pappershandduken. Detta säkerställer att kapseln kan laddas smidigt i kanonen.
- Ladda fisken i kanonen.
- Använd en skalpell för att ta bort huden som täcker fästställena, två triangulära områden av skallen rostrolateralt mot lillhjärnan och ovanför gälarna (Figur 2B), ta sedan bort huden som täcker området mellan fästställena. Använd vävnadsservetter för att torka ut fästställena och rensa bort eventuell kvarvarande hud.
- Använd en justerbar plattform för att stödja huvudet under hudborttagningen, men plattformen får inte komma i kontakt med ögonen för att undvika ögonskador under operationen.
OBS: Noggrann borttagning av huden vid fästställena är avgörande för att minska rörelseartefakter under avbildning.
- Använd en justerbar plattform för att stödja huvudet under hudborttagningen, men plattformen får inte komma i kontakt med ögonen för att undvika ögonskador under operationen.
- Applicera en droppe vävnadslim (se materialtabell) i mitten av varje fästställe med en 10 μL pipettspets.
OBS: Silkslim täcker fästställena och torkar snabbt. Vävnadslimmet ger ett bindningsgränssnitt mellan skallen och tandcementet som används för att limma huvudstången och förhindrar att vatten från gälarna når fäststället. - Sätt fiskkroppen i upprätt läge och placera huvudstången något ovanför och stjärtfenan mot fästställena som förberedelse för limning av huvudstången.
- Bered tandcement (se materialtabell) och använd den omedelbart för att limma fast huvudstången på skallen (Figur 2C). Ingreppet är tidskänsligt och måste göras inom 45 sekunder.
- Blanda en liten sked polymer med fyra droppar snabbmonomer och en droppe katalysator V. Rör om blandningen jämnt i 15 s.
- Använd en mikropipett och en 10 μL pipettspets för att applicera blandningen på fästställena och området mellan ställena. Undvik att täcka gälarna och ögonen.
- Tryck försiktigt fast huvudstången på cementen med hjälp av mikromanipulatorn. Täck huvudstången med kvarvarande cement.
- Vänta i 12 minuter så att tandcementet kan härda. Undvik vattenkontakt med cementen.
- För att förbättra den optiska åtkomsten till framhjärnan för kalciumavbildning, ta bort huden ovanför telencefalon. Hudborttagning kan göras på 3 minuter med fem snitt med en skalpell (Figur 2D). Se till att lipiddroppar som fastnat på skallens yta avlägsnas.
- Efter härdning, ta bort leran från huvudstången.
- Överför hela kapseln från kanonen till tonhöjdsjusteraren i mikromanipulatorns fiskladdningsmodul.
- Använd mikromanipulatorn för att placera fisken. Huvudstången ska placeras ovanpå metallstolparna på huvudstage. Öka fiskens tonhöjdsvinkel något så att framhjärnans yta bättre kan anpassas till det optiska planet under tvåfotonavbildning.
- Limma fast huvudstången på metallstolparna med ultraviolett (UV)-härdbart lim. En UV-exponering på 15 s är tillräcklig för härdning.
- Dra ut fisken ur kapseln och lås fast huvudsteget på bottenplattan i det halvsexkantiga akvariet.
- Sänk ner djuret i akvarievatten. Fisken ska börja andas och återhämta sig från narkos inom 1-2 min.
OBS: Alternativt kan du använda sprutperfusion för att leverera färskt vatten till munnen.
Figur 2: Viktiga steg vid operation av huvudstöd . (A) Kapselns sammansättning inuti kanonen. (B) Fästpunkter på skallen (röda). Röda pilar anger blodkärlens platser. (C) Topp: huvudstång fäst vid fiskskallen. Botten: fisk lastad på huvudscenen. (D) Skärsår som behövs för att avlägsna huden ovanför framhjärnan. Siffror anger skärsekvensen. Undvik att ta bort skinnet på det markerade stället (pilspetsen) för att förhindra blödning av djuret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Avbildning med två foton
- Slå på lasern och vänta i 30 minuter tills strömmen stabiliseras. Ställ in våglängden på 920 nm och effekten på cirka 50 mW vid sample.
OBS: Laserstrålen som styrs av resonansskannern rör sig långsamt vid skanningsbanans vändpunkter. För att förhindra vävnadsskador används en Pockels-cell för att minska lasereffekten vid vändpunkterna. - Placera den registreringskammare som innehåller zebrafisken med huvudet på experimentplattformen (figur 3A). Plattformen ska kunna röra sig i X- och Y-riktningarna utan att nå gränsen för översättningssteget.
- Placera objektivlinsen så nära framhjärnans yta som möjligt. Objektivlinsen ska riktas mot pupillens framkant (Figur 3B).
- Öppna laserslutaren och aktivera PMT. Höj objektivlinsen gradvis (~1 mm) tills den dorsala framhjärnan avslöjas i fluorescensbilden (Figur 3C).
- För att öka antalet registrerade neuroner, använd en piezoaktuator för att ta bilder på flera djup (sex bildplan, 15 μm från varandra). Detta kommer att öka datautbytet på bekostnad av bildfrekvensen. Aktivera snabb Z-axelskanning för att styra piezoställdonet (enhetligt läge, antal skivor = 6, stegstorlek = 15 μm, vågform = sågtand, flyback-tid = 4 ms, ställdonsfördröjning = 8 ms).
- För beteenderegistrering, slå på de 810 nm infraröda (IR) lamporna på båda sidor av tanken. Justera vinkeln för att lysa upp hela kroppen, vilket ska synas tydligt i kameran.
- Slå på projektorerna.
- Börja spela in data.
Figur 3: Inställning för att utföra kalciumavbildning, beteenderegistrering och visuell stimulusvisning . (A) Tre projektorer ger en visuell stimulans på väggarna i den halvsexkantiga tanken. IR-lampor på sidan används för att lysa upp zebrafiskens kropp. (B) Placering av objektivlinsen. Vänster: framifrån. Höger: sedd från sidan. Avståndet mellan 16x objektivlinsen och den riktade hjärnregionen är cirka 2.5 mm. (C) Exempel på tvåfotonbild. Vänster: maximal projektion av hela den dorsala framhjärnan i Tg[neuroD:GCaMP6f]. Höger: inzoomad bild för att avslöja neuroner i flera hjärnregioner. Infälld: en högre förstoring från en annan hjärnregion. Bilderna är medelvärden av 10 s data som registrerats vid 5 Hz. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet består av två delar: huvudstödskirurgi och tvåfotonkalciumavbildning av neuronala aktiviteter i framhjärnan. Operationens framgång definieras av djurets överlevnad och nackstödets stabilitet. Överlevnadsgraden kan förbättras avsevärt genom frekvent perfusion av 0,01 % TMS-lösning genom munnen under operationen. Fiskar bör återhämta sig från bedövning och andas aktivt inom 1-2 minuter efter att ha sänkts ner i akvarievatten. Kalciumavbildning med två foton möjliggör aktivitetsregistrering av enskilda nervceller i den dorsala framhjärnan på ett djup upp till 200 μm från hjärnytan genom intakta skallar (~40 μm i tjocklek). Detta bildområde täcker flera zoner av den dorsala telencefalon (D), inklusive den mediala zonen (Dm), den rostrala delen av den centrala zonen (rDc), den kaudala delen av den centrala zonen (cDc) och den laterala zonen (Dl). Tillsammans utgör de 30 % av telencefalon hos vuxna zebrafiskar (Figure 3C). Med volymetrisk avbildning med piezo-aktuatorn registrerar vi vanligtvis aktiviteten hos 150 neuroner i Dl eller cDc och 300 neuroner i Dm och rDc i Tg[neuroD:GCaMP6f]10. Samtidig beteenderegistrering utförs under hjärnavbildning, vilket möjliggör identifiering av neuronala korrelat till motoriska utgångar (Figur 4).
Under avbildning med två fotoner bör svansrörelser inte inducera en synlig rörelseartefakt i bilden. En liten (<1 μm) och övergående rörelse kan observeras under extrem kamp. Dessa rörelser är vanligtvis reversibla, så avbildningen kan fortsätta efteråt. Vi observerar också en långsam drift (<1 μm min-1) i laterala och axiella riktningar9. För att förhindra förlust av neuroner på grund av axiell provdrift begränsar vi vanligtvis vår avbildningssession till 10 minuter. Fotoblekning av kalciumindikatorn bör inte observeras efter en 10 minuters bildsession under den angivna lasereffekten.
Figur 4: Beteendespårning och neuralt aktivitetsmönster hos vuxna zebrafiskar. (A) Ett exempel på en kamerainspelning av beteende (ventral vy). (B) Aktivitet hos nervceller i framhjärnan (ΔF/F, svart) och svansens rörelseintensitet (blå). Intensiteten i svansrörelsen kvantifierades med medelvärdet av den absoluta pixelvisa skillnaden mellan på varandra följande videobildrutor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Bottenplattans utformning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Utformning av den cirkulära plattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3: Utformning av den halvsexkantiga tanken. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: Utformning av huvudstången. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Information om felsökning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att hålla fast huvudet på vuxna zebrafiskar för kalciumavbildning med två fotoner. Det finns två viktiga steg för att uppnå ett nackstöd som är tillräckligt stabilt för laserskanning. Först måste huvudstången limmas fast på skallarnas specifika fästställen. Andra delar av skallen är ofta för tunna för att ge mekanisk stabilitet och kan till och med få frakturer vid starka kroppsrörelser. För det andra måste huden ovanför fästställena tas bort noggrant. Kvarvarande vatten bör också torkas noggrant. Detta gör att skallen kan binda hårt till vävnadslimmet. En tabell som listar potentiella problem, deras orsaker och lösningar tillhandahålls (tilläggstabell 1).
På grund av den krökta geometrin i zebrafiskens framhjärna färdas excitationsstrålen och den resulterande emissionen genom olika tjocklekar av hjärnvävnaden över avbildningsplanet. Fluorescensen hos neuroner som avbildas inom en optisk sektion varierar således beroende på neuronens avstånd från hjärngränsen. Detta leder till låg datakapacitet under en inspelningssession. Problemet är särskilt allvarligt vid avbildning av Dl och cDc (Figur 3C). Här använder vi ett piezo-ställdon för att utföra inspelningar över flera axiella positioner, vilket äventyrar bildfrekvensen men ökar antalet inspelade neuroner. Det är viktigt att notera att eftersom neuronala aktiviteter vid flera axiella positioner registreras inom en enda beteendesession, har data en högre statistisk styrka jämfört med aktivitetsdata som registreras från flera beteendesessioner. Alternativt kan trefotonavbildning2 och adaptiv optik11 registrera neuronala aktiviteter i djupa vävnader och slappna av problemet med hög krökning. Repetitionsfrekvensen för trefotonlasrar och den heterogena strukturen hos kranier bör dock beaktas.
I jämförelse med tidigare metoder 9,12 som använder flera metalldelar för att stabilisera huvudet, gjorde det nuvarande tillvägagångssättet en betydande förbättring genom att använda en enda bit av en Ω-formad huvudstång. Denna förenklade design minskar operationstiden med 50 %. Protokollet är också lättare att lära sig och kan vanligtvis behärskas inom 2 veckors träning. Även om operationstiden till stor del är reducerad i jämförelse med det tidigare protokoll9, observerade vi inga uppenbara skillnader i överlevnad eller beteende under nackstödet. Till exempel är den tid under vilken djuret förblir aktivt under mikroskopet liknande (3-8 timmar, beroende på djur). Den tid som krävs för djuret att vakna upp från narkosen efter operationen är också liknande (1-2 min). Den transgena linjen10 som används i detta protokoll involverar en enda transgen som kodar för kalciumindikatorn i framhjärnan från larvstadiet till vuxen ålder, liknande uttryckstidslinjen för den trippeltransgena linjen som användes i en tidigare studie12.
För närvarande har protokollet följande begränsningar. För det första kan neuronal aktivitet avbildas genom skallen på ett djup upp till 200 μm från hjärnytan med hjälp av ett tvåfotonmikroskop. Bildkvaliteten på olika djup har tidigare kvantifierats 9,12. Dessa avbildningsdjup ger tillgång till de dorsala framhjärnsområdena Dm, DC och Dl, men utesluter potentiellt de ventrala framhjärnsområdena Vv, Vs, Vp och Vd hos vuxna zebrafiskar. Dessutom hindras optisk åtkomst till större delen av mellanhjärnan och bakhjärnan av närvaron av huvudstången och tandcement. Ytterligare ändringar av protokollet krävs för att utföra avbildning i dessa hjärnregioner. Dessutom begränsar vi vanligtvis en avbildningssession till 10 minuter för att förhindra betydande provavvikelser. Den potentiella orsaken till avdriften är försvagningen av bindningen mellan skallen och vävnadslimmet efter kraftiga svansrörelser. Om längre inspelningssessioner behövs kan volymetrisk avbildning med små axiella steg följt av 3D-bildregistrering utföras.
Detta nackstödsprotokoll öppnar upp för flera framtida tillämpningar. För det första kan kalciumavbildning med två fotoner, optogenetiska manipulationer, elektrofysiologi eller till och med ultraljudsavbildning utföras in vivo. Med trefotonavbildning kan neuronal aktivitet över hela framhjärnan också registreras2. Dessutom kan en mekanisk anordning konstrueras för att reversibelt ta tag i och släppa de två ändarna av huvudstången, vilket möjliggör longitudinell undersökning av neural aktivitet och kretsmorfologi över dagar. Slutligen ger den visuella displayen som vi beskrev ett 180° horisontellt synfält för djuret. Upplägget kan användas för att konstruera en uppslukande virtuell verklighetsmiljö som interagerar med fasthållna fiskarmed huvudet 9. Sammantaget möjliggör detta protokoll aktivitetsmätning av neuronala populationer över palliet hos vuxna zebrafiskar som beter sig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Institute of Molecular Biology, Academia Sinica och National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinverkstaden vid Institute of Physics, Academia Sinica hjälpte till att tillverka specialdesignade delar. Vi vill också tacka P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) för utformningen av huvudstegets snabblåsmekanism.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P.
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
