Summary
在这里，我们提出了一种在成年斑马鱼的背前脑中进行双光子钙成像的方案。
Abstract
成年斑马鱼（Danio rerio）表现出丰富的行为，用于研究认知功能。它们还有一个微型大脑，可用于通过光学成像方法测量跨大脑区域的活动。然而，关于记录成年斑马鱼大脑活动的报道很少。本研究描述了在成年斑马鱼背侧前脑进行双光子钙成像的程序。我们专注于限制成年斑马鱼移动头部的步骤，这提供了稳定性，可以对大脑活动进行激光扫描成像。头部束缚的动物可以在没有辅助工具的情况下自由移动身体部位和呼吸。该手术旨在缩短头部约束手术的时间，最大限度地减少大脑运动，并最大限度地增加记录的神经元数量。本文还描述了在钙成像过程中呈现沉浸式视觉环境的设置，可用于研究潜在的视觉触发行为的神经相关性。
Introduction
使用基因编码指示剂或合成染料的钙荧光成像一直是测量行为动物（包括非人灵长类动物、啮齿动物、鸟类和昆虫）神经元活动的有效方法1。使用多光子成像可以同时测量数百个细胞的活动，这些细胞在脑表面以下约800μm处2,3。特定细胞类型的活性也可以通过在遗传定义的神经元群中表达钙指示剂来测量。成像方法在小型脊椎动物模型中的应用为跨大脑区域的神经元计算领域开辟了新的可能性。
斑马鱼是神经科学研究中广泛使用的模型系统。受精后 6 天左右的斑马鱼幼虫由于其微型大脑和透明的身体而被用于钙成像4.幼年斑马鱼（3-4周龄）也用于研究感觉运动通路的神经机制5,6。然而，复杂行为（包括联想学习和社会行为）的最大表现水平是在年龄较大的 7,8 岁时达到的。因此，需要一个可靠的方案来使用成像方法研究成年斑马鱼大脑中的多种认知功能。虽然斑马鱼幼虫和幼年斑马鱼可以嵌入琼脂糖中进行活体成像，但 2 个月或以上的成年斑马鱼在这种情况下会缺氧，并且身体太强壮而无法被琼脂糖限制。因此，需要外科手术来稳定大脑并使动物能够通过鳃自由呼吸。
在这里，我们描述了一种头枕协议，该协议涉及单个头杆的新颖设计。缩短的手术时间缩短了 25 分钟，是以前方法9 的两倍。我们还描述了记录室（半六角形罐）、头部级和将两个部分组合在一起的快速锁定机构的设计9.最后，还描述了呈现沉浸式视觉刺激以研究视觉触发的大脑活动和行为的设置。总体而言，此处描述的程序可用于在头部束缚的成年斑马鱼的遗传定义的细胞群中进行双光子钙成像，从而能够研究各种行为范式中的大脑活动。
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Protocol
所有动物程序均按照中央研究院动物护理和使用机构委员会的指导方针批准和执行。研究工具的详细信息可以在 材料表中找到。
1、录音室的准备
- 准备一个半六角形罐、一个底板和一个头部阶段（图1A;补充文件1-3）。头部平台由连接到圆形板上的两个金属柱组成。圆形板包含可以锁定在底板上的凹槽。锁定在一起后，头级和底板铺设在半六角形罐的底部。
- 将半六角形槽放在显微镜的实验平台上。平台应该能够在 X 和 Y 方向上移动，而不会达到平移阶段的极限。
- 将 810 nm 红外 （IR） 光和相机对准头部tage 进行行为记录。确保相机的视野足够大，可以容纳成年斑马鱼。
- 为防止双光子激光和视觉刺激干扰行为记录，请在相机前分别设置875nm短通滤光片和700nm长通滤光片。
- 为了呈现视觉刺激，将背投薄膜贴在半六边形罐的三个壁的内侧（图1A）。
- 将三个投影仪对准水箱的三个表面。三个图像应对齐以形成一个连续的视觉场景。为防止投影机灯污染钙荧光信号，请在每台投影机前面放置一个中性密度滤光片和一个红色滤光片（600 nm，长通），并在光电倍增管 （PMT） 前面放置一个带通滤光片 （510/80 nm）。
图 1：头部约束手术所需的器械。 （A）半六角罐内头部阶段的圆板与底板之间的快速锁定机构。定制零件的计算机辅助设计 （CAD） 文件可在补充文件 1-4 中找到。（二）用于头枕的Ω形头杆。（C） 用于将头杆定位到连接部位的三轴显微操纵器。插图：头杆在粘土中的方向。（D） 在手术过程中用大炮固定鱼。插图：鱼在大炮内的方向。（E） 鱼装载模块和用于将鱼装载到头部阶段的显微操纵器。插图：模块内鱼的方向。请点击这里查看此图的较大版本.
2. 头枕手术
- 准备一个Ω形的顶杆（图1B; 补充文件 4）用于斑马鱼头枕。为此，将一块油基建模粘土连接到三轴显微操纵器上。确保粘土足够坚固以固定头杆，但又足够柔软，以便在头枕后从头杆上分离。
- 将头杆的臂插入粘土中，并使头杆水平定向（图1C）。这将确保稍后将头杆连接到斑马鱼上是水平的。
注意：头杆可以由钛（24毫克）或不锈钢（43毫克）制成，可以重复用于多个实验。头杆材料不会影响成年斑马鱼（体重范围为 300-1,000 毫克）在头枕下的行为。 - 准备大炮，一个用于在手术过程中将鱼体固定到位的空心管（图1D）。
- 在鱼缸水中制备0.03%和0.01%甲磺酸三卡因（TMS;见 材料表）。这将用于在手术期间麻醉和保持鱼处于镇静状态。
- 准备四根组织拭子，以去除颅骨附着部位多余的皮肤和水分。准备每根拭子时，将纸巾切成 3 厘米见方，并沿其对角线折叠以产生管状结构。将管子的末端拧成一个细点。附着部位非常小，因此细小的点可以更精细地控制拭子。
- 为显微操纵器准备鱼加载模块（图1E）。
注意： 该模块由两个钢柱组成，钢柱由直角柱固定在一起amp.一根柱子连接到显微操纵器上，而另一根柱子则装有携带鱼的旋转柱夹。该模块用于通过精细控制将鱼定位到头部舞台上。旋转的立柱夹用作螺距调节器，以改变鱼的螺距角。 - 在鱼缸水中用0.03%TMS麻醉鱼。在以下步骤中，使用注射器每 90 秒以短脉冲将鱼缸水中的 0.01% TMS 输送到口腔中。灌注中的水流应引起鳃运动。这将使鱼在手术过程中存活超过 40 分钟。
注：Tg[neuroD：GCaMP6f] 因其在幼虫和成虫阶段10 的前脑中广泛表达钙指示剂而使用。
注意：或者，在双手被占用的手术期间，使用重力灌注为口腔提供恒定的水流。 - 将鱼包裹在胶囊中（图2A），将鱼固定在大炮内。
- 将麻醉的鱼包裹在一块湿纸巾中，从尾尖到尾部约1毫米到鳃。确保包裹牢固，以防止鱼从组织中滑出。
- 在纸巾周围缠绕一根带有纵向狭缝的软塑料管（例如，切开的中等大小的热缩管），以覆盖从尾巴末端到尾部约 2 毫米到鳃的鱼。管子确保鱼的身体在整个手术过程中保持笔直。
- 将纸巾缠绕在管道周围，其直径与大炮的直径大致相似。
- 将一根从塑料移液管的灯泡上切下的软塑料管缠绕在纸巾上。这确保了胶囊可以顺利地装入大炮中。
- 将鱼装入大炮。
- 使用手术刀去除覆盖附着部位的皮肤，即小脑外侧和鳃上方颅骨喙外侧的两个三角形区域（图2B），然后去除覆盖附着部位之间区域的皮肤。使用组织棉签擦干附着部位并清除任何残留的皮肤。
- 在去除皮肤时使用可调节的平台支撑头部，但平台不得接触眼睛，以免在手术过程中受伤。
注意： 彻底去除附着部位的皮肤对于减少成像过程中的运动伪影至关重要。
- 在去除皮肤时使用可调节的平台支撑头部，但平台不得接触眼睛，以免在手术过程中受伤。
- 使用 10 μL 移液器吸头在每个附着部位的中心涂抹一滴组织胶（参见 材料表）。
注意： 纸巾胶覆盖附着部位并迅速变干。组织胶在颅骨和用于粘合头杆的牙胶之间提供粘合界面，并防止鳃中的水到达附着部位。 - 将鱼体直立放置，将头杆略高于附着部位，并尾部贴合，为头杆胶合做准备。
- 准备牙科水泥（见 材料表）并立即将其用于将头杆粘在颅骨上（图2C）。该过程对时间敏感，必须在 45 秒内完成。
- 将一小勺聚合物与四滴快速单体和一滴催化剂V混合，将混合物均匀搅拌15秒。
- 使用微量移液器和 10 μL 移液器吸头将混合物涂抹在附着部位和部位之间的区域。避免遮盖鳃和眼睛。
- 使用显微操纵器将头杆轻轻压在水泥上。用剩余的水泥盖住头杆。
- 等待 12 分钟，让牙水泥固化。避免水与水泥接触。
- 为了改善前脑的光学通路进行钙成像，请去除端脑上方的皮肤。皮肤去除可以在3分钟内完成，使用手术刀进行五次切割（图2D）。确保去除粘附在颅骨表面的脂滴。
- 固化后，从头杆上取下粘土。
- 将整个胶囊从大炮转移到显微操纵器的鱼加载模块中的螺距调节器。
- 使用显微操纵器定位鱼。头杆应位于头台金属柱的顶部tage.稍微增加鱼的俯仰角，使前脑表面在双光子成像时能更好地对准光学平面。
- 用紫外线 （UV） 固化胶水将头杆粘在金属柱上。15 秒的紫外线照射足以固化。
- 从胶囊中拉出鱼，并将头部tage锁定在半六角形水箱内的底板上。
- 将动物浸入鱼缸水中。鱼应在 1-2 分钟内开始呼吸并从麻醉中恢复。
注意：或者，使用注射器灌注将淡水输送到口腔。
图 2：头部约束手术中的关键步骤 。 （A）大炮内部胶囊的组成。（B） 颅骨上的附着部位（红色）。红色箭头表示血管部位。（C） 顶部：头杆附着在鱼头骨上。底部：鱼装载到头部阶段。（D） 切除前脑上方皮肤所需的切口。数字表示切割顺序。避免在标记部位（箭头）去除皮肤，以防止动物出血。 请点击这里查看此图的较大版本.
3. 双光子成像
- 打开激光器并等待 30 分钟，让电源稳定下来。将样品的波长设置为920 nm，功率设置为50 mW左右。
注意： 由谐振扫描仪控制的激光束在扫描路径的转弯点缓慢移动。为了防止组织损伤，使用普克尔斯池来降低转折点的激光功率。 - 将包含头部束缚斑马鱼的记录室放在实验平台上（图3A）。平台应该能够在 X 和 Y 方向上移动，而不会达到平移阶段的极限。
- 将物镜放置在尽可能靠近前脑表面的位置。物镜应对准瞳孔的前缘（图3B）。
- 打开激光快门并启用PMT。 逐渐抬高物镜（~1mm），直到荧光图像中显示背侧前脑（图3C）。
- 为了增加记录的神经元数量，使用压电陶瓷促动器获取多个深度（六个图像平面，相距15μm）的图像。这将以牺牲帧速率为代价来增加数据产量。启用快速 Z 轴扫描以控制压电陶瓷促动器（均匀模式，切片数 = 6，步长 = 15 μm，波形 = 锯齿波，反激式时间 = 4 ms，促动器滞后 = 8 ms）。
- 要进行行为记录，请打开水箱两侧的 810 nm 红外 （IR） 灯。调整角度以照亮整个身体，这在相机中应该清晰可见。
- 打开投影仪。
- 开始记录数据。
图 3：用于执行钙成像、行为记录和 视觉刺激显示的设置。 （A） 三台投影仪将视觉刺激投射到半六角形水箱的壁上。侧面的红外灯用于照亮斑马鱼的身体。（B） 物镜的定位。左：前视图。右：侧视图。16倍物镜与目标大脑区域之间的距离约为2.5毫米。 （C）双光子图像示例。左图：Tg[neuroD：GCaMP6f]中整个背前脑的最大投影。右图：放大图像，显示多个大脑区域的神经元。插图：来自不同大脑区域的更高放大倍率。图像是以 5Hz 记录的 10 秒数据的平均值。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
该协议由两部分组成：头部约束手术和前脑神经元活动的双光子钙成像。手术的成功取决于动物的存活率和头枕的稳定性。手术时经口频繁灌注0.01%TMS溶液可大大提高存活率。鱼应从麻醉中恢复，并在浸入鱼缸水后1-2分钟内积极呼吸。双光子钙成像能够通过完整的颅骨（~40 μm）在距脑表面200μm深度的背侧前脑中记录单个神经元的活动。该成像范围覆盖端脑背侧 （D） 的多个区域，包括内侧区 （Dm）、中央区 （rDc） 的喙部、中央区 （cDc） 的尾部和外侧区 （Dl）。它们共同占成年斑马鱼端脑的 30%（图 3C）。使用压电陶瓷促动器进行体积成像时，我们通常记录 Dl 或 cDc 中 150 个神经元的活动，以及 Tg[neuroD：GCaMP6f]10 中 Dm 和 rDc 中 300 个神经元的活动。在脑成像期间进行同步行为记录，从而能够识别运动输出的神经元相关性（图 4）。
在双光子成像过程中，尾部运动不应在图像中引起可见的运动伪影。在极度挣扎期间可以观察到小的 （<1 μm） 和瞬态运动。这些运动通常是可逆的，因此之后可以继续进行影像学检查。我们还观察到横向和轴向的缓慢漂移（<1μm min-1）9。为了防止由于轴向样品漂移而导致神经元丢失，我们通常将成像时间限制在 10 分钟。在指定的激光功率下进行10分钟成像后，不应观察到钙指示剂的光漂白。
图4：成年斑马鱼的行为跟踪和神经活动模式。 （A） 相机记录行为的示例帧（腹侧视图）。（B） 前脑神经元的活动（ΔF/F，黑色）和尾部运动强度（蓝色）。尾巴运动的强度通过连续视频帧之间的绝对像素差异的平均值来量化。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件1：底板设计。请点击这里下载此文件。
补充文件2：圆板的设计。请点击这里下载此文件。
补充文件3：半六角形储罐的设计。请点击这里下载此文件。
补充文件4：头杆的设计。请点击这里下载此文件。
补充表 1：故障排除详细信息。请点击这里下载此文件。
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Discussion
在这里，我们描述了一种详细的方案，以限制成年斑马鱼的头部进行双光子钙成像。要实现足够稳定的头枕，有两个关键步骤可以进行激光扫描成像。首先，头杆必须粘在头骨的特定附着部位。颅骨的其他部位通常太薄，无法提供机械稳定性，甚至可能在剧烈的身体运动中骨折。其次，必须彻底去除附着部位上方的皮肤。残留的水也应彻底干燥。这使得头骨能够与组织胶紧密结合。提供了一个表格，列出了潜在问题、其原因和解决方案（补充表 1）。
由于斑马鱼前脑的弯曲几何形状，激发束和由此产生的发射穿过成像平面穿过不同厚度的脑组织。因此，在光学切片内成像的神经元的荧光根据神经元与大脑边界的距离而变化。这会导致录制会话中的数据产量较低。在对Dl和cDc进行成像时，这个问题尤为严重（图3C）。在这里，我们使用压电陶瓷促动器在多个轴向位置进行记录，这会影响帧速率，但会增加记录的神经元数量。重要的是，由于在单个行为会话中记录了多个轴向位置的神经元活动，因此与从多个行为会话记录的活动数据相比，该数据具有更高的统计功效。或者，三光子成像2 和自适应光学11 可以记录深层组织中的神经元活动并放松高曲率问题。但是，应考虑三光子激光的重复率和头骨的异质结构。
与以前使用多个金属部件来稳定头部的方法 9,12 相比，当前的方法通过使用单块Ω形头部杆进行了显着改进。这种简化的设计将手术时间缩短了 50%。该协议也更容易学习，通常可以在培训后 2 周内掌握。尽管与之前的方案9 相比，手术时间大大缩短，但我们没有观察到头束下的存活率和行为存在明显差异。例如，动物在显微镜下保持活跃的持续时间是相似的（3-8小时，取决于动物）。手术后动物从麻醉中醒来所需的时间也相似（1-2分钟）。该协议中使用的转基因系10涉及单个转基因，该转基因编码从幼虫期到成年期前脑中的钙指示剂，类似于先前研究中使用的三转基因系的表达时间线12。
目前，该协议具有以下限制。首先，可以使用双光子显微镜在距大脑表面最深 200 μm 的颅骨上对神经元活动进行成像。不同深度的图像质量先前已量化为9,12。这些成像深度允许进入前脑背侧区域 Dm、Dc 和 Dl，但可能排除成年斑马鱼的腹侧前脑区域 Vv、Vs、Vp 和 Vd。此外，头杆和牙骨水泥的存在阻碍了大部分中脑和后脑的光学通路。需要对协议进行额外的修改才能在这些大脑区域进行成像。此外，我们通常将成像时间限制在 10 分钟，以防止明显的样品漂移。漂移的潜在原因是剧烈的尾巴运动后颅骨和组织胶之间的结合减弱。如果需要更长的记录时间，可以执行小轴向步长的体积成像，然后进行 3D 图像配准。
这种头枕协议开辟了几种未来的应用。首先，可以在 体内进行双光子钙成像、光遗传学操作、电生理学甚至超声成像。通过三光子成像，还可以记录整个前脑的神经元活动2.此外，还可以构造一个机械装置来可逆地抓取和释放头杆的两端，从而可以在几天内对神经活动和电路形态进行纵向研究。最后，我们描述的视觉显示设置为动物提供了 180° 的水平视野。该装置可用于构建一个身临其境的虚拟现实环境，与头部束缚的鱼9 进行交互。总体而言，该协议能够测量行为成年斑马鱼的神经元群的活动。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了中央研究院分子生物学研究所和台湾国家科学技术委员会的支持。中央研究院物理研究所的机械车间帮助制造定制设计的零件。我们还要感谢 P. Argast（瑞士巴塞尔弗里德里希·米歇尔生物医学研究所）设计了头部载物台的快速锁定机制。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
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