Summary
Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.
Abstract
Volwassen zebravissen (Danio rerio) vertonen een rijk repertoire aan gedragingen voor het bestuderen van cognitieve functies. Ze hebben ook een miniatuurbrein dat kan worden gebruikt voor het meten van activiteiten in hersengebieden door middel van optische beeldvormingsmethoden. Rapporten over de registratie van hersenactiviteit bij zich gedragende volwassen zebravissen zijn echter schaars. De huidige studie beschrijft procedures om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen. We richten ons op stappen om te voorkomen dat volwassen zebravissen hun kop bewegen, wat zorgt voor stabiliteit die laserscanning van de hersenactiviteit mogelijk maakt. De dieren met hun hoofd kunnen hun lichaamsdelen vrij bewegen en ademen zonder hulpmiddelen. De procedure heeft tot doel de tijd van een hoofdsteunoperatie te verkorten, de hersenbeweging te minimaliseren en het aantal geregistreerde neuronen te maximaliseren. Hier wordt ook een opstelling beschreven voor het presenteren van een meeslepende visuele omgeving tijdens calciumbeeldvorming, die kan worden gebruikt om neurale correlaten te bestuderen die ten grondslag liggen aan visueel getriggerd gedrag.
Introduction
Calciumfluorescentiebeeldvorming met genetisch gecodeerde indicatoren of synthetische kleurstoffen is een krachtige methode geweest om neuronale activiteit te meten bij zich gedragende dieren, waaronder niet-menselijke primaten, knaagdieren, vogels eninsecten. De activiteit van honderden cellen, tot ongeveer 800 μm onder het hersenoppervlak, kan tegelijkertijd worden gemeten met behulp van multi-fotonbeeldvorming 2,3. De activiteit van specifieke celtypen kan ook worden gemeten door calciumindicatoren tot expressie te brengen in genetisch gedefinieerde neuronale populaties. Toepassing van de beeldvormingsmethode voor kleine gewervelde modellen opent nieuwe mogelijkheden op het gebied van neuronale berekeningen over hersengebieden.
Zebravissen zijn een veelgebruikt modelsysteem in neurowetenschappelijk onderzoek. Larvale zebravissen zijn ongeveer 6 dagen na de bevruchting gebruikt voor calciumbeeldvorming vanwege hun miniatuurhersenen en transparante lichaam4. Juveniele zebravissen (3-4 weken oud) worden ook gebruikt voor het bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan sensomotorische routes 5,6. Het maximale prestatieniveau voor complex gedrag, waaronder associatief leren en sociaal gedrag, wordt echter bereikt op een oudere leeftijd 7,8 jaar. Er is dus een betrouwbaar protocol nodig om meerdere cognitieve functies in de hersenen van volwassen zebravissen te bestuderen met behulp van beeldvormingsmethoden. Terwijl zebravislarven en juveniele zebravissen kunnen worden ingebed in agarose voor in vivo beeldvorming, lijden volwassen zebravissen van 2 maanden of ouder in dergelijke omstandigheden aan hypoxie en zijn ze fysiek te sterk om door agarose te worden tegengehouden. Daarom is een chirurgische ingreep nodig om de hersenen te stabiliseren en het dier vrij door de kieuwen te laten ademen.
Hier beschrijven we een hoofdsteunprotocol dat een nieuw ontwerp van een enkele hoofdbeugel omvat. De verkorte operatietijd van 25 minuten is twee keer zo snel als de vorige methode9. We beschrijven ook het ontwerp van de opnamekamer (semi-zeshoekige tank), de hoofdtrap en een snelvergrendelingsmechanisme om de twee delen te combineren9. Ten slotte wordt ook de opstelling beschreven om een meeslepende visuele stimulus te presenteren om visueel getriggerde hersenactiviteit en -gedrag te bestuderen. Over het algemeen kunnen de hier beschreven procedures worden gebruikt om calciumbeeldvorming met twee fotonen uit te voeren in genetisch gedefinieerde celpopulaties in een volwassen zebravis met een hoofd, waardoor hersenactiviteiten tijdens verschillende gedragsparadigma's kunnen worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van Academia Sinica. Details van de onderzoeksinstrumenten zijn te vinden in de Materiaaltabel.
1. Voorbereiding van de opnamekamer
- Bereid een semi-zeshoekige tank, een grondplaat en een hoofdtrap voor (Figuur 1A; Aanvullende bestanden 1-3). Het hoofdpodium bestaat uit twee metalen palen die aan een ronde plaat zijn bevestigd. De ronde plaat bevat groeven die op de grondplaat kunnen worden vergrendeld. Nadat ze aan elkaar zijn vergrendeld, worden de hoofdtrap en de bodemplaat op de bodem van de semi-zeshoekige tank gelegd.
- Plaats de semi-zeshoekige tank op het experimentele platform van de microscoop. Het platform moet in staat zijn om in de X- en Y-richting te bewegen zonder de limiet van de vertaalfase te raken.
- Richt het 810 nm infrarood (IR) licht en de camera op het hoofdpodium voor gedragsregistratie. Zorg ervoor dat het gezichtsveld van de camera groot genoeg is voor een volwassen zebravis.
- Om te voorkomen dat de twee-fotonlaser en de visuele stimulus de gedragsopname verstoren, plaatst u respectievelijk een 875 nm kortdoorlaatfilter en een 700 nm langdoorlaatfilter voor de camera.
- Om de visuele stimulus te presenteren, bevestigt u back-projectiefilms aan de binnenkant van de drie wanden van de semi-zeshoekige tank (Figuur 1A).
- Richt de drie projectoren op de drie oppervlakken van de tank. De drie afbeeldingen moeten worden uitgelijnd om een doorlopende visuele scène te vormen. Om te voorkomen dat projectorlampen het calciumfluorescentiesignaal vervuilen, plaatst u een filter met neutrale dichtheid en een rood kleurenfilter (600 nm, long-pass) voor elke projector en plaatst u een banddoorlaatfilter (510/80 nm) voor de fotomultiplicatorbuis (PMT).
Figuur 1: Instrumenten die nodig zijn voor operaties aan de hoofdsteun. (A) Het snelvergrendelingsmechanisme tussen de ronde plaat van de hoofdtrap en de grondplaat in de semi-zeshoekige tank. CAD-bestanden (Computer-aided Design) van de op maat gemaakte onderdelen zijn te vinden in Supplementary Files 1-4. (B) Ω-vormige hoofdbeugel voor de hoofdsteun. (C) De drie-assige micromanipulator die wordt gebruikt om de hoofdstang op de bevestigingsplaats te plaatsen. Inzet: oriëntatie van de balhoofdstang in de klei. (D) Kanon om de vis vast te houden tijdens de operatie. Inzet: oriëntatie van de vissen in het kanon. (E) Module voor het laden van vis en de micromanipulator die wordt gebruikt om de vis op de hoofdtrap te laden. Inzet: oriëntatie van de vissen binnen de module. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Operatie aan de hoofdsteun
- Bereid een Ω-vormige hoofdbalk voor (Figuur 1B; Aanvullend dossier 4) voor de zebravis hoofdsteun. Bevestig hiervoor een stuk boetseerklei op oliebasis aan een drie-assige micromanipulator. Zorg ervoor dat de klei stevig genoeg is om de hoofdbeugel vast te houden, maar zacht genoeg om na de hoofdsteun los te maken van de hoofdbeugel.
- Steek een arm van de hoofdstang in de klei en oriënteer de hoofdstang horizontaal (Figuur 1C). Dit zorgt ervoor dat de latere bevestiging van de kopbalk aan de zebravis waterpas komt te staan.
OPMERKING: De balhoofdstang kan worden gemaakt van titanium (24 mg) of roestvrij staal (43 mg) en kan worden hergebruikt voor meerdere experimenten. Het materiaal van de hoofdbeugel heeft geen invloed op het gedrag van volwassen zebravissen (gewicht varieert van 300-1.000 mg) onder een hoofdsteun. - Bereid het kanon voor, een holle buis om het lichaam van de vis op zijn plaats te houden tijdens de operatie (Figuur 1D).
- Bereid 0,03% en 0,01% tricaïnemethaansulfonaat (TMS; zie materiaaltabel) in aquariumwater. Dit zal worden gebruikt om de vis tijdens de operatie te verdoven en in een verdoofde toestand te houden.
- Bereid vier weefseluitstrijkjes voor om overtollige huid en water van de aanhechtingsplaatsen op de schedel te verwijderen. Om elk wattenstaafje voor te bereiden, snijdt u een papieren handdoek in een vierkant van 3 cm en vouwt u langs de diagonaal om een buisachtige structuur te krijgen. Draai de uiteinden van de buis in een fijne punt. De bevestigingsplaats is erg klein, dus een fijne punt zorgt voor een fijnere controle van het wattenstaafje.
- Bereid een vislaadmodule voor de micromanipulator voor (Figuur 1E).
NOTITIE: De module bestaat uit twee stalen palen die bij elkaar worden gehouden door een haakse paalklem. De ene paal wordt aan de micromanipulator bevestigd, terwijl de andere paal een roterende paalklem bevat die de vis draagt. De module wordt gebruikt om de vis met fijne controle op de hoofdstage te positioneren. De roterende paalklem dient als toonhoogteregelaar om de hellingshoek van de vis te veranderen. - Verdoof de vissen met 0,03% TMS in aquariumwater. Gebruik tijdens de volgende stappen een injectiespuit om elke 90 seconden 0,01% TMS in aquariumwater in korte pulsen aan de mond toe te dienen. De waterstroom uit de perfusie moet de kieuwbeweging induceren. Hierdoor kunnen de vissen tijdens de operatie meer dan 40 minuten overleven.
OPMERKING: Tg[neuroD:GCaMP6f] wordt gebruikt vanwege de brede expressie van de calciumindicator in de voorhersenen in zowel het larvale als het volwassen stadium10.
OPMERKING: Gebruik optioneel zwaartekrachtperfusie om een constante waterstroom naar de mond te zorgen tijdens perioden in de operatie waarbij beide handen bezet zijn. - Wikkel de vis in een capsule (Figuur 2A) die de vis in het kanon houdt.
- Wikkel de verdoofde vis in een stuk vochtig keukenpapier, beginnend vanaf het puntje van de staart tot ongeveer 1 mm caudaal tot de kieuw. Zorg ervoor dat de verpakking strak zit om te voorkomen dat de vis uit het weefsel glijdt.
- Wikkel een zachte plastic slang met een longitudinale gleuf (bijv. een middelgrote krimpkous opengesneden) om het papieren zakdoekje om de vis vanaf het uiteinde van de staart tot ongeveer 2 mm caudaal tot de kieuw te bedekken. De slang zorgt ervoor dat het lichaam van de vis tijdens de operatie recht blijft.
- Wikkel een papieren handdoek om de buis tot een diameter die ongeveer gelijk is aan de diameter van het kanon.
- Wikkel een zachte plastic buis die uit de bol van een plastic transferpipet is gesneden, om de papieren handdoek. Dit zorgt ervoor dat de capsule soepel in het kanon kan worden geladen.
- Laad de vis in het kanon.
- Gebruik een scalpel om de huid te verwijderen die de aanhechtingsplaatsen bedekt, twee driehoekige delen van de schedel rostrolateraal ten opzichte van het cerebellum en boven de kieuwen (figuur 2B), en verwijder vervolgens de huid die het gebied tussen de aanhechtingsplaatsen bedekt. Gebruik weefseluitstrijkjes om de aanhechtingsplaatsen uit te drogen en eventuele resterende huid te verwijderen.
- Gebruik een verstelbaar platform om het hoofd te ondersteunen tijdens het verwijderen van de huid, maar het platform mag niet in contact komen met de ogen om oogletsel tijdens de operatie te voorkomen.
OPMERKING: Grondige verwijdering van de huid op de aanhechtingsplaatsen is cruciaal bij het verminderen van bewegingsartefacten tijdens beeldvorming.
- Gebruik een verstelbaar platform om het hoofd te ondersteunen tijdens het verwijderen van de huid, maar het platform mag niet in contact komen met de ogen om oogletsel tijdens de operatie te voorkomen.
- Breng een druppel weefsellijm (zie Materiaaltabel) aan in het midden van elke bevestigingsplaats met behulp van een pipetpunt van 10 μL.
NOTITIE: Weefsellijm bedekt de bevestigingsplaatsen en droogt snel uit. De weefsellijm zorgt voor een hechtingsinterface tussen de schedel en het tandcement dat wordt gebruikt om de hoofdstang te lijmen, en voorkomt dat water uit de kieuwen de aanhechtingsplaats bereikt. - Zet het lichaam van de vis rechtop en plaats de hoofdbalk iets boven en caudaal op de bevestigingsplaatsen ter voorbereiding op het lijmen van de hoofdbalk.
- Bereid tandheelkundig cement voor (zie Tabel met materialen) en gebruik het onmiddellijk om de hoofdstang op de schedel te lijmen (Figuur 2C). De procedure is tijdgevoelig en moet binnen 45 s worden uitgevoerd.
- Meng een kleine lepel polymeer met vier druppels quick monomeer en een druppel katalysator V. Roer het mengsel gelijkmatig gedurende 15 s.
- Gebruik een micropipet en een pipetpunt van 10 μl om het mengsel op de aanhechtingsplaatsen en het gebied tussen de plaatsen aan te brengen. Vermijd het bedekken van de kieuwen en de ogen.
- Druk de kopstang voorzichtig op het cement met behulp van de micromanipulator. Bedek de hoofdbalk met het resterende cement.
- Wacht 12 minuten om het tandcement uit te harden. Vermijd watercontact met het cement.
- Om de optische toegang tot de voorhersenen voor calciumbeeldvorming te verbeteren, verwijdert u de huid boven het telencephalon. Het verwijderen van de huid kan in 3 minuten worden gedaan met vijf sneden met een scalpel (Figuur 2D). Zorg ervoor dat lipidedruppeltjes die aan het oppervlak van de schedels kleven, worden verwijderd.
- Verwijder na het uitharden de klei van de balhoofdstang.
- Breng de hele capsule over van het kanon naar de toonhoogteregelaar in de vislaadmodule van de micromanipulator.
- Gebruik de micromanipulator om de vis te positioneren. De hoofdstang moet bovenop de metalen palen van de hoofdtafel worden geplaatst. Verhoog de hellingshoek van de vis iets, zodat het oppervlak van de voorhersenen beter kan worden uitgelijnd met het optische vlak tijdens beeldvorming met twee fotonen.
- Lijm de kopstang op de metalen palen met ultraviolette (UV)-uithardende lijm. Een UV-blootstelling van 15 seconden is voldoende voor uitharding.
- Trek de vis uit de capsule en vergrendel de hoofdtrap op de bodemplaat in de semi-zeshoekige tank.
- Dompel het dier onder in aquariumwater. De vis moet binnen 1-2 minuten beginnen te ademen en herstellen van de anesthesie.
OPMERKING: Gebruik optioneel spuitperfusie om vers water in de mond te brengen.
Figuur 2: Belangrijke stappen tijdens een operatie aan de hoofdsteun . (A) Samenstelling van de capsule in het kanon. (B) Aanhechtingsplaatsen op de schedel (rood). Rode pijlen geven de plaatsen van bloedvaten aan. (C) Bovenkant: hoofdstang bevestigd aan de schedel van de vis. Bodem: vis geladen op het hoofdpodium. (D) Snijwonden die nodig zijn om de huid boven de voorhersenen te verwijderen. Cijfers geven de snijvolgorde aan. Vermijd het verwijderen van de huid op de gemarkeerde plaats (pijlpunt) om bloedingen van het dier te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Beeldvorming met twee fotonen
- Schakel de laser in en wacht 30 minuten totdat het vermogen is gestabiliseerd. Stel de golflengte in op 920 nm en het vermogen op ongeveer 50 mW bij het monster.
OPMERKING: De laserstraal die door de resonantiescanner wordt bestuurd, beweegt langzaam op de keerpunten van het scanpad. Om weefselbeschadiging te voorkomen, wordt een Pockels-cel gebruikt om het laservermogen op de omslagpunten te verminderen. - Plaats de registratiekamer met de kopvastgezette zebravis op het experimentele platform (figuur 3A). Het platform moet in staat zijn om in de X- en Y-richting te bewegen zonder de limiet van de vertaalfase te raken.
- Plaats de objectieflens zo dicht mogelijk bij het oppervlak van de voorhersenen. De objectieflens moet op de voorkant van de pupil worden gericht (Figuur 3B).
- Open de lasersluiter en schakel de PMT in. Til de objectieflens geleidelijk op (~1 mm) totdat de dorsale voorhersenen zichtbaar zijn in het fluorescentiebeeld (Figuur 3C).
- Om het aantal geregistreerde neuronen te vergroten, gebruikt u een piëzo-actuator om beelden op meerdere diepten te verkrijgen (zes beeldvlakken, 15 μm uit elkaar). Dit verhoogt de dataopbrengst ten koste van de framesnelheid. Schakel snel scannen van de Z-as in om de piëzo-actuator te besturen (uniforme modus, aantal plakjes = 6, stapgrootte = 15 μm, golfvorm = zaagtand, flyback-tijd = 4 ms, actuatorvertraging = 8 ms).
- Schakel voor gedragsregistratie de 810 nm infrarood (IR) lampen aan beide zijden van de tank in. Pas de hoek aan om het hele lichaam te verlichten, wat duidelijk zichtbaar moet zijn in de camera.
- Zet de projectoren aan.
- Begin met het opnemen van gegevens.
Afbeelding 3: Opstelling voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming, gedragsregistratie en visuele stimulusweergave . (A) Drie projectoren geven een visuele prikkel op de wanden van de halfzeshoekige tank. IR-lampen aan de zijkant worden gebruikt om het lichaam van de zebravis te verlichten. (B) Positionering van de objectieflens. Links: vooraanzicht. Rechts: zijaanzicht. De afstand tussen de 16x objectieflens en het beoogde hersengebied is ongeveer 2,5 mm. (C) Voorbeeld van een afbeelding met twee fotonen. Links: maximale projectie van de gehele dorsale voorhersenen in Tg[neuroD:GCaMP6f]. Rechts: ingezoomde afbeelding om neuronen in meerdere hersengebieden te onthullen. Inzet: een hogere vergroting van een ander hersengebied. Beelden zijn gemiddelden van 10 s aan gegevens opgenomen bij 5Hz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol bestaat uit twee delen: een hoofdsteunoperatie en twee-foton calciumbeeldvorming van neuronale activiteiten in de voorhersenen. Het succes van een operatie wordt bepaald door de overleving van het dier en de stabiliteit van de hoofdsteun. Het overlevingspercentage kan sterk worden verbeterd door frequente perfusie van 0,01% TMS-oplossing via de mond tijdens de operatie. Vissen moeten herstellen van de anesthesie en actief ademen binnen 1-2 minuten nadat ze in aquariumwater zijn ondergedompeld. Calciumbeeldvorming met twee fotonen maakt activiteitsregistratie mogelijk van individuele neuronen in de dorsale voorhersenen op een diepte tot 200 μm van het hersenoppervlak door intacte schedels (~40 μm dik). Dit beeldvormingsbereik omvat meerdere zones van het dorsale telencephalon (D), waaronder de mediale zone (Dm), het rostrale deel van de centrale zone (rDc), het caudale deel van de centrale zone (cDc) en de laterale zone (Dl). Samen vormen ze 30% van het telencephalon bij volwassen zebravissen (Figure 3C). Met volumetrische beeldvorming met behulp van de piëzo-actuator registreren we doorgaans de activiteit van 150 neuronen in Dl of cDc, en 300 neuronen in Dm en rDc in Tg[neuroD:GCaMP6f]10. Gelijktijdige gedragsregistratie wordt uitgevoerd tijdens beeldvorming van de hersenen, waardoor neuronale correlaten van motorische outputs kunnen worden geïdentificeerd (Figuur 4).
Tijdens beeldvorming met twee fotonen mogen staartbewegingen geen zichtbaar bewegingsartefact in het beeld veroorzaken. Een kleine (<1 μm) en voorbijgaande beweging kan worden waargenomen tijdens extreme worstelingen. Deze bewegingen zijn meestal omkeerbaar, zodat de beeldvorming daarna kan worden voortgezet. We zien ook een langzame drift (<1 μm min-1) in de laterale en axiale richting9. Om het verlies van neuronen als gevolg van axiale monsterdrift te voorkomen, beperken we onze beeldvormingssessie doorgaans tot 10 minuten. Fotobleken van de calciumindicator mag niet worden waargenomen na een beeldvormingssessie van 10 minuten onder het gespecificeerde laservermogen.
Figuur 4: Gedragstracking en neuraal activiteitspatroon bij volwassen zebravissen. (A) Een voorbeeldframe van camera-opname van gedrag (ventrale weergave). (B) Activiteit van neuronen in de voorhersenen (ΔF/F, zwart) en intensiteit van de staartbeweging (blauw). De intensiteit van de staartbeweging werd gekwantificeerd door het gemiddelde van het absolute pixelgewijze verschil tussen opeenvolgende videoframes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Ontwerp van de grondplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Ontwerp van de ronde plaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 3: Ontwerp van de semi-zeshoekige tank. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: Ontwerp van de hoofdbalk. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Details over het oplossen van problemen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de kop van volwassen zebravissen in bedwang te houden voor calciumbeeldvorming met twee fotonen. Er zijn twee cruciale stappen om een hoofdsteun te krijgen die stabiel genoeg is voor laserscanning. Eerst moet de hoofdbalk op de specifieke bevestigingsplaatsen van de schedels worden gelijmd. Andere delen van de schedel zijn vaak te dun om mechanische stabiliteit te bieden en kunnen zelfs worden gebroken tijdens sterke lichaamsbewegingen. Ten tweede moet de huid boven de aanhechtingsplaatsen grondig worden verwijderd. Restwater moet ook goed worden gedroogd. Hierdoor kan de schedel zich stevig binden aan de weefsellijm. Er wordt een tabel gegeven met mogelijke problemen, hun oorzaken en de oplossingen (aanvullende tabel 1).
Door de gekromde geometrie van de voorhersenen van de zebravis reizen de excitatiestraal en de resulterende emissie door verschillende diktes van het hersenweefsel over het beeldvormingsvlak. De fluorescentie van neuronen die in een optische sectie worden afgebeeld, varieert dus op basis van de afstand van het neuron tot de hersengrens. Dit leidt tot een lage dataopbrengst binnen een opnamesessie. Het probleem is vooral ernstig bij het in beeld brengen van de Dl en cDc (Figuur 3C). Hier gebruiken we een piëzo-actuator om opnames uit te voeren over meerdere axiale posities, die de framesnelheid in gevaar brengen, maar het aantal geregistreerde neuronen verhogen. Belangrijk is dat, aangezien neuronale activiteiten op meerdere axiale posities worden geregistreerd binnen een enkele gedragssessie, de gegevens een hogere statistische kracht hebben in vergelijking met activiteitsgegevens die zijn geregistreerd tijdens meerdere gedragssessies. Als alternatief kunnen drie-foton beeldvorming2 en adaptieve optica11 de neuronale activiteiten in diepe weefsels registreren en het probleem met hoge kromming ontspannen. Er moet echter rekening worden gehouden met de herhalingssnelheid van drie-fotonlasers en de heterogene structuur van schedels.
In vergelijking met eerdere methoden 9,12 die meerdere metalen onderdelen gebruiken om de kop te stabiliseren, is de huidige aanpak aanzienlijk verbeterd door een enkel stuk van een Ω-vormige hoofdstang te gebruiken. Dit vereenvoudigde ontwerp verkort de operatietijd met 50%. Het protocol is ook gemakkelijker te leren en kan doorgaans binnen 2 weken na de training onder de knie worden gekregen. Hoewel de operatietijd aanzienlijk is verkort in vergelijking met het vorige protocol9, hebben we geen duidelijke verschillen waargenomen in overlevingspercentage of gedrag onder de hoofdsteun. De tijdsduur waarin het dier actief blijft onder de microscoop is bijvoorbeeld vergelijkbaar (3-8 uur, afhankelijk van het dier). De hoeveelheid tijd die het dier nodig heeft om na de operatie uit de narcose te ontwaken, is ook vergelijkbaar (1-2 min). De transgene lijn10 die in dit protocol wordt gebruikt, omvat een enkel transgen dat codeert voor de calciumindicator in de voorhersenen vanaf het larvale stadium tot de volwassenheid, vergelijkbaar met de expressietijdlijn van de drievoudige transgene lijn die in een eerdere studie werd gebruikt12.
Momenteel heeft het protocol de volgende beperkingen. Ten eerste kan neuronale activiteit door de schedel worden afgebeeld op een diepte tot 200 μm van het hersenoppervlak met behulp van een microscoop met twee fotonen. De beeldkwaliteit op verschillende dieptes is eerder gekwantificeerd 9,12. Deze beeldvormingsdieptes geven toegang tot de dorsale voorhersengebieden Dm, DC en Dl, maar sluiten mogelijk de ventrale voorhersengebieden Vv, Vs, Vp en Vd uit bij volwassen zebravissen. Bovendien wordt de optische toegang tot het grootste deel van de middenhersenen en de achterhersenen belemmerd door de aanwezigheid van de hoofdbalk en tandcement. Aanvullende aanpassingen aan het protocol zijn nodig om beeldvorming in deze hersengebieden uit te voeren. Bovendien beperken we een beeldvormingssessie doorgaans tot 10 minuten om significante monsterdrift te voorkomen. De mogelijke oorzaak van de drift is de verzwakking van de hechting tussen de schedel en de weefsellijm na krachtige staartbewegingen. Als langere opnamesessies nodig zijn, kan volumetrische beeldvorming met kleine axiale stappen gevolgd door 3D-beeldregistratie worden uitgevoerd.
Dit protocol voor hoofdsteunen opent verschillende toekomstige toepassingen. Ten eerste kunnen twee-foton calciumbeeldvorming, optogenetische manipulaties, elektrofysiologie of zelfs echografie in vivo worden uitgevoerd. Met beeldvorming met drie fotonen kan ook neuronale activiteit in de hele voorhersenen worden geregistreerd2. Bovendien kan een mechanisch apparaat worden geconstrueerd om de twee uiteinden van de hoofdbalk omkeerbaar vast te pakken en los te laten, waardoor longitudinaal onderzoek van neurale activiteit en circuitmorfologie over dagen mogelijk wordt. Ten slotte biedt de visuele weergave-opstelling die we hebben beschreven een horizontaal gezichtsveld van 180° voor het dier. De opstelling kan worden gebruikt om een meeslepende virtual reality-omgeving te bouwen die interageert met vissen met een ingehouden hoofd9. Over het algemeen maakt dit protocol het mogelijk om activiteitsmetingen te doen van neuronale populaties in het pallium van zich gedragende volwassen zebravissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, en de National Science and Technology Council, Taiwan. De machinewerkplaats van het Institute of Physics, Academia Sinica, hielp bij het vervaardigen van op maat ontworpen onderdelen. We willen ook P. Argast (Friedrich Miescher Instituut voor Biomedisch Onderzoek, Basel, Zwitserland) bedanken voor het ontwerp van het snelsluitmechanisme van de hoofdstage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P.
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
