Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.
Abstract
Ausgewachsene Zebrafische (Danio rerio) weisen ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen zur Untersuchung kognitiver Funktionen auf. Sie verfügen auch über ein Miniaturgehirn, mit dem Aktivitäten in verschiedenen Hirnregionen durch optische Bildgebungsverfahren gemessen werden können. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Aufzeichnung der Gehirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen. Die vorliegende Studie beschreibt Verfahren zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von adulten Zebrafischen. Wir konzentrieren uns auf Schritte, um erwachsene Zebrafische daran zu hindern, ihren Kopf zu bewegen, was eine Stabilität bietet, die eine Laserscanning-Bildgebung der Gehirnaktivität ermöglicht. Die kopfgefesselten Tiere können ihre Körperteile frei bewegen und ohne Hilfsmittel atmen. Das Verfahren zielt darauf ab, die Zeit der Kopfstützenoperation zu verkürzen, die Gehirnbewegung zu minimieren und die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu maximieren. Hier wird auch ein Aufbau zur Darstellung einer immersiven visuellen Umgebung während der Kalziumbildgebung beschrieben, der verwendet werden kann, um neuronale Korrelate zu untersuchen, die visuell ausgelösten Verhaltensweisen zugrunde liegen.
Introduction
Die Kalziumfluoreszenz-Bildgebung mit genetisch kodierten Indikatoren oder synthetischen Farbstoffen ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der neuronalen Aktivität bei sich verhaltenden Tieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, Nagetiere, Vögel und Insekten1. Die Aktivität von Hunderten von Zellen, bis zu etwa 800 μm unter der Gehirnoberfläche, kann gleichzeitig mit Hilfe der Multi-Photonen-Bildgebung gemessenwerden 2,3. Die Aktivität bestimmter Zelltypen kann auch durch die Expression von Kalziumindikatoren in genetisch definierten neuronalen Populationen gemessen werden. Die Anwendung des bildgebenden Verfahrens für kleine Wirbeltiermodelle eröffnet neue Möglichkeiten im Bereich der neuronalen Berechnung über Hirnregionen hinweg.
Zebrafische sind ein weit verbreitetes Modellsystem in der neurowissenschaftlichen Forschung. Zebrafischlarven etwa 6 Tage nach der Befruchtung wurden aufgrund ihres Miniaturgehirns und ihres transparenten Körpers für die Kalziumbildgebung verwendet4. Juvenile Zebrafische (3-4 Wochen alt) werden auch verwendet, um die neuronalen Mechanismen zu untersuchen, die sensomotorischen Bahnen zugrunde liegen 5,6. Das maximale Leistungsniveau für komplexe Verhaltensweisen, einschließlich assoziativem Lernen und sozialem Verhalten, wird jedoch im Alter von 7,8 Jahren erreicht. Daher ist ein zuverlässiges Protokoll erforderlich, um mehrere kognitive Funktionen im Gehirn erwachsener Zebrafische mit bildgebenden Verfahren zu untersuchen. Während Zebrafischlarven und juvenile Zebrafische für die In-vivo-Bildgebung in Agarose eingebettet werden können, leiden erwachsene Zebrafische ab 2 Monaten unter solchen Bedingungen an Hypoxie und sind körperlich zu stark, um durch Agarose zurückgehalten zu werden. Daher ist ein chirurgischer Eingriff erforderlich, um das Gehirn zu stabilisieren und dem Tier die freie Atmung durch die Kiemen zu ermöglichen.
Hier beschreiben wir ein Kopfstützenprotokoll, das ein neuartiges Design eines einzelnen Kopfbügels beinhaltet. Die verkürzte Operationszeit von 25 Minuten ist doppelt so schnell wie bei der bisherigen Methode9. Wir beschreiben auch das Design der Aufnahmekammer (halbsechseckiger Tank), der Kopfstufe und eines Schnellverschlussmechanismus, um die beiden Teile9 zu verbinden. Abschließend wird auch der Aufbau zur Präsentation eines immersiven visuellen Stimulus zur Untersuchung visuell ausgelöster Gehirnaktivität und -verhaltensweisen beschrieben. Insgesamt können die hier beschriebenen Verfahren zur Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung in genetisch definierten Zellpopulationen in einem kopfgebundenen adulten Zebrafisch verwendet werden, was die Untersuchung von Gehirnaktivitäten während verschiedener Verhaltensparadigmen ermöglicht.
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Protocol
Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Academia Sinica genehmigt und durchgeführt. Details zu den Forschungsinstrumenten finden Sie in der Materialtabelle.
1. Vorbereitung der Aufnahmekammer
- Bereiten Sie einen halbsechseckigen Tank, eine Grundplatte und eine Kopfstufe vor (Abbildung 1A; Ergänzungsakten 1-3). Die Kopfstufe besteht aus zwei Metallpfosten, die an einer kreisförmigen Platte befestigt sind. Die runde Platte enthält Nuten, die auf der Grundplatte arretiert werden können. Nach dem Verriegeln werden die Kopfstufe und die Bodenplatte auf den Boden des halbsechseckigen Tanks gelegt.
- Stellen Sie den halbsechseckigen Tank auf die Versuchsplattform des Mikroskops. Die Plattform sollte in der Lage sein, sich in X- und Y-Richtung zu bewegen, ohne an die Grenzen der Übersetzungsphase zu stoßen.
- Richten Sie das 810-nm-Infrarotlicht (IR) und die Kamera zur Verhaltensaufzeichnung auf die Kopfstufe. Stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld der Kamera groß genug ist, um einen ausgewachsenen Zebrafisch aufzunehmen.
- Um zu verhindern, dass der Zwei-Photonen-Laser und der visuelle Reiz die Verhaltensaufzeichnung stören, stellen Sie einen 875-nm-Kurzpassfilter bzw. einen 700-nm-Langpassfilter vor der Kamera auf.
- Um den visuellen Reiz zu präsentieren, werden Rückprojektionsfolien an der Innenseite der drei Wände des halbsechseckigen Tanks angebracht (Abbildung 1A).
- Richte die drei Projektoren auf die drei Oberflächen des Tanks. Die drei Bilder sollten so ausgerichtet werden, dass sie eine zusammenhängende visuelle Szene bilden. Um zu verhindern, dass Projektorlichter das Kalziumfluoreszenzsignal verunreinigen, platzieren Sie einen Neutraldichtefilter und einen roten Farbfilter (600 nm, Langpass) vor jedem Projektor und einen Bandpassfilter (510/80 nm) vor der Photomultiplier-Röhre (PMT).
Abbildung 1: Instrumente, die für die Kopfstützenchirurgie erforderlich sind. (A) Der Schnellverschlussmechanismus zwischen der kreisförmigen Platte der Kopfstufe und der Grundplatte im Inneren des halbsechseckigen Tanks. CAD-Dateien (Computer-Aided Design) der Sonderanfertigungen finden Sie in den Ergänzungsdateien 1-4. (B) Ω förmiger Kopfbügel für die Kopfstütze. (C) Der dreiachsige Mikromanipulator, der verwendet wird, um die Kopfstange an der Befestigungsstelle zu positionieren. Einschub: Ausrichtung der Kopfstange im Ton. (D) Kanone, um den Fisch während der Operation zu halten. Einschub: Ausrichtung der Fische innerhalb der Kanone. (E) Fischlademodul und Mikromanipulator, mit dem der Fisch auf die Kopfstufe geladen wird. Einschub: Orientierung der Fische innerhalb des Moduls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Kopfstützen-Chirurgie
- Bereiten Sie eine Ω förmige Kopfleiste vor (Abbildung 1B; Ergänzungsdatei 4) für die Zebrafisch-Kopfstütze. Befestigen Sie dazu ein Stück Modelliermasse auf Ölbasis an einem dreiachsigen Mikromanipulator. Stellen Sie sicher, dass der Ton fest genug ist, um die Kopfstange zu halten, aber weich genug, um sich nach der Kopfstütze von der Kopfstange zu lösen.
- Stecken Sie einen Arm der Kopfstange in den Ton und richten Sie die Kopfstange horizontal aus (Abbildung 1C). Dadurch wird sichergestellt, dass die spätere Befestigung des Kopfbügels am Zebrafisch waagerecht ist.
HINWEIS: Die Kopfstange kann aus Titan (24 mg) oder Edelstahl (43 mg) bestehen und kann für mehrere Experimente wiederverwendet werden. Das Material der Kopfstange hat keinen Einfluss auf das Verhalten von erwachsenen Zebrafischen (Gewichtsbereiche von 300-1.000 mg) unter einer Kopfstütze. - Bereiten Sie die Kanone vor, ein hohles Rohr, um den Fischkörper während der Operation an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 1D).
- 0,03 % und 0,01 % Tricainmethansulfonat (TMS; siehe Materialtabelle) in Aquarienwasser herstellen. Dies wird verwendet, um den Fisch während der Operation zu betäuben und in einem sedierten Zustand zu halten.
- Bereiten Sie vier Gewebeabstriche vor, um überschüssige Haut und Wasser von den Befestigungsstellen am Schädel zu entfernen. Um jeden Tupfer vorzubereiten, schneiden Sie ein Papiertuch in ein 3 cm großes Quadrat und falten Sie es entlang seiner Diagonale, um eine röhrenartige Struktur zu erhalten. Drehen Sie die Enden des Rohres zu einer feinen Spitze. Die Befestigungsstelle ist sehr klein, so dass eine feine Spitze eine feinere Kontrolle des Tupfers ermöglicht.
- Bereiten Sie ein Fischlademodul für den Mikromanipulator vor (Abbildung 1E).
HINWEIS: Das Modul besteht aus zwei Stahlpfosten, die durch eine rechtwinklige Pfostenklemme zusammengehalten werden. Ein Pfosten wird am Mikromanipulator befestigt, während der andere Pfosten eine drehbare Pfostenklemme hält, die den Fisch trägt. Das Modul dient dazu, den Fisch fein gesteuert auf der Kopfstufe zu positionieren. Die drehbare Pfostenklemme dient als Pitch-Einsteller, um den Pitch-Winkel des Fisches zu verändern. - Betäuben Sie die Fische mit 0,03 % TMS im Aquarienwasser. Verwenden Sie bei den folgenden Schritten eine Spritze, um 0,01 % TMS im Aquarienwasser in kurzen Impulsen alle 90 s in den Mund zu geben. Der Wasserfluss aus der Perfusion sollte die Kiemenbewegung induzieren. Dadurch können die Fische während der Operation mehr als 40 Minuten überleben.
HINWEIS: Tg[neuroD:GCaMP6f] wird aufgrund seiner breiten Expression des Kalziumindikators im Vorderhirn sowohl im Larven- als auch im adulten Stadium verwendet10.
HINWEIS: Optional können Sie die Schwerkraftperfusion verwenden, um während der Operation, in denen beide Hände beschäftigt sind, einen konstanten Wasserfluss in den Mund zu gewährleisten. - Wickeln Sie den Fisch in eine Kapsel (Abbildung 2A), die den Fisch in der Kanone hält.
- Wickeln Sie den betäubten Fisch in ein Stück feuchtes Papiertaschentuch, beginnend von der Schwanzspitze bis etwa 1 mm kaudal bis zur Kieme. Achten Sie darauf, dass die Verpackung fest sitzt, um ein Herausrutschen des Fisches aus dem Gewebe zu verhindern.
- Wickeln Sie einen weichen Plastikschlauch mit einem Längsschlitz (z. B. einen mittelgroßen Schrumpfschlauch, der aufgeschnitten wurde) um das Papiertuch, um den Fisch vom Ende des Schwanzes bis etwa 2 mm kaudal bis zur Kieme zu bedecken. Der Schlauch sorgt dafür, dass der Körper des Fisches während der gesamten Operation gerade bleibt.
- Wickle ein Papiertuch um den Schlauch mit einem Durchmesser, der ungefähr dem Durchmesser der Kanone entspricht.
- Wickeln Sie ein weiches Plastikröhrchen, das Sie aus dem Kolben einer Plastiktransferpipette geschnitten haben, um das Papiertuch. Dadurch wird sichergestellt, dass die Kapsel reibungslos in die Kanone geladen werden kann.
- Lade den Fisch in die Kanone.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut zu entfernen, die die Befestigungsstellen bedeckt, zwei dreieckige Bereiche des Schädels rostrolateral zum Kleinhirn und über den Kiemen (Abbildung 2B), und entfernen Sie dann die Haut, die den Bereich zwischen den Befestigungsstellen bedeckt. Verwenden Sie Gewebetupfer, um die Befestigungsstellen auszutrocknen und die verbleibende Haut zu entfernen.
- Verwenden Sie eine verstellbare Plattform, um den Kopf während der Hautentfernung zu stützen, aber die Plattform darf die Augen nicht berühren, um Augenverletzungen während der Operation zu vermeiden.
HINWEIS: Eine gründliche Entfernung der Haut an den Befestigungsstellen ist entscheidend, um Bewegungsartefakte während der Bildgebung zu reduzieren.
- Verwenden Sie eine verstellbare Plattform, um den Kopf während der Hautentfernung zu stützen, aber die Plattform darf die Augen nicht berühren, um Augenverletzungen während der Operation zu vermeiden.
- Tragen Sie mit einer 10-μl-Pipettenspitze einen Tropfen Gewebekleber (siehe Materialtabelle) in die Mitte jeder Befestigungsstelle auf.
HINWEIS: Gewebekleber bedeckt die Befestigungsstellen und trocknet schnell aus. Der Gewebekleber stellt eine Bindungsschnittstelle zwischen dem Schädel und dem Zahnzement dar, der zum Verkleben der Kopfleiste verwendet wird, und verhindert, dass Wasser aus den Kiemen die Befestigungsstelle erreicht. - Bringen Sie den Fischkörper in eine aufrechte Position und positionieren Sie die Kopfstange leicht oberhalb und kaudal zu den Befestigungsstellen, um die Verklebung der Kopfstange vorzubereiten.
- Bereiten Sie Zahnzement vor (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie ihn sofort, um den Kopfbügel auf den Schädel zu kleben (Abbildung 2C). Das Verfahren ist zeitkritisch und muss innerhalb von 45 Sekunden durchgeführt werden.
- Mischen Sie einen kleinen Löffel Polymer mit vier Tropfen schnellem Monomer und einem Tropfen Katalysator V. Rühren Sie die Mischung gleichmäßig für 15 Sekunden.
- Verwenden Sie eine Mikropipette und eine 10-μl-Pipettenspitze, um die Mischung auf die Befestigungsstellen und den Bereich zwischen den Stellen aufzutragen. Vermeiden Sie es, die Kiemen und die Augen zu bedecken.
- Drücken Sie die Kopfstange mit dem Mikromanipulator vorsichtig auf den Zement. Den Kopfbügel mit dem restlichen Zement bedecken.
- Warten Sie 12 Minuten, damit der Zahnzement ausgehärtet ist. Vermeiden Sie den Kontakt von Wasser mit dem Zement.
- Um den optischen Zugang zum Vorderhirn für die Kalziumbildgebung zu verbessern, entfernen Sie die Haut oberhalb des Telencephalons. Die Hautentfernung kann in 3 Minuten mit fünf Schnitten mit einem Skalpell durchgeführt werden (Abbildung 2D). Achten Sie darauf, dass Lipidtröpfchen, die an der Oberfläche der Schädel haften, entfernt werden.
- Nach dem Aushärten den Ton von der Kopfleiste entfernen.
- Übertragen Sie die gesamte Kapsel von der Kanone auf den Pitch-Einsteller im Fischlademodul des Mikromanipulators.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator, um den Fisch zu positionieren. Die Kopfleiste sollte auf den Metallpfosten der Kopfstufe positioniert werden. Erhöhen Sie den Neigungswinkel des Fisches leicht, damit die Oberfläche des Vorderhirns bei der Zwei-Photonen-Bildgebung besser auf die optische Ebene ausgerichtet werden kann.
- Kleben Sie die Kopfstange mit ultraviolett (UV)-härtendem Kleber auf die Metallpfosten. Für die Aushärtung ist eine UV-Belichtung von 15 s ausreichend.
- Ziehen Sie den Fisch aus der Kapsel und befestigen Sie die Kopfstufe auf der Bodenplatte im halbsechseckigen Tank.
- Tauchen Sie das Tier in Aquarienwasser. Der Fisch sollte innerhalb von 1-2 Minuten mit der Atmung beginnen und sich von der Narkose erholen.
HINWEIS: Verwenden Sie optional eine Spritzenperfusion, um frisches Wasser in den Mund zu geben.
Abbildung 2: Wichtige Schritte während der Kopfstützenoperation . (A) Zusammensetzung der Kapsel im Inneren der Kanone. (B) Befestigungsstellen am Schädel (rot). Rote Pfeile geben die Stellen der Blutgefäße an. (C) Oben: Kopfstange, die am Schädel des Fisches befestigt ist. Unten: Fisch, der auf die Kopfstufe geladen wurde. (D) Schnitte, die benötigt werden, um die Haut über dem Vorderhirn zu entfernen. Zahlen bezeichnen die Schnittreihenfolge. Vermeiden Sie die Hautentfernung an der markierten Stelle (Pfeilspitze), um ein Ausbluten des Tieres zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Zwei-Photonen-Bildgebung
- Schalten Sie den Laser ein und warten Sie 30 Minuten, bis sich die Stromversorgung stabilisiert hat. Stellen Sie die Wellenlänge auf 920 nm und die Leistung auf etwa 50 mW an der Probe ein.
HINWEIS: Der vom Resonanzscanner gesteuerte Laserstrahl bewegt sich an den Wendepunkten des Scanpfads langsam. Um Gewebeschäden zu vermeiden, wird eine Pockels-Zelle eingesetzt, um die Laserleistung an den Turnaround-Punkten zu reduzieren. - Platzieren Sie die Aufzeichnungskammer mit dem am Kopf gefesselten Zebrafisch auf der Versuchsplattform (Abbildung 3A). Die Plattform sollte in der Lage sein, sich in X- und Y-Richtung zu bewegen, ohne an die Grenzen der Übersetzungsphase zu stoßen.
- Platzieren Sie die Objektivlinse so nah wie möglich an der Oberfläche des Vorderhirns. Die Objektivlinse sollte auf den vorderen Rand der Pupille gerichtet sein (Abbildung 3B).
- Öffnen Sie den Laserverschluss und aktivieren Sie die PMT. Heben Sie die Objektivlinse allmählich an (~1 mm), bis das dorsale Vorderhirn im Fluoreszenzbild sichtbar ist (Abbildung 3C).
- Um die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu erhöhen, verwenden Sie einen Piezoaktor, um Bilder in mehreren Tiefen (sechs Bildebenen im Abstand von 15 μm) aufzunehmen. Dadurch erhöht sich die Datenausbeute auf Kosten der Bildrate. Ermöglichen Sie eine schnelle Z-Achsen-Abtastung zur Steuerung des Piezoaktors (einheitlicher Modus, Anzahl der Schichten = 6, Schrittweite = 15 μm, Wellenform = Sägezahn, Flyback-Zeit = 4 ms, Aktuatorverzögerung = 8 ms).
- Um das Verhalten aufzuzeichnen, schalten Sie die 810-nm-Infrarotleuchten (IR) auf beiden Seiten des Tanks ein. Passen Sie den Winkel an, um den gesamten Körper zu beleuchten, der in der Kamera gut sichtbar sein sollte.
- Schalten Sie die Projektoren ein.
- Beginnen Sie mit dem Aufzeichnen von Daten.
Abbildung 3: Aufbau zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung, Verhaltensaufzeichnung und visueller Stimulusanzeige . (A) Drei Projektoren projizieren einen visuellen Reiz auf die Wände des halbsechseckigen Tanks. Seitliche IR-Leuchten dienen dazu, den Körper des Zebrafisches zu beleuchten. (B) Positionierung der Objektivlinse. Links: Vorderansicht. Rechts: Seitenansicht. Der Abstand zwischen der 16-fach-Objektivlinse und der anvisierten Hirnregion beträgt etwa 2,5 mm. (C) Beispiel Zwei-Photonen-Bild. Links: maximale Projektion des gesamten dorsalen Vorderhirns in Tg[neuroD:GCaMP6f]. Rechts: vergrößertes Bild, um Neuronen in mehreren Gehirnregionen sichtbar zu machen. Einschub: eine höhere Vergrößerung aus einer anderen Hirnregion. Bei den Bildern handelt es sich um Durchschnittswerte von 10 s Daten, die mit 5 Hz aufgezeichnet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Das Protokoll besteht aus zwei Teilen: der Kopfstützenchirurgie und der Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung neuronaler Aktivitäten im Vorderhirn. Der Erfolg einer Operation wird durch das Überleben des Tieres und die Stabilität der Kopfstütze bestimmt. Die Überlebensrate kann durch häufige Perfusion von 0,01%iger TMS-Lösung durch den Mund während der Operation stark verbessert werden. Die Fische sollten sich von der Narkose erholen und innerhalb von 1-2 Minuten aktiv atmen, nachdem sie in das Wasser des Aquariums eingetaucht wurden. Die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung ermöglicht die Aktivitätsaufzeichnung einzelner Neuronen im dorsalen Vorderhirn in einer Tiefe von bis zu 200 μm von der Gehirnoberfläche durch intakte Schädel (~40 μm Dicke). Dieser Bildgebungsbereich deckt mehrere Zonen des dorsalen Telencephalons (D) ab, einschließlich der medialen Zone (Dm), des rostralen Teils der zentralen Zone (rDc), des kaudalen Teils der zentralen Zone (cDc) und der lateralen Zone (Dl). Zusammen machen sie 30 % des Telencephalons in erwachsenen Zebrafischen aus (Abb. 3C). Bei der volumetrischen Bildgebung mit dem Piezoaktor zeichnen wir typischerweise die Aktivität von 150 Neuronen in Dl oder cDc und 300 Neuronen in Dm und rDc in Tg[neuroD:GCaMP6f]10 auf. Während der Bildgebung des Gehirns wird eine gleichzeitige Verhaltensaufzeichnung durchgeführt, die die Identifizierung neuronaler Korrelate motorischer Leistungen ermöglicht (Abbildung 4).
Bei der Zwei-Photonen-Bildgebung sollten Schweifbewegungen kein sichtbares Bewegungsartefakt im Bild hervorrufen. Eine kleine (<1 μm) und vorübergehende Bewegung kann bei extremem Kampf beobachtet werden. Diese Bewegungen sind in der Regel reversibel, so dass die Bildgebung anschließend fortgesetzt werden kann. Wir beobachten auch eine langsame Drift (<1 μm min-1) in lateraler und axialer Richtung9. Um den Verlust von Neuronen durch axiale Probendrift zu verhindern, beschränken wir unsere Bildgebungssitzung in der Regel auf 10 Minuten. Ein Photobleichen des Kalziumindikators sollte nach einer 10-minütigen Bildgebungssitzung unter der angegebenen Laserleistung nicht beobachtet werden.
Abbildung 4: Verhaltensverfolgung und neuronales Aktivitätsmuster bei erwachsenen Zebrafischen. (A) Ein Beispielbild für eine Kameraaufzeichnung des Verhaltens (ventrale Ansicht). (B) Aktivität der Neuronen des Vorderhirns (ΔF/F, schwarz) und Intensität der Schwanzbewegung (blau). Die Intensität der Schweifbewegung wurde durch den Mittelwert der absoluten pixelweisen Differenz zwischen aufeinanderfolgenden Videobildern quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsdatei 1: Entwurf der Grundplatte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 2: Entwurf der kreisförmigen Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 3: Entwurf des halbsechseckigen Behälters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 4: Entwurf der Kopfstange. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Details zur Fehlerbehebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Fixierung des Kopfes von erwachsenen Zebrafischen für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung. Es gibt zwei entscheidende Schritte, um eine Kopfstütze zu erreichen, die stabil genug für die Laserscanning-Bildgebung ist. Zuerst muss der Kopfbügel auf die spezifischen Befestigungsstellen der Schädel geklebt werden. Andere Teile des Schädels sind oft zu dünn, um mechanische Stabilität zu gewährleisten, und können bei starken Körperbewegungen sogar gebrochen werden. Zweitens muss die Haut oberhalb der Ansatzstellen gründlich entfernt werden. Auch Restwasser sollte gründlich getrocknet werden. Dadurch kann sich der Schädel fest mit dem Gewebekleber verbinden. Es wird eine Tabelle bereitgestellt, in der mögliche Probleme, ihre Ursachen und die Lösungen aufgeführt sind (Ergänzende Tabelle 1).
Aufgrund der gekrümmten Geometrie des Vorderhirns des Zebrafisches wandern der Anregungsstrahl und die daraus resultierende Emission durch unterschiedliche Dicken des Hirngewebes über die Bildebene. Daher variiert die Fluoreszenz von Neuronen, die innerhalb eines optischen Schnitts abgebildet werden, basierend auf dem Abstand des Neurons von der Gehirngrenze. Dies führt zu einer geringen Datenausbeute innerhalb einer Aufzeichnungssitzung. Besonders gravierend ist das Problem bei der Abbildung von Dl und cDc (Abbildung 3C). Hier verwenden wir einen Piezoaktor, um Aufnahmen über mehrere axiale Positionen hinweg durchzuführen, die die Bildrate beeinträchtigen, aber die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen erhöhen. Wichtig ist, dass die Daten im Vergleich zu Aktivitätsdaten, die aus mehreren Verhaltenssitzungen aufgezeichnet werden, eine höhere statistische Aussagekraft haben, da neuronale Aktivitäten an mehreren axialen Positionen innerhalb einer einzigen Verhaltenssitzung aufgezeichnet werden. Alternativ können die Drei-Photonen-Bildgebung2 und die adaptive Optik11 die neuronalen Aktivitäten in tiefen Geweben aufzeichnen und das Problem der hohen Krümmung lösen. Die Wiederholungsrate von Drei-Photonen-Lasern und die heterogene Struktur von Schädeln sollten jedoch berücksichtigt werden.
Im Vergleich zu früheren Verfahren 9,12, bei denen mehrere Metallteile zur Stabilisierung des Kopfes verwendet werden, wurde mit dem aktuellen Ansatz eine signifikante Verbesserung erzielt, indem ein einzelnes Stück einer Ω förmigen Kopfstange verwendet wurde. Dieses vereinfachte Design reduziert die Operationszeit um 50 %. Das Protokoll ist auch leichter zu erlernen und kann in der Regel innerhalb von 2 Wochen nach dem Training gemeistert werden. Obwohl die Operationszeit im Vergleich zum vorherigen Protokoll9 stark verkürzt ist, konnten wir keine offensichtlichen Unterschiede in der Überlebensrate oder im Verhalten unter der Kopfstütze beobachten. Zum Beispiel ist die Zeitspanne, in der das Tier unter dem Mikroskop aktiv bleibt, ähnlich (3-8 h, je nach Tier). Die Zeit, die das Tier benötigt, um nach der Operation aus der Narkose aufzuwachen, ist ebenfalls ähnlich (1-2 min). Die transgene Linie10, die in diesem Protokoll verwendet wird, beinhaltet ein einzelnes Transgen, das den Kalziumindikator im Vorderhirn vom Larvenstadium bis zum Erwachsenenalter kodiert, ähnlich der Expressionszeitachse der dreifach transgenen Linie, die in einer früheren Studie12 verwendet wurde.
Derzeit gelten für das Protokoll die folgenden Einschränkungen. Zunächst kann die neuronale Aktivität mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop durch den Schädel in einer Tiefe von bis zu 200 μm von der Gehirnoberfläche abgebildet werden. Die Bildqualität in verschiedenen Tiefen wurde zuvor mit 9,12 quantifiziert. Diese Abbildungstiefen ermöglichen den Zugang zu den dorsalen Vorderhirnarealen Dm, Dc und Dl, schließen aber möglicherweise die ventralen Vorderhirnareale Vv, Vs, Vp und Vd bei erwachsenen Zebrafischen aus. Darüber hinaus ist der optische Zugang zum größten Teil des Mittelhirns und des Hinterhirns durch das Vorhandensein des Kopfstegs und des Zahnzements versperrt. Zusätzliche Modifikationen des Protokolls sind erforderlich, um die Bildgebung in diesen Hirnregionen durchzuführen. Darüber hinaus beschränken wir eine Bildgebungssitzung in der Regel auf 10 Minuten, um eine signifikante Probendrift zu vermeiden. Die mögliche Ursache für die Abdrift ist die Schwächung der Bindung zwischen Schädel und Gewebekleber nach kräftigen Schwanzbewegungen. Wenn längere Aufnahmesitzungen erforderlich sind, kann eine volumetrische Bildgebung mit kleinen axialen Schritten gefolgt von einer 3D-Bildregistrierung durchgeführt werden.
Dieses Kopfstützenprotokoll eröffnet mehrere zukünftige Anwendungen. Erstens können Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung, optogenetische Manipulationen, Elektrophysiologie oder sogar Ultraschallbildgebung in vivo durchgeführt werden. Mit der Drei-Photonen-Bildgebung kann auch die neuronale Aktivität im gesamten Vorderhirn aufgezeichnet werden2. Darüber hinaus kann eine mechanische Vorrichtung konstruiert werden, die die beiden Enden der Kopfstange reversibel greift und loslässt, was eine Längsschnittuntersuchung der neuronalen Aktivität und der Schaltkreismorphologie über Tage hinweg ermöglicht. Schließlich bietet der von uns beschriebene visuelle Display-Aufbau ein horizontales Sichtfeld von 180° auf das Tier. Das Setup kann verwendet werden, um eine immersive Virtual-Reality-Umgebung zu konstruieren, die mit kopfgefesselten Fischeninteragiert 9. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll die Aktivitätsmessung neuronaler Populationen im Pallium von sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Institut für Molekularbiologie, Academia Sinica, und dem National Science and Technology Council, Taiwan, unterstützt. Die Maschinenwerkstatt des Instituts für Physik der Academia Sinica half bei der Herstellung von kundenspezifischen Teilen. Wir danken auch P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) für die Konstruktion des Schnellverschlussmechanismus der Kopfstufe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
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