Summary
Burada, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Yetişkin zebra balığı (Danio rerio) bilişsel işlevleri incelemek için zengin bir davranış repertuarı sergiler. Ayrıca, optik görüntüleme yöntemleriyle beyin bölgelerindeki aktiviteleri ölçmek için kullanılabilecek minyatür bir beyne sahiptirler. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında beyin aktivitesinin kaydedilmesine ilişkin raporlar azdır. Bu çalışma, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme gerçekleştirme prosedürlerini açıklamaktadır. Yetişkin zebra balıklarının başlarını hareket ettirmesini engellemeye yönelik adımlara odaklanıyoruz, bu da beyin aktivitesinin lazerle taranarak görüntülenmesini sağlayan stabilite sağlıyor. Kafası kısıtlanmış hayvanlar, vücut kısımlarını serbestçe hareket ettirebilir ve yardım almadan nefes alabilir. Prosedür, baş desteği ameliyatının süresini kısaltmayı, beyin hareketini en aza indirmeyi ve kaydedilen nöron sayısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Kalsiyum görüntüleme sırasında sürükleyici bir görsel ortam sunmak için bir kurulum da burada açıklanmıştır ve bu, görsel olarak tetiklenen davranışların altında yatan nöral bağıntıları incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Genetik olarak kodlanmış göstergeler veya sentetik boyalarla kalsiyum floresan görüntüleme, insan olmayan primatlar, kemirgenler, kuşlar ve böcekler dahil olmak üzere davranan hayvanlarda nöronal aktiviteyi ölçmek için güçlü bir yöntem olmuştur1. Beyin yüzeyinin yaklaşık 800 μm altına kadar yüzlerce hücrenin aktivitesi, çoklu foton görüntüleme 2,3 kullanılarak aynı anda ölçülebilir. Spesifik hücre tiplerinin aktivitesi, genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonlarda kalsiyum göstergelerinin eksprese edilmesiyle de ölçülebilir. Küçük omurgalı modelleri için görüntüleme yönteminin uygulanması, beyin bölgeleri arasında nöronal hesaplama alanında yeni olanaklar sunmaktadır.
Zebra balığı, sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir model sistemdir. Döllenmeden yaklaşık 6 gün sonra larva zebra balıkları, minyatür beyinleri ve şeffaf gövdeleri nedeniyle kalsiyum görüntüleme için kullanılmıştır4. Yavru zebra balığı (3-4 haftalık) ayrıca sensorimotor yolların altında yatan nöral mekanizmaları incelemek için kullanılır 5,6. Bununla birlikte, ilişkisel öğrenme ve sosyal davranışlar da dahil olmak üzere karmaşık davranışlar için maksimum performans düzeyinedaha büyük yaşta ulaşılır 7,8. Bu nedenle, görüntüleme yöntemlerini kullanarak yetişkin zebra balıklarının beyinlerindeki çoklu bilişsel işlevleri incelemek için güvenilir bir protokol gereklidir. Zebra balığı larvaları ve yavru zebra balıkları in vivo görüntüleme için agaroza gömülebilirken, 2 aylık veya daha büyük yetişkin zebra balıkları bu tür koşullarda hipoksiden muzdariptir ve fiziksel olarak agaroz tarafından sınırlandırılamayacak kadar güçlüdür. Bu nedenle, beyni stabilize etmek ve hayvanın solungaçlardan serbestçe nefes almasını sağlamak için cerrahi bir prosedür gereklidir.
Burada, tek bir baş çubuğunun yeni bir tasarımını içeren bir koltuk başlığı protokolünü açıklıyoruz. 25 dakikalık kısaltılmış ameliyat süresi, önceki yönteme göre iki kat daha hızlıdır9. Ayrıca kayıt odasının (yarı altıgen tank), kafa aşamasının ve iki parçayı birleştirmek için hızlı kilitleme mekanizmasının tasarımını da açıklıyoruz9. Son olarak, görsel olarak tetiklenen beyin aktivitesini ve davranışlarını incelemek için sürükleyici bir görsel uyaran sunma kurulumu da açıklanmaktadır. Genel olarak, burada açıklanan prosedürler, kafası kısıtlanmış yetişkin bir zebra balığında genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarında iki fotonlu kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir ve çeşitli davranışsal paradigmalar sırasında beyin aktivitelerinin araştırılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Academia Sinica Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Araştırma araçlarının ayrıntıları Malzeme Tablosunda bulunabilir.
1. Kayıt odasının hazırlanması
- Yarı altıgen bir tank, bir taban plakası ve bir kafa aşaması hazırlayın (Şekil 1A; Ek Dosyalar 1-3). Baş aşaması, dairesel bir plakaya tutturulmuş iki metal direkten oluşur. Dairesel plaka, taban plakasına kilitlenebilen oluklar içerir. Birbirine kilitlendikten sonra, kafa aşaması ve taban plakası yarı altıgen tankın altına yerleştirilir.
- Yarı altıgen tankı mikroskobun deney platformuna yerleştirin. Platform, çeviri aşamasının sınırına çarpmadan X ve Y yönlerinde hareket edebilmelidir.
- Davranışsal kayıt için 810 nm kızılötesi (IR) ışığı ve kamerayı baş sahneye doğrultun. Kameranın görüş alanının yetişkin bir zebra balığının sığabileceği kadar geniş olduğundan emin olun.
- İki fotonlu lazerin ve görsel uyaranın davranışsal kayda müdahale etmesini önlemek için, kameranın önüne sırasıyla 875 nm kısa geçiren filtre ve 700 nm uzun geçiren filtre kurun.
- Görsel uyaranı sunmak için, yarı altıgen tankın üç duvarının iç tarafına geri projeksiyon filmleri takın (Şekil 1A).
- Üç projektörü tankın üç yüzeyine doğrultun. Üç görüntü, sürekli bir görsel sahne oluşturacak şekilde hizalanmalıdır. Projektör ışıklarının kalsiyum floresan sinyalini kirletmesini önlemek için, her projektörün önüne bir nötr yoğunluk filtresi ve bir kırmızı renk filtresi (600 nm, uzun geçişli) yerleştirin ve fotoçoğaltıcı tüpün (PMT) önüne bir bant geçiren filtre (510/80 nm) yerleştirin.
Şekil 1: Baş desteği ameliyatı için gerekli aletler. (A) Baş aşamasının dairesel plakası ile yarı altıgen tankın içindeki taban plakası arasındaki hızlı kilitleme mekanizması. Özel yapım parçaların bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyaları Ek Dosyalar 1-4'te bulunabilir. (B) Baş desteği için Ω şeklinde kafa çubuğu. (C) Kafa çubuğunu bağlantı yerine konumlandırmak için kullanılan üç eksenli mikro manipülatör. İç: kafa çubuğunun kil içindeki yönü. (D) Ameliyat sırasında balığı tutmak için top. Ek: topun içindeki balıkların oryantasyonu. (E) Balık yükleme modülü ve balığı baş aşamasına yüklemek için kullanılan mikromanipülatör. Ek: modül içindeki balıkların oryantasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Baş desteği ameliyatı
- Ω şeklinde bir kafa çubuğu hazırlayın (Şekil 1B; Ek Dosya 4) zebra balığı baş desteği için. Bunu yapmak için, üç eksenli bir mikromanipülatöre bir parça yağ bazlı modelleme kili takın. Kilin baş çubuğunu tutacak kadar sağlam, ancak baş desteğinden sonra baş çubuğundan ayrılacak kadar yumuşak olduğundan emin olun.
- Kafa çubuğunun bir kolunu kile sokun ve kafa çubuğunu yatay olarak yönlendirin (Şekil 1C). Bu, baş çubuğunun zebra balığına daha sonra bağlanmasının düz olmasını sağlayacaktır.
NOT: Kafa çubuğu titanyumdan (24 mg) veya paslanmaz çelikten (43 mg) yapılabilir ve birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Baş çubuğu malzemesi, yetişkin zebra balıklarının (ağırlık 300-1.000 mg arasında değişir) baş desteği altındaki davranışını etkilemez. - Ameliyat sırasında balık gövdesini yerinde tutmak için içi boş bir tüp olan topu hazırlayın (Şekil 1D).
- Akvaryum suyunda %0.03 ve %0.01 trikain metansülfonat (TMS; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Bu, ameliyat sırasında balığı uyuşturmak ve yatıştırılmış bir durumda tutmak için kullanılacaktır.
- Kafatasındaki bağlantı yerlerinden fazla deri ve suyu çıkarmak için dört doku çubuğu hazırlayın. Her bir çubuğu hazırlamak için, bir kağıt havluyu 3 cm'lik bir kareye kesin ve tüp benzeri bir yapı oluşturmak için köşegeni boyunca katlayın. Tüpün uçlarını ince bir noktaya bükün. Bağlantı yeri çok küçüktür, bu nedenle ince bir nokta, swabın daha hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar.
- Mikromanipülatör için bir balık yükleme modülü hazırlayın (Şekil 1E).
NOT: Modül, dik açılı bir direk kelepçesi ile bir arada tutulan iki çelik direkten oluşur. Bir direk mikromanipülatöre takılırken, diğer direk balığı taşıyan dönen bir direk kelepçesi tutar. Modül, balığı hassas bir kontrolle baş aşamasına yerleştirmek için kullanılır. Dönen direk kelepçesi, balığın eğim açısını değiştirmek için bir adım ayarlayıcı görevi görür. - Akvaryum suyunda% 0.03 TMS ile balıkları uyuşturun. Aşağıdaki adımlar boyunca, akvaryum suyunda% 0.01 TMS'yi her 90 saniyede bir kısa darbelerle ağza vermek için bir şırınga kullanın. Perfüzyondan gelen su akışı solungaç hareketini indüklemelidir. Bu, balığın ameliyat sırasında 40 dakikadan fazla hayatta kalmasını sağlayacaktır.
NOT: Tg [neuroD: GCaMP6f], hem larva hem de yetişkin aşamalarında ön beyindeki kalsiyum göstergesinin geniş ekspresyonu nedeniyle kullanılır10.
NOT: İsteğe bağlı olarak, ameliyatta her iki elin meşgul olduğu dönemlerde ağza sürekli su akışı sağlamak için yerçekimi perfüzyonu kullanın. - Balıkları, balığı topun içinde tutan bir kapsüle (Şekil 2A) sarın.
- Anestezi uygulanmış balığı kuyruğun ucundan başlayarak solungaçtan solungaca yaklaşık 1 mm kaudal olacak şekilde bir parça nemli kağıt mendile sarın. Balığın dokudan kaymasını önlemek için sargının sıkı olduğundan emin olun.
- Balığı kuyruğun ucundan solungaçtan yaklaşık 2 mm kaudal'a kadar örtmek için kağıt mendilin etrafına uzunlamasına yarıklı (örneğin, orta büyüklükte ısıyla daralan bir boru) yumuşak bir plastik boru sarın. Boru, balığın vücudunun ameliyat boyunca düz kalmasını sağlar.
- Borunun etrafına kabaca topun çapına benzer bir çapa kadar bir kağıt havlu sarın.
- Plastik transfer pipetinin ampulünden kesilmiş yumuşak bir plastik tüpü kağıt havlunun etrafına sarın. Bu, kapsülün topa sorunsuz bir şekilde yüklenebilmesini sağlar.
- Balıkları topun içine yükleyin.
- Bağlanma yerlerini kaplayan deriyi, kafatasının beyincik rostrolateralinde ve solungaçların üzerinde iki üçgen bölgesini çıkarmak için bir neşter kullanın (Şekil 2B), ardından bağlanma bölgeleri arasındaki bölgeyi kaplayan cildi çıkarın. Bağlanma bölgelerini kurutmak ve kalan cildi temizlemek için doku çubukları kullanın.
- Derinin çıkarılması sırasında başı desteklemek için ayarlanabilir bir platform kullanın, ancak operasyon sırasında göz yaralanmasını önlemek için platform gözlere temas etmemelidir.
NOT: Bağlanma bölgelerindeki derinin tamamen çıkarılması, görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltmada çok önemlidir.
- Derinin çıkarılması sırasında başı desteklemek için ayarlanabilir bir platform kullanın, ancak operasyon sırasında göz yaralanmasını önlemek için platform gözlere temas etmemelidir.
- 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak her bağlantı bölgesinin ortasına bir damla doku yapıştırıcısı (Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın.
NOT: Doku yapıştırıcısı bağlantı yerlerini kaplar ve çabuk kurur. Doku yapıştırıcısı, kafatası ile kafa çubuğunu yapıştırmak için kullanılan diş çimentosu arasında bir bağlanma arayüzü sağlar ve solungaçlardan gelen suyun bağlantı bölgesine ulaşmasını önler. - Balık gövdesini dik konuma getirin ve baş çubuğu yapıştırmaya hazırlanırken baş çubuğunu biraz yukarıya ve bağlantı yerlerine kaudal olarak yerleştirin.
- Diş çimentosu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve kafa çubuğunu kafatasına yapıştırmak için hemen kullanın (Şekil 2C). İşlem zamana duyarlıdır ve 45 saniye içinde yapılmalıdır.
- Küçük bir kaşık polimeri dört damla hızlı monomer ve bir damla katalizör V ile karıştırın. Karışımı 15 saniye boyunca eşit şekilde karıştırın.
- Karışımı bağlantı bölgelerine ve bölgeler arasındaki bölgeye uygulamak için bir mikropipet ve 10 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Solungaçları ve gözleri kapatmaktan kaçının.
- Mikromanipülatörü kullanarak baş çubuğunu çimentoya hafifçe bastırın. Baş çubuğunu kalan çimento ile örtün.
- Diş çimentosunun kürlenmesi için 12 dakika bekleyin. Çimento ile su temasından kaçının.
- Kalsiyum görüntüleme için ön beyne optik erişimi iyileştirmek için, telensefalonun üzerindeki cildi çıkarın. Derinin çıkarılması, bir neşter kullanılarak beş kesi ile 3 dakika içinde yapılabilir (Şekil 2D). Kafataslarının yüzeyine yapışan lipit damlacıklarının çıkarıldığından emin olun.
- Sertleştikten sonra kili baş çubuğundan çıkarın.
- Tüm kapsülü toptan mikromanipülatörün balık yükleme modülündeki zift ayarlayıcıya aktarın.
- Balığı konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın. Baş çubuğu, baş aşamasının metal direklerinin üzerine yerleştirilmelidir. İki fotonlu görüntüleme sırasında ön beynin yüzeyinin optik düzleme daha iyi hizalanabilmesi için balığın eğim açısını hafifçe artırın.
- Kafa çubuğunu ultraviyole (UV) ile kürlenebilen yapıştırıcı ile metal direklere yapıştırın. Kürlenme için 15 sn UV'ye maruz kalma yeterlidir.
- Balığı kapsülden dışarı çekin ve baş aşamasını yarı altıgen tankın içindeki taban plakasına kilitleyin.
- Hayvanı akvaryum suyuna daldırın. Balık 1-2 dakika içinde nefes almaya başlamalı ve anesteziden kurtulmalıdır.
NOT: İsteğe bağlı olarak, ağza tatlı su vermek için şırınga perfüzyonu kullanın.
Şekil 2: Baş desteği ameliyatı sırasındaki önemli adımlar . (A) Topun içindeki kapsülün bileşimi. (B) Kafatasındaki bağlanma yerleri (kırmızı). Kırmızı oklar kan damarı bölgelerini belirtir. (C) Üst: balık kafatasına bağlı baş çubuğu. Altta: baş sahneye yüklenen balık. (D) Ön beynin üzerindeki deriyi çıkarmak için gerekli kesikler. Sayılar kesme sırasını gösterir. Hayvanın kanamasını önlemek için işaretli bölgede (ok ucu) derinin çıkarılmasından kaçının. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. İki fotonlu görüntüleme
- Lazeri açın ve gücün dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Örnekte dalga boyunu 920 nm'ye ve gücü yaklaşık 50 mW'a ayarlayın.
NOT: Rezonans tarayıcı tarafından kontrol edilen lazer ışını, tarama yolunun geri dönüş noktalarında yavaşça hareket eder. Doku hasarını önlemek için, geri dönüş noktalarında lazer gücünü azaltmak için bir Pockels hücresi kullanılır. - Kafası sabitlenmiş zebra balığını içeren kayıt odasını deney platformuna yerleştirin (Şekil 3A). Platform, çeviri aşamasının sınırına çarpmadan X ve Y yönlerinde hareket edebilmelidir.
- Objektif lensi ön beyin yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Objektif mercek, göz bebeğinin ön kenarına yönelik olmalıdır (Şekil 3B).
- Lazer deklanşörünü açın ve PMT'yi etkinleştirin. Floresan görüntüsünde dorsal ön beyin ortaya çıkana kadar objektif lensi (~1 mm) kademeli olarak yükseltin (Şekil 3C).
- Kaydedilen nöron sayısını artırmak için, birden fazla derinlikte (15 μm aralıklarla altı görüntü düzlemi) görüntü elde etmek için bir piezo aktüatör kullanın. Bu, kare hızı pahasına veri verimini artıracaktır. Piezo aktüatörü kontrol etmek için hızlı Z ekseni taramasını etkinleştirin (tek tip mod, dilim sayısı = 6, adım boyutu = 15 μm, dalga formu = testere dişi, geri dönüş süresi = 4 ms, aktüatör gecikmesi = 8 ms).
- Davranış kaydı için, tankın her iki tarafındaki 810 nm kızılötesi (IR) ışıkları açın. Kamerada net bir şekilde görülebilmesi gereken tüm gövdeyi aydınlatmak için açıyı ayarlayın.
- Projektörleri açın.
- Verileri kaydetmeye başlayın.
Şekil 3: Kalsiyum görüntüleme, davranış kaydı ve görsel uyaran gösterimi gerçekleştirmek için kurulum . (A) Üç projektör, yarı altıgen tankın duvarlarına görsel bir uyaran sunar. Zebra balığının vücudunu aydınlatmak için yan taraftaki IR ışıkları kullanılır. (B) Objektif merceğin konumlandırılması. Sol: önden görünüm. Sağ: yandan görünüm. 16x objektif mercek ile hedeflenen beyin bölgesi arasındaki mesafe yaklaşık 2,5 mm'dir. (C) Örnek iki fotonlu görüntü. Solda: Tg[neuroD:GCaMP6f] cinsinden tüm dorsal ön beynin maksimum projeksiyonu. Sağda: birden fazla beyin bölgesindeki nöronları ortaya çıkarmak için yakınlaştırılmış görüntü. İçindekiler: farklı bir beyin bölgesinden daha yüksek bir büyütme. Görüntüler, 5 Hz'de kaydedilen 10 saniyelik verinin ortalamasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol iki bölümden oluşur: baş desteği cerrahisi ve ön beyindeki nöronal aktivitelerin iki fotonlu kalsiyum görüntülemesi. Ameliyatın başarısı, hayvanın hayatta kalması ve baş desteğinin stabilitesi ile tanımlanır. Hayatta kalma oranı, ameliyat sırasında ağızdan% 0.01 TMS çözeltisinin sık sık perfüzyonu ile büyük ölçüde iyileştirilebilir. Balıklar anesteziden kurtulmalı ve akvaryum suyuna daldırıldıktan sonra 1-2 dakika içinde aktif olarak nefes almalıdır. İki fotonlu kalsiyum görüntüleme, dorsal ön beyindeki bireysel nöronların beyin yüzeyinden 200 μm'ye kadar bir derinlikte sağlam kafatasları (~ 40 μm kalınlığında) aktivite kaydını sağlar. Bu görüntüleme aralığı, medial bölge (Dm), merkezi bölgenin rostral kısmı (rDc), merkezi bölgenin kaudal kısmı (cDc) ve lateral bölge (Dl) dahil olmak üzere dorsal telensefalonun (D) birden fazla bölgesini kapsar. Birlikte yetişkin zebra balıklarında telensefalonun %30'unu oluştururlar (Şekil 3C). Piezo aktüatörü kullanan hacimsel görüntüleme ile, tipik olarak Dl veya cDc'de 150 nöronun aktivitesini ve Tg[neuroD:GCaMP6f]10'da Dm ve rDc'de 300 nöronun aktivitesini kaydederiz. Beyin görüntüleme sırasında eş zamanlı davranışsal kayıt yapılır, bu da motor çıktıların nöronal bağıntılarının tanımlanmasını sağlar (Şekil 4).
İki fotonlu görüntüleme sırasında, kuyruk hareketleri görüntüde görünür bir hareket artefaktına neden olmamalıdır. Aşırı mücadele sırasında küçük (<1 μm) ve geçici bir hareket gözlemlenebilir. Bu hareketler tipik olarak geri dönüşümlüdür, bu nedenle görüntülemeye daha sonra devam edilebilir. Ayrıca yanal ve eksenel yönlerde yavaş bir kayma (<1 μm min-1)gözlemliyoruz 9. Eksenel örnek kayması nedeniyle nöron kaybını önlemek için, görüntüleme seansımızı tipik olarak 10 dakika ile sınırlandırırız. Kalsiyum indikatörünün fotoağartması, belirtilen lazer gücü altında 10 dakikalık bir görüntüleme seansından sonra gözlenmemelidir.
Şekil 4: Yetişkin zebra balıklarında davranış izleme ve sinirsel aktivite modeli. (A) Davranışın kamera kaydının örnek bir çerçevesi (ventral görünüm). (B) Ön beyin nöronlarının aktivitesi (ΔF/F, siyah) ve kuyruk hareketi yoğunluğu (mavi). Kuyruk hareketinin yoğunluğu, ardışık video kareleri arasındaki mutlak piksel bazında farkın ortalaması ile ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Taban plakasının tasarımı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Dairesel plakanın tasarımı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 3: Yarı altıgen tankın tasarımı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 4: Başlık çubuğunun tasarımı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Sorun giderme ayrıntıları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, iki fotonlu kalsiyum görüntüleme için yetişkin zebra balığının kafasını dizginlemek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Lazer tarama görüntüleme için yeterince stabil bir koltuk başlığı elde etmek için iki kritik adım vardır. İlk olarak, kafa çubuğu kafataslarının belirli bağlantı yerlerine yapıştırılmalıdır. Kafatasının diğer kısımları genellikle mekanik stabilite sağlamak için çok incedir ve hatta güçlü vücut hareketleri sırasında kırılabilir. İkinci olarak, bağlanma yerlerinin üzerindeki deri iyice çıkarılmalıdır. Kalan su da iyice kurutulmalıdır. Bu, kafatasının doku yapıştırıcısına sıkıca bağlanmasını sağlar. Olası sorunları, nedenlerini ve çözümlerini listeleyen bir tablo verilmiştir (Ek Tablo 1).
Zebra balığı ön beyninin kavisli geometrisi nedeniyle, uyarma ışını ve ortaya çıkan emisyon, görüntüleme düzlemi boyunca beyin dokusunun farklı kalınlıkları boyunca hareket eder. Bu nedenle, optik bir kesit içinde görüntülenen nöronların floresansı, nöronun beyin sınırından uzaklığına bağlı olarak değişir. Bu, bir kayıt oturumunda düşük veri verimine yol açar. Sorun, Dl ve cDc'yi görüntülerken özellikle şiddetlidir (Şekil 3C). Burada, kare hızını tehlikeye atan ancak kaydedilen nöron sayısını artıran çoklu eksenel konumlarda kayıt yapmak için bir piezo aktüatör kullanıyoruz. Daha da önemlisi, birden fazla eksenel pozisyondaki nöronal aktiviteler tek bir davranışsal seansta kaydedildiğinden, veriler, birden fazla davranışsal seanstan kaydedilen aktivite verilerine kıyasla daha yüksek bir istatistiksel güce sahiptir. Alternatif olarak, üç fotonlu görüntüleme2 ve uyarlanabilir optik11 , derin dokulardaki nöronal aktiviteleri kaydedebilir ve yüksek eğrilik problemini gevşetebilir. Bununla birlikte, üç fotonlu lazerlerin tekrarlama oranı ve kafataslarının heterojen yapısı dikkate alınmalıdır.
Kafayı stabilize etmek için birden fazla metal parça kullanan önceki yöntemlere 9,12 kıyasla, mevcut yaklaşım, Ω şekilli bir kafa çubuğunun tek bir parçasını kullanarak önemli bir gelişme sağlamıştır. Bu basitleştirilmiş tasarım, ameliyat süresini %50 oranında azaltır. Protokolün öğrenilmesi de daha kolaydır ve genellikle eğitimden sonraki 2 hafta içinde ustalaşılabilir. Ameliyat süresi önceki protokolegöre büyük ölçüde azalmış olmasına rağmen 9, sağkalım oranı ve baş desteği altındaki davranışlarda belirgin farklılıklar gözlemlemedik. Örneğin, hayvanın mikroskop altında aktif kaldığı süre benzerdir (hayvana bağlı olarak 3-8 saat). Ameliyattan sonra hayvanın anesteziden uyanması için gereken süre de benzerdir (1-2 dakika). Bu protokolde kullanılan transgenik hat10, önceki bir çalışmada12 kullanılan üçlü transgenik hattın ekspresyon zaman çizelgesine benzer şekilde, ön beyindeki kalsiyum göstergesini larva aşamasından yetişkinliğe kadar kodlayan tek bir transgen içerir.
Şu anda, protokol aşağıdaki sınırlamalara sahiptir. İlk olarak, nöronal aktivite, iki fotonlu bir mikroskop kullanılarak beyin yüzeyinden 200 μm'ye kadar bir derinlikte kafatası boyunca görüntülenebilir. Çeşitli derinliklerdeki görüntü kalitesi daha önce 9,12 olarak ölçülmüştü. Bu görüntüleme derinlikleri, dorsal ön beyin alanları Dm, Dc ve Dl'ye erişime izin verir, ancak yetişkin zebra balıklarında ventral ön beyin alanları Vv, Vs, Vp ve Vd'yi potansiyel olarak hariç tutar. Ek olarak, orta beynin ve arka beynin çoğunluğuna optik erişim, kafa çubuğu ve diş çimentosunun varlığı ile engellenir. Bu beyin bölgelerinde görüntüleme yapmak için protokolde ek değişiklikler yapılması gerekir. Ayrıca, önemli numune kaymasını önlemek için genellikle bir görüntüleme seansını 10 dakika ile sınırlandırırız. Sürüklenmenin potansiyel nedeni, kuvvetli kuyruk hareketlerinden sonra kafatası ile doku yapıştırıcısı arasındaki bağın zayıflamasıdır. Daha uzun kayıt seanslarına ihtiyaç duyulursa, küçük eksenel adımlarla hacimsel görüntüleme ve ardından 3D görüntü kaydı yapılabilir.
Bu koltuk başlığı protokolü, gelecekteki birkaç uygulamanın önünü açar. İlk olarak, iki fotonlu kalsiyum görüntüleme, optogenetik manipülasyonlar, elektrofizyoloji ve hatta ultrason görüntüleme in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Üç fotonlu görüntüleme ile, tüm ön beyindeki nöronal aktivite de kaydedilebilir2. Ek olarak, kafa çubuğunun iki ucunu tersine çevrilebilir bir şekilde tutup serbest bırakmak için mekanik bir cihaz yapılabilir, bu da günler boyunca nöral aktivite ve devre morfolojisinin uzunlamasına araştırılmasını sağlar. Son olarak, tarif ettiğimiz görsel ekran kurulumu, hayvana 180° yatay görüş alanı sağlar. Kurulum, kafası kısıtlanmış balıklarla etkileşime giren sürükleyici bir sanal gerçeklik ortamı oluşturmak için kullanılabilir9. Genel olarak, bu protokol, davranan yetişkin zebra balığının palyumu boyunca nöronal popülasyonların aktivite ölçümünü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sinica Akademisi Moleküler Biyoloji Enstitüsü ve Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi tarafından desteklenmiştir. Fizik Enstitüsü'ndeki Makine Atölyesi, Academia Sinica, özel tasarım parçaların üretilmesine yardımcı oldu. Ayrıca P. Argast'a (Friedrich Miescher Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Basel, İsviçre) kafa aşamasının hızlı kilit mekanizmasının tasarımı için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P.
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
